关键词： 肺淋巴管平滑肌瘤病；平滑肌增生

关键词： 肺淋巴管平滑肌瘤病；平滑肌增生 先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质钙调素基因mRNA的研究 中华神经科杂志 2000年第4期第33卷 论著 作者:陈贵海 王明丽 袁中玉 单位:陈贵海(230032 合肥，安徽医科大学病原生物学教研室);王明丽(230032 合肥， 安徽医科大学病原生物学教研室);袁中玉(230032 合肥，安徽医科大学病原生物学教研 室) 关键词: 巨细胞病毒感染;大脑皮质;钙调蛋白;RNA，信使 【摘要】 目的 研究先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染致脑损害后钙调素(CaM)基因 染所致脑损害的机制。 选用10周龄Balb/c小鼠32mRNA的改变，探讨先天性HCMV感 只，雌雄配对合笼，合笼前雌雄鼠腹腔内均注射HCMV，分为1.00 ml、 0.50 ml和0.25 ml 各4笼，同时设4笼作为正常对照组(腹腔内注射1.0 ml RPMI 1640培养液)。剖腹取21 d胎鼠大脑皮质，分别用逆转录聚合酶链反应技术检测CaM mRNA的相对含量，用原位杂交 方法检测大脑皮质细胞内相应mRNA及其定位。结果 DNA浓度测定结果明，1.00 ml组与 0.50 ml组胎鼠逆转录聚合酶链反应产物相对浓度明显高于0.25 ml组及对照组， 前两组 比较亦有明显差异。凝胶电泳结果显示，对照组与0.25 ml组胎鼠未见阳性条带，而1.00 ml 组胎鼠特异性条带信号强于0.50 ml胎鼠组，仅略低于同组母鼠。原位杂交结果显示，CaM mRNA 不但出现在1.00 ml组胎鼠大脑皮质大神经元胞核及胞质内，在中、小神经元及胶质 细胞的胞核及胞质亦有高密度表达，阳性细胞的突起中亦有弱信号存在。结论 先天性HCMV 感染胎鼠大脑皮质内CaM mRNA表达量明显增加，神经元及胶质细胞均有表达，并与感染的 病毒剂量有关。 Changes of calmodulin mRNA in the cerebral cortex of fetal mice infected congenitally by human cytomegalovirus CHEN Guihai WANG Mingli, YUAN Zhongyu Department of Pathogenic Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 【Abstract】 Objective To obtain the evidence of the changes of calmodulin gene expression in the brain of congenital infection by human cytomegalovirus (HCMV).Methods 32 Balb/c mice aged 10 weeks were chosen. The model of congenital central nervous system infection was established by injecting abdominally 1.00 ml, 0.50 ml, 0.25 ml HCMV into female and male mice respectively, then the mice were matched in a cage. The controls were injected abdominally with 1.00 ml RPMI 1640 Medium. The cerebral cortexes, which were collected the 21 days fetal mice removed from the uteri, were studied using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ hybridization histochemistry. The relative concentrations of RT-PCR products were calculated by their value of OD detected with type UV-754 260 spectroradiometer, and the gel electrophoresis was done for them.Results The concentrations of RT-PCR products derived from 1.00 ml and 0.50 ml groups were markedly higher than those in 0.25 ml group and control group, however there was obvious difference in between 1.00 ml and 0.50 ml group. The electrophoresis showed that there were not any positive bands in 0.25 ml group and the controls, whereas the signal of specific positive bands in 1.00 ml group was stronger than that in 0.50 ml group and slightly weaker than that in the mother group. In situ hybridization demonstrated that the higher density of calmodulin mRNA positive signals existed not only in the cytoplasm and nucleus of large neurons but also in the cytoplasm and nucleus of moderate or small neurons and gliocytes of cerebral cortex in 1.00 ml fetal mice, and that the cell processes were weakly stained. There were no obviousy positive signals in 0.50 ml, 0.25 ml group, and control group and in 1.00 ml negative control group without probes, respectively. Conclusion Congenital HCMV infection resulted in marked mRNA increase of calmodulin gene in cerebral cortex of fetal mice, which showed the positive association between various titers and gene expression, and the over-expression of calmodulin mRNA existed in not neurons and also in gliocytes. 【Key words】 Cytomegalovirus infection; Cerebral cortex; Calmodulin; RNA, messenger 疱疹病毒β亚科病毒。尽管孕妇 人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是 ,1,通常呈隐性感染，但HCMV能通过胎盘传播给胎儿，是病毒性宫内感染的最常见原因，可 对胎儿产生严重后果，导致流产、死胎及新生儿巨细胞包涵体病。明显的中枢神经系统缺陷 症状是受感染后出生婴儿的常见表现。但迄今为止，对HCMV先天性感染导致中枢神经系统 损害的机制尚不清楚。 ,2, 钙作为细胞内第二信使有广泛的生物学功能，成为多种细胞信息传递途径的枢纽。 2+2+Ca通过与钙调素(calmodulin, CaM)结合成活化的Ca-CaM复合物，对多种酶和蛋白起作 2+2+用，调节着大量的细胞活动，成为Ca信使分子作用的主要途径。Ca-CaM系统及CaM基因 ,3-5,的表达与中枢神经系统的生理活动、生长发育、组织分化及病理过程关系密切。 ,6, HCMV所致脑炎有广泛脑组织钙化的病理改变，表明HCMV感染中枢神经系统时伴有 钙系统紊乱。HCMV感染其他细胞可引起受感染细胞钙内流明显增加，且内流的速度与病毒 ,7,感染复数及感染后的时间有关。我们在建立小鼠先天性感染HCMV模型的基础上，对脑细 2+胞内控制与Ca作用功能相连的CaM的基因表达进行了探讨。现将结果报道如下。 材料和方法 一、主要试剂 所用主要化学及分子生物学试剂分别由Promega公司、Sigma公司、Beohringer Mannheim公司和华美生物公司提供。 二、HCMV先天性感染胎鼠模型的建立 1.病毒:将液氮中冻存的HCMV AD169在人成纤维细胞上传7,8代以增强毒力。按Gibson,8,的终点稀释法，以在24 h出现病毒致细胞病变效应达(+++,++++)的病毒悬液，在人成纤维细胞上滴定半数组织培养感染剂量(TCID)，以6.0 log TCID/ml的病毒作为实验5050 用毒种。 2.模型制作:健康Balb/c小鼠(SPF级，10周龄，体重25 g左右)，雌雄鼠共32只，按一雌一雄随机配对分笼，雌雄鼠腹腔内均注射等剂量HCMV悬液，其中1.00 ml 组、0.50 ml组及0.25 ml组各4笼，同时设4笼对照(腹腔内注射1.00 ml RPMI 1640培养液)。模型制成后饲养于本室专用感染动物橱内，次日晨起，以涂片染色法连续检测母鼠阴道内精子，以判定受孕时间。受孕21 d时剖腹取胎鼠。 3.病理学检查:取胎鼠及母鼠大脑皮质组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木素-伊红染色，光镜观察。 4.病毒分离:无菌操作下取胎鼠双侧大脑皮质，用细胞维持液10倍稀释，制备成脑细胞悬液，低速(4 000 r/min)离心，取上清:(1)直接接种0.2 ml至人成纤维细胞单层上;(2)经56? 30 min灭活后再接种，对照者接种正常胎鼠脑组织细胞悬液上清，37? ，加维持液。置37?培养(湿度100%，5%二氧化碳)，3,4 d换液1次，连续观吸附1 h 察细胞病变效应1,8周。如培养4周仍未出现细胞病变效应则盲传3次，仍无细胞病变效应者为阴性。出现HCMV特征的细胞病变效应者， 取单层细胞用聚合酶链反应(PCR)检测HCMV-DNA。 三、 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 检测胎鼠大脑皮质CaM mRNA ,9,,3, 1.引物的与合成:按照已认同的设计原则， 在小鼠脑CaM基因I cDNA序列中，选取CaM mRNA编码区域序列设计引物，由中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室用DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化。序列分别为:上游引物 5′CTGACTGAAGAACAGATTGC- TG3′(60,81位)，下游引物5′CTTCATAGTTGACCT- GTCCGTC3′(447,468位)，终产物长度为387 bp。内对照β-珠蛋白DNA引物序列参见 ,9,Dieffenbach等方法，终产物长度为268 bp。 2.总RNA的提取: 取100 mg脑组织，按RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒进行总RNA的提取，得到的RNA沉淀用盐酸三羟基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液(pH 8.0)20 μl重悬，-20?保存备用。 3.反转录: 按RT-PCR酶混合物试剂盒进行。CaM mRNA下游引物浓度为0.3 mol/L，总RNA 10 μl，所得到的cDNA直接进行下一步PCR扩增。 ,9, 4.PCR: 参照Dieffenbach等的方法，在反应体系中加入CaM cDNA模板与相应上下游引物，并加内标模板及相应上下游引物。94?预变性5 min，然后94? 45 s、55? 45 s和72? 1 min，共35个周期，72?延伸7 min，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时用UV-754紫外分光光度计测定260 nm处的吸光度，计算DNA浓度(g/L)。 四、原位杂交检测胎鼠大脑皮质CaM mRNA 探针序列为5′CTCGTTGATCATATCCTGCAGTTC- AGCCTCTG3′(181,212位)，余同RT-PCR。冰上无菌下取胎鼠及其母鼠脑组织，在预涂粘附剂并经180?干烤30 min的载玻片上压印，冷丙酮中固定10 min，空气干燥，脑压印片-20?保存备用。阴性对照为正常同龄胎鼠与无探针1.00 ml HCMV组胎鼠脑印片, 阳性对照为1.00 ml HCMV组母鼠脑印片。具体操作按Beohringer Mannheim公司试剂盒说明书进行并稍作改良，蛋白酶K 浓度为2 mg/L，探针经地高辛标记，浓度为1 mg/ L，杂交时37?湿盒中过夜。 五、统计学处理 用统计软件进行方差分析。 结果 一、 模型制作 1.胎鼠脑组织病毒分离结果:1.00 ml与0.50 ml HCMV组胎鼠脑组织细胞悬液上清接种后产生明显细胞病变效应 (图1)，对照组及56?灭活组为阴性(图2)。对阳性者进行HCMV-DNA检测，结果亦为阳性。 2.病理检查结果: 0.50 ml及1.00 ml组母鼠脑组织内部分血管周围炎细胞呈袖套状浸润;部分神经元尼氏小体溶解，见少许卫星现象及嗜神经元现象(图3)，并可见脑组织小 灶性坏死、胶质细胞弥漫性增生及胶质小结形成;脑组织内可见散在的杆状细胞及格子细胞，神经细胞核内可见嗜碱嗜酸性包涵体。以上改变1.00 ml组 较0.50 ml组明显。 0.50 ml及1.00 ml组胎鼠蛛网膜下腔血管轻度充血，无明显炎细胞浸润;大脑皮质层除分子层外，其他各层结构不清(与同期发育的正常胎鼠脑切片比较);部分神经元中尼氏小体消失;脑组织小胶质细胞增多，见散在的杆状细胞及胶质瘢痕形成(图4);脑组织内血管充血，血管周围未见明显的炎性细胞浸润;可见散在的单个神经细胞死亡，坏死细胞周围无炎性细胞;神经元及胶质细胞核核内可见嗜碱性包涵体(图5)。1.00 ml组鼠大脑皮质层次结构分化极差，且见个别含核内包涵体的巨细胞。 ,10, 以上改变在0.25 ml组不明显。其余病理改变与王明丽等报道的结果相同。 二、受感染胎鼠大脑皮质CaM mRNA的定性与定量分析 1(原位杂交检测结果:1.00 ml HCMV组胎鼠大脑皮质的神经元与胶质细胞均有强阳性杂交信号(为深蓝色颗粒)，呈核质型分布，各种细胞的突起内也有弱阳性杂交信号(图6,8)。无探针1.00 ml组胎鼠与平行对照组胎鼠神经元内杂交信号呈阴性。1.00 ml组母鼠大脑皮质阳性对照组也可见密集阳性杂交信号。 2(CaM mRNA RT-PCR检测结果:1.00 ml和0.50 ml组均见到明显的特异性扩增条带，但后者较前者弱，而0.25 ml组及对照组未见明显的特异性扩增条带(图9)。RT-PCR产物的DNA浓度(反应条件相同时在一定程度上可反映原组织中CaM mRNA的量):1.00 ml、 0.50 ml、0.25 ml及对照组平均浓度(g/ L)分别为0.27?0.02(n=8)、0.16?0.02(n=6)、0.02?0.01(n=7)和0.01?0.01(n=8)，其中1.00 ml组与0.50 ml组比较，差异有显著意义(P,0.01)，两者分别与0.25 ml组和对照组比较，差异亦有显著意义(P均,0.01)，而后两者比较，差异无显著意义(P,0.05)，这与凝胶电泳的结果一致。 ,5分别为对照、0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml组胎鼠，6M为分子量，1为空白对照，2 为1.00 ml组母鼠 9 大脑皮质CaM mRNA RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果 讨论 ,6,,10, AD169株可致实验动物脑组织感染, 母鼠妊娠期感染的HCMV可通过胎盘传给子鼠。 ,10,尽管建立先天性HCMV感染动物模型的实验室不多，但根据王明丽等的工作及本研究显示的病理改变与胎鼠大脑皮质HCMV分离培养结果，本次先天性感染HCMV胎鼠模型制作是成功的。我们按CaM mRNA的cDNA序列设计的引物在设有β-珠蛋白DNA内标的多重PCR反应体系中获得了满意效果， 预设长度为387 bp 的核酸片段得到了特异性扩增。设计用于原位杂交的CaM mRNA寡核苷酸探针的反应性与特异性也较好。用脑压印片进行原位杂交可获得完整的细胞结构，尤其是细胞突起得以保留，对研究这些部位不同CaM mRNA的分布极为有用，但不能了解脑组织结构层次信号改变。 ,11, 3个CaM基因(CaM?、CaM?及CaM?)在鼠脑组织中都有高水平表达，所产生的mRNA计有1.0、1.4、1.7(1.8)、2.3(1.9)和4.0(4.1)kb 5种, 但它们编码出的CaM氨基酸序列 ,3,11,完全相同。原位杂交结果显示，CaM mRNA通常见于中枢神经系统大投射神经元，小的 ,3,中间神经元很少。 ,4, 已经发现多种刺激可致中枢神经系统CaM及其相关的mRNA增加。我们通过编码区完全相同的CaM?1.8 kb与4.0 kb mRNA 寡核苷酸探针,对母鼠感染1.00 ml 、0.50 ml、0.25 ml HCMV后的临产胎鼠脑压印片进行了原位杂交, 在1.00 ml组获得了强阳性杂交信号。RT-PCR法检测mRNA，也显示1.00 ml与0.50 ml组先天性感染HCMV临产胎鼠大脑皮质CaM?mRNA含量增高，与对照组比较，差异明显，并显示1.00 ml HCMV组,0.50 ml组,0.25 ml组，呈量效关系。原位杂交结果表明，先天性感染HCMV临产胎鼠大脑皮质CaM mRNA不但含量增高，分布也发生了改变。CaM mRNA阳性杂交信号除大神经元外还见于中、小神经元。尽管正常时CaM mRNA 仅特异地见于神经元，但在本研究中胶质细胞内也呈强阳性。这 ,10,种分布改变与HCMV对神经元及胶质细胞均有侵袭力的结果一致。鉴于方法敏感性的不同，虽然原位杂交在0.50 ml组未检测到阳性信号，但使用可检测低拷贝量mRNA的RT-PCR法检测产物，可见明显的特异性电泳条带，且扩增产物浓度明显高于对照组，表明0.50 ml组也有较低水平的过转录,这与病理检查结果一致。病理检查、原位杂交和RT-PCR法检测均未发现0.25 ml组有明显改变，表明HCMV通过血-胎盘屏障造成先天性感染有一定的毒力阈。 先天性感染HCMV临产胎鼠大脑皮质CaM mRNA增加的机制不清楚。 由于CaM作用的复杂性(不同时期、不同状态和不同离子浓度作用不同)，CaM mRNA表达增加后，对原发性损害是有促进、放大作用还是有限制或保护作用尚不得而知，也许有双重作用，即在疾病的不同阶段所起作用不同。 图1 1.00ml组人巨细胞病毒细胞病变效应明显 未染色×100 图2 对照组人巨细胞病毒细胞病变效应阴性未染色×100 图3 1.00ml组母鼠嗜神经元现象 HE×1000 图4 1.00ml组神经元消失、胶质瘢痕形成及杆状细胞增多 HE×400 图5、6 1.00ml组脑细胞核内嗜碱性包涵体 HE×1000 图7 同图5 图8 100ml组神经元与多种胶质细胞均有强阳性信号，核浆型分布，细胞突起内弱阳性 信号 HE×400 基金项目:安徽省科学委员会自然科学基金资助项目(95-医-18) 通信作者:陈贵海，230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院神经内科 参考文献 1，Ruellan-Eugene G, Barjot P, Campet M, et al. 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