[doc] 反相高效液相色谱法测定厌氧菌有机酸代谢产物

[doc] 反相高效液相色谱法测定厌氧菌有机酸代谢产物 反相高效液相色谱法测定厌氧菌有机酸代 谢产物 中国微生态学杂志2007年12月第19卷第6期527 文章编号:1005-376X(2007)06-0527-02 反相高效液相色谱法测定厌氧菌有机酸代谢产物 【论着】 王忠永,郑佳音,周铁丽,黄小侠,刘佳明 (1,温州医学院附属一院实验诊断中心,浙江温州325000;2.温州医学院环境与公共卫生学院,浙江温州 325035) 【摘要】建立反相高效液相色谱测定厌氧菌代谢发酵有机酸产物(乙酸,乳酸)的方法并用于测定乳酸菌代 谢发酵产物中的含量.反相高效液相方法是一种简单,准确,灵敏的方法,可用于同时定量测定厌氧菌的有机酸代 谢产物. 【关键词】反相高效液相色谱;厌氧菌;有机酸 【中图分类号】Q67【文献标识码】A Simultaneousdeterminationoforganicacidsinthemetabolicproductionofa naerobic bacteriabyReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatography WANGZhong—yong,ZHENGJia—yin,ZHOUTie—li,HUANGXiao—x ia,LIUJia—ming (1.TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China) 【Abstract】 ToestablishamethodtodetectorganicacidsinthemetabolicproductionofanaerobicbacteriabyRe— versedPhaseHighPerformanceLiquidChromatography(RP—HPLC).We usedittodeterminetheconcentrationofacetic acidandlacticacidinthemetabolicproductionofLactobacillus.Itwassuggestedtobeasimple,sensitive,reliablemethod andwecanuseitsimultaneouslytodeterminateorganicacidsinthemetabolicproductionofanaerobicbacteria. 【Keywords】 Reversedphasehighperformanceliquidchromatography;Anaerobicbacteria;Organicacid 人体内的一些厌氧菌诸如乳酸菌,双歧杆菌是维 持人体阴道,肠道等的主要正常菌群,是维护其微生 态平衡的重要有益菌.其发酵产生的短链有机酸如 乙酸,乳酸等对维持微生态环境的完整性和功能,免 疫系统调节等都非常关键.对有机酸的测定研究,主 要有比色法,荧光法,薄层色谱法,气相色谱等方法, 但常需预分离或衍生等烦琐的前处理….我们拟建 立测定厌氧菌代谢发酵有机酸产物的反相高效液相 色谱方法并将之用于乳酸菌代谢产物中乙酸,乳酸的 测定. 1与方法 1.1仪器及试剂 1.1.1仪器美国Waters色谱工作站:515泵,2487 紫外检测器,717plus自动进样器,Millennium32色谱 处理系统工作站. 1.1.2试剂磷酸二氢钾,甲醇,磷酸试剂均为国产 色谱纯或分析纯试剂,所用的水均为Millipore公司的 Milli—Q纯水器所制.. 1.1.3标准品乙酸,乳酸试剂(上海化学试剂总 厂)用流动相进行稀释. 1.2色谱条件色谱柱,C18柱(HypersilOSD25 Ixm4.6mmx250mm,大连依利特科学仪器有限公 司).流动相,采用在十八烷基柱中应用最广的磷酸 盐缓冲液系统配制3%CH3OH__o.01mol/LKHPO (pH2.55)溶液为其流动相J.流速为0.5ml/min, 柱温30?,紫外检测波长210nm,进样量20l. 1.3色谱条件优化及确立 【收稿日期】2~7-07-14 【基金项目】浙江省教育厅资助课题(20051134) 【作者简介】王忠永(1975-),男,主管技师,Emall:win1tgforever2000@ 163COIYI 1,3,1流动相浓度的选择将流动相分别配成含 3%甲醇的0.O1,0.02,0.05,0.10m0l/,LKH2PO4溶液 (用H,PO调pH为2.55),对标准溶液中的乙酸,乳酸 进行分离测定.结果表明磷酸盐的浓度对分离与出峰 影响不大.因高浓度的盐会对色谱系统产生影响,因 此选用0.01mol/L的KHPO溶液作为流动相. 1.3.2流动相中甲醇含量的选择少量甲醇能有效 的改善峰形.比较了1%,3%,5%,8%甲醇量对保 留时间及分离度的影响.随着甲醇浓度的增加,保留 时间提前,但乙酸和乳酸峰之间的分离度下降.相对 3%的甲醇浓度效果较好,选用此浓度J. 1.3.3pH值pH有一定影响,参照文献[4],将 pH选择为2.55.用磷酸调节pH为1.8及3.0时, 乙酸和乳酸的分离均不佳. 1.3.4柱温柱温对保留时间及分离度有一定影 响.随着柱温提高,保留时间提早,分离度降低.但 温度太低亦影响峰形及延长保留时间,其在30?时 峰形及分离均较佳,故设定柱温为30?. 1.3.5流速流速对乙酸,乳酸的出峰和分离有较 大影响,随着流速的提高,保留时间明显缩短,两者之 间分离度下降,柱压上升.但太低的流速则影响出峰 和峰形乃至不出峰.在0.5ml/min时效果较佳. 1.4实验方法 1.4.1色谱图按优化后的色谱条件对标准品进行 测定,其乳酸的保留时间为9.10min,乙酸的保留时 间为9.56min,两峰之间基本分开但峰之间比较接近 (见图1). 1.4.2乳酸菌有机酸代谢产物(乙酸,乳酸)的测定 1.4.2.1标本来源5株菌来源于临床分离的阴道 内的乳酸菌,分纯后各配成0.5麦氏浊度的菌液,取 100Ixl接种于2mlMRS液体培养基中,在厌氧条件 下培养3,6,9,12,24,48,72h时分别取产物高速离 528ChineseJournalofMicroecology,December2007,Vo1.19No.6 心(13000r/min)5min,取上清一4O?冻存待测. 1.4.2.2标准应用液配制各取乙酸,乳酸标准品 用MRS液体培养基配成0.6,0.3,0.15,0.075, O.0375mol/L的标准应用液. 图1色谱图(前为乳酸,后为乙酸) 1.4.2.3样本准备将标准应用液及上述冻存标本 室温复融后,各取200l加人等量的甲醇溶液沉淀 蛋白并高速离心(13000r/min)5min,取上清测定. 2结果 用上述建立的方法测定标准应用液及乳酸菌代 谢物中的乙酸和乳酸的含量.以其峰高对浓度做标 准曲线:乳酸,Y=0.0069+0.414x,r=0.9991;乙酸,Y= 0.0343+0.701lx,r=0.9998.测定标本中的乳酸含量在 (0.016,0.833)mol/L,乙酸含量在(0.009—0.198) mol/L,这两种有机酸在乳酸菌的代谢产物中均有较 多含量5J,且随着培养时间的延长,含量增加,其中 乳酸的含量增加明显快于乙酸的含量增加. 3讨论 .3.1经实验证明,采用HypersilC18柱建立的高效液 相色谱系统可以较好地分离和定量测定厌氧菌有机 酸代谢物中的乙酸和乳酸含量.该方法具有前处理 简单,灵敏度高,速度快,可同时定量检测等优点.我 们测定了乳酸菌代谢产物中乳酸,乙酸的含量,发现 这两种有机酸在乳酸菌的代谢物中均有较高含量,且 代谢物中乳酸的产生速率大于乙酸的产生速率. 3.2产生有机酸维持微生态环境的完整性和功能是 我们体内一些益生菌的重要功能,在不同病理状态及 药物如抗生素的影响下,其产生有机酸的能力会受影 响而产生变化,可能是造成其微生态失衡的一个重要 原因.本文测定了几株临床分离乳酸菌的产有机酸 能力,但对其与f临床特别是抗生素药物作用影响的相 关性,还需更多的研究测定. 【参考文献】 [1]高海燕,王善广,胡小松,等.利用反相高效液相色谱法测定梨汁 中有机酸的种类和含量[J].食品与发酵工业,2004(8):96—100. [2]宋永康,郭嘉,潘葳,等.影响测定反相高效液相色谱流动相pH值 的因素[J].现代科学仪器,2o05(1):95-97. [3]高海燕,廖小军,王善广,等.反相高效液相色谱法测定果汁中l1 种有机酸条件的优化[J].分析化学,2004(12):1645—1648. [4]白冬梅,杜国民,赵学明,等.反相高效液相色谱法测定产琥珀酸 放线杆菌发酵液中的有机酸[J].分析化学,2003(31): 1496—1499. [5]文姝,刘欣,袁杰利,等.乳杆菌,双歧杆菌代谢产物的气相色谱分 析[J].中国微生态学杂志,2004(16):221-222. (上接第526页)献报道一致,提示CyclinD1改变是大肠 癌一个常见的分子事件.实验发现CyclinD1阳性表 达与各临床病理参数无显着相关性,提示CyclinD1 在大肠癌的发生中可能是一个早期事件,与大肠黏膜 的癌变有关,与ARBER等人研究结果一致.而亦有 相反报道,DONNELLAN认为CyclinD1的表达与癌组 织分化程度相关,分化越差其阳性表达率越高,故 CyclinD1与大肠癌生物学行为的关系需进一步研究. 在胰腺癌,头颈部肿瘤中发现,CyclinD1表达与 肿瘤患者的不良预后有关J.而且MAEDA发现Cy— clinD1过度表达是大肠癌的独立预后因素.本研究 表明,CyclinD1阳性表达者5年存活率为35%,显着 低于CyclinD1阴性表达者的58%.CyclinD1阳性表 达与预后呈负相关,同文献结果一致. 实验显示,Survivin和CyclinD1大肠癌中的表达 正相关,提示Survivin,CyclinD1在细胞周期调控中既 有独立的功能,又有协同作用,表现调控点顺序性改 变:CyclinD1表达,缩短G1一S期转换,在G2/M,Sur— vivin既抑制Caspase活性,抑制凋亡,又加速增殖,共 同导致细胞增殖与凋亡平衡破坏,发生癌变.研究证 实了肿瘤的发生是多种基因及其表达产物协同作用 的结果. 本实验提示通过检测Survivin,CyclinD在大肠 癌中的表达,可为临床制定合理治疗和预后评估 提供帮助和参考依据. 【参考文献】 [1]AMBROSINIG,ADIDAC,SIRUGOG,eta1.Inductionofapoptosis andinhibitionofcellproliferationbysurvicingenetargeting[J].JBiol Chem,1998,273:11177-11182. [2]MASUDAM,HIRAKAWAN,NAKASHIMAT,eta1.CyclinD1over expressioninprimaryhypopharynge~carcinoma[J].Cancer,1996, 78:390-396. 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