论文：环境因素对微生物的影响(20学时)

：环境因素对微生物的影响(20学时) 第五章 环境因素对微生物的影响(2.0学时) [内容提要] 消毒与灭菌是兽医微生物学实践中最常用的措施之一。灭苗手段有物理、化学及生物学多种方法。常用的火焰灭菌法、热空气灭菌法、高压蒸汽灭菌法、巴氏消毒法及煮沸灭菌法各有特点和实用范围。可见光中的紫外线及红外线有杀菌作用～光复活作用是一个值得注意的现象。γ射线、微波等也常用于灭菌。滤过除菌应用广泛～制造生物制品等的车间对空气滤过有特定要求。化学消毒剂的功效易受环境因素的影响～抗生素等用于细菌感染动物的治疗。细菌素和噬菌体对细菌的抑杀作用有完全不同的机理。未完全杀来的细菌可处于亚致死损伤状态～在一定条件下可以自行修复。 微生物多为单细胞生物，具有表面积大、新陈代谢率高、繁殖快、适应能力强以及易变异等特点，故其生命活动极易受外界环境条件的影响。了解外界环境因素对微生物的影响，以便控制外界因素，达到充分利用微生物有利的一面，消灭其有害的一面，这无论在理论上还是在实践上都具有重要意义。 本章着重介绍物理、化学、生物学因素对微生物的抑制或杀灭作用以及消毒灭菌方法，在具体讨论这些内容之前，先简要地介绍几个基本概念。 杀菌作用(bacteriocidic action) 指某些物质或因素所具有的在一定条件下杀死微生物的作用。 抑菌作用(bacteriostatic action) 指某些物质或因素所具有的抑制微生物生长与繁殖的作用。 抗菌作用(antibiotic action) 指某些药物所具有的抑制或杀灭微生物的作用。 灭菌(sterilization) 指杀灭物体中所有病原微生物和非病原微生物及其芽孢、霉菌孢子的方法。 消毒(disinfection) 指杀灭物体中的病原微生物的方法。消毒只要求达到消除传染性的目的，而对非病原微生物及其芽孢、孢子并不严格要求全部杀死。 防腐(antisepsis) 指阻止或抑制微生物生长繁殖的方法。 无菌(asepsis) 指没有活的微生物的状态。采取防止或杜绝任何微生物进入动物机体或其它物体的方法，称为无菌法。以无菌法进行的操作称为无菌技术或无菌操作。以无菌技术剖腹产取出分娩胎儿，并在无菌条件下饲喂的动物，称无菌动物。 31 第一节 物理因素对微生物的影响 对微生物影响较大的物理因素包括:温度、辐射、干燥、声波、微波、滤过等。 一、温度 适当的温度有利于微生物的生长发育，但温度过高或过低都会影响微生物的新陈代谢，生长发育受到抑制，甚至使之死亡。 (一)低温 大多数微生物对低温具有很强的抵抗力，当微生物处于最低生长温度以下时，其代谢活动降低到最低水平，生长繁殖停止，但仍可长时间保持活力。所以，常在5?,10?下来保存细菌，以低温冰冻来保存食品。也有些细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)等对低温特别敏感，在冰箱内保存比在室温下保存死亡更快。 (二)高温 高温对微生物具有明显的致死作用，因此最常用于消毒和灭菌。高温可对菌体蛋白质、核酸、酶系统等产生直接破坏作用，热力可使蛋白质中的氢键破坏使之变性或凝固，使双股DNA分开为单股，受热而活化的核酸酶使单股的DNA断裂，导致菌体死亡。 热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌表3-1 蛋白质含水量与其凝固温度的关系 两类。在同一温度下，后者效力比前者在30 min内凝固所需的温度蛋白质含水量(%) (?) 50 56 为大，这是因为湿热中菌体蛋白较易凝 25 74,80 固。蛋白质含水量愈高，凝固所需的温18 80,90 6 145 度愈低(表3-1);其次湿热的穿透力比6 160,170 干热强;而且蒸汽可以释放大量潜热， 可迅速提高被灭菌物体的温度。 1.干热灭菌法(dry heat sterilization):包括火焰灭菌和热空气灭菌两类。 (1)火焰灭菌法 以火焰直接烧灼杀死物体中的全部微生物的方法。分为灼烧和焚烧两种，前者主要用于耐烧物品，后者常用于烧毁的物品。 (2)热空气灭菌法 利用干热灭菌器，以干热空气进行灭菌的方法。适用于高温下不损坏、不变质的物品。在干热情况下，由于热空气的穿透力较低，因此干热灭菌需在160?维持1,2 h，才能达到杀死所有微生物及其芽胞、孢子的目的。 2. 湿热灭菌法(moist heat sterilization):常用的湿热灭菌有如下几种。 32 (1)煮沸灭菌 煮沸10,20 min可杀死所有细菌的繁殖体，芽孢常需煮沸1,2 h才被杀死。若在水中加入1%碳酸钠或2%,5%石炭酸，可以提高沸点，加强杀菌力，加速芽胞的 死亡，灭菌的效果更好。 (2)巴氏消毒法,pasteurization, 以较低温度杀灭液态食品中的病原菌或特定微生物，而又不致严重损害其营养成分和风味的消毒方法。由巴斯德首创，目前主要用于葡萄酒、啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。具体方法可分为三类，第一类为低温维持巴氏消毒法(low temperature holding pasteurization，LTH)，在63?,65?保持30 min;第二类为高温瞬时巴氏消毒法(high temperature short time pasteurization，HTST)，在71?,72?保持15 s;第三类为超高温巴氏消毒法(ultra high temperature pasteurization，UHT)，在132?保持1,2 s。加热消毒后应迅速冷却至10?以下，称为冷击法，这样可进一步促使细菌死亡，也有利于鲜乳等食品马上转入冷藏保存。超高温巴氏消毒的鲜乳在常温下，保存期可长达半年。 (3)流通蒸汽灭菌法 是利用蒸汽在蒸笼或流通蒸汽灭菌器内进行灭菌的方法，也称间歇灭菌法(fractional sterilization)。100?的蒸汽维持30 min，足以杀死细菌的繁殖体，但不能杀灭芽孢和霉菌孢子。故常将第一次灭菌后的物品置温箱中过夜，待芽孢萌发出芽，第二天和第三天以同样方法各进行一次灭菌和保温过夜，以达到完全灭菌的目的。此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基的灭菌。如将物品在70?,80?加热1 h，连续6次，也可达到灭菌的目的，且可不破坏血清等。 (4)高压蒸汽灭菌法 即用高压蒸汽灭菌器进行灭菌的方法。是应用最广泛的、最有效的灭菌方法。在一个大气压下，蒸汽的温度只能达到100?，当在一个密闭的金属容器内，继续加热，由于蒸汽不断产生而加压，随压力的增高其沸点温度也升至100?以上，以此提高 2灭菌的效果。高压蒸汽灭菌器(autoclave)就是根据这一原理的。通常用1.02 kg/cm(约0.107Mpa，旧称每平方英寸15磅)的压力，在121.3?温度下维持15,20 min，即可杀死包 括细菌芽孢在内的所有微生物，达到完全灭菌的目的。 二、辐射 辐射包括电磁波辐射和粒子辐射。电磁波辐射是由赫兹电波、红外线、可见光、紫外线、X射线、,射线、宇宙线辐射构成;粒子辐射由,射线、,射线以及高能质子、中子等组成。,射线是带正电的质子，,射线是带负电的电子。 辐射对微生物的灭活作用可分为电离辐射和非电离辐射两种。电离辐射包括,射线、,射线、X射线、,射线以及高能质子、中子，非电离辐射包括可见光、日光、紫外线。 (一)可见光线 33 是指在红外线和紫外线之间的肉眼可见的光线，其波长400,800 nm。可见光线对微生物一般无多大影响，但长时间作用也能妨碍微生物的新陈代谢与繁殖，故培养细菌和保存菌种，均应置于阴暗之处。 可见光的杀菌作用微弱，若将某些染料如结晶紫、美蓝、汞溴红、伊红、沙黄等加到培养基或涂在外伤表面，能增强可见光的杀菌作用，这一现象称为光感作用(photosensitization)。一般在有氧的情况下才出现光感作用，这与染料激活氧或染料氧化后生成氧化物而起杀菌作用有关。 (二)阳光 直射日光有强烈的杀菌作用，是天然的杀菌因素。许多微生物在直射日光的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽孢对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20 h才死亡。 5 日光依光谱分为可见光和看不见的紫外线(13.6,400nm)与红外线(800,4×10nm)， 各具有不同的杀菌效力，其中紫外线是日光杀菌作用的主要因素，红外线则因产生高热而发挥杀菌作用。 (三)紫外线 紫外线中波长200,300 nm部分具有杀菌作用，其中以265,266 nm段的杀菌力最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。紫外线的穿透力不强，即使是很薄的玻璃也不能透过，所以只能用紫外线杀菌灯消毒物体表面，常用于微生物实验室、无菌室、手术室、传染病房、种蛋室等的空气消毒，或用于不能用高温或化学药品消毒物品的表面消毒。 紫外线的杀菌原理是细菌经紫外线照射后，由于DNA分子吸收260 nm左右的紫外线，使同一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶产生共价键而结合成二聚体，影响DNA复制与转录时的正常碱基配对，引起致死性突变而死亡。此外，紫外线还可使空气中的分子氧变为臭氧，臭氧放出氧化能力强的原子氧，也具有杀菌作用。 细菌受致死量的紫外线照射后，3 h以内若再以可见光照射，则部分细菌又能恢复其活力，这种现象称为光复活作用(photoreactivation)。细菌所具有的光裂合酶(photolyase)和经紫外线照射过的DNA在黑暗中相结合，在可见光的协同作用下，酶和DNA又复解离，使形成胸腺嘧啶二聚体的DNA分子又恢复为正常分子结构。 DNA的修复还可进行暗修复(dark repair)，无需可见光的协同作用。暗修复有三种机制:核苷酸切除修复(nucleotid-excision repair)、SOS失误定向修复(SOS-error prone repair)及复制后重组修复(postreplication recombinational repair)，三种机制均需调控蛋白的参与。 (四)电离辐射 放射性同位素的射线(即,、,、,射线)和X射线以及高能质子、中子等可将被照射物 34 质原子核周围的电子击出，引起电离，故称之为电离辐射。 X射线(波长0.06,13.6 nm)的杀菌力不如紫外线，作用也较慢，一般认为X射线的波长愈短杀菌力愈强。,与,射线的电离辐射作用较强，具有抑菌或杀菌作用;,射线(波长0.001,0.4 nm)的电离辐射作用弱，仅有抑菌作用和微弱的杀菌作用。但,与,射线穿透力强。在实际工作中主要是X、,和,射线，用于消毒、食品保藏和育种等方面。,射线、高能质子、中子等因缺乏穿透力而不实用。 ，,一般认为，电离辐射的杀菌机制是射线使水电离为H和OH，这些游离基是强烈的还原剂和氧化剂，可直接作用于细菌本身。此外，射线作用于细菌周围液体内的氧分子，形成,,2O、O、HO、HO等氧化性基团，能使菌体内酶类的–SH基氧化而失去活性。射线直22222 接作用于菌体时，可放出一个以上的能量量子(quanta of energy)，可导致包括DNA在内的细胞内部物质分解，使细菌死亡或发生突变。 三、干燥 微生物在干燥的环境中失去大量水分，新陈代谢便会发生障碍，甚至引起菌体蛋白质变性和由于盐类浓度的增高而逐渐导致死亡。由于微生物不能在干燥环境中生长繁殖，因此常用干燥法来保存食品、饲料、谷类、皮张、药材等。利用高浓度的盐溶液或糖溶液保存食品，是由于高浓度的溶液吸取菌体内的水分，造成微生物细胞的生理性干燥而达到抑菌的目的。 四、超声波 频率在20 000,200 000 Hz的声波称为超声波。细菌和酵母菌在超声波作用下于几十分钟内死亡，大多数噬菌体和病毒对超声波也有一定的敏感性，但小型病毒对超声波不敏感，细菌的芽胞对超声波具有抵抗力。超声波处理虽可使菌体裂解死亡，但往往有残存者，又因超声波费用颇大，故未应用于消毒灭菌。目前主要用于裂解细胞，提取细胞组分，研究其抗原、酶类、细胞壁的化学性质以及从组织内提取病毒等。 五、微波 从几百兆赫至几十万兆赫频率的无线电波称为微波。 微波灭菌，主要是利用微波的加热作用完成。当把灭菌的物品放在微波照射的交变电场中时，物品内部的分子随着电场的变化而相应的旋转振动起来，电场变化快，分子振动也就跟着快;但是，由于分子间的相互作用力即产生摩擦力，因此分子克服其摩擦力而产生热量，使整个物品则热起来，起到了摩擦加热灭菌的作用。 35 微波加热的应用范围很广，除可用来对医药用品及其它物体进行灭菌外，还可用于加快免疫化学反应如ELISA以及物品脱水等。 六、滤过 滤过除菌(sterilization by filtration)是通过机械阻留作用将液体或空气中的细菌等微生物除去的方法。但滤过除菌常不能除去病毒、霉形体以及细菌L型等小颗粒。 除用滤器进行糖培养液、各种特殊的培养基、血清、毒素、抗毒素、抗生素、维生素、氨基酸等液体的过滤除菌外，还可用于病毒的分离。利用空气过滤器可进行超净工作台、无菌隔离器、无菌操作室、实验动物室以及疫苗、药品、食品等生产中洁净厂房的空气过滤除菌。洁净厂房空气洁净度按环境控制区分类划分为四个等级(表3-3)，其空气的尘粒数和微生物数应符合规定。 表3-3 洁净厂房空气洁净度等级(GMP即药品生产管理标准) 33 活微生物数/m 尘粒数/m洁净级别 ? 0.5 ,m ? 5 ,m 沉 降 菌 浮 游 菌 100级 ?3 500 0 ?1 ? 5 10 000级 ?350 000 ?2 000 ? 3 ? 100 100 000级 ?3 500 000 ?20 000 ?10 ?500 大于100 000级 ?35 000 000 ?200 000 暂缺 暂缺 1，测状态以静态为据;2，判定洁净等级所列0.5 ,m和5 ,m两种粒径，测试时任选一种 注:GMP, Good manufacturing practice . 第二节 化学因素对微生物的影响 许多化学药物能够抑制或杀死微生物，已广泛用于消毒、防腐及治疗疾病。用于杀灭病原微生物的化学药物称为消毒剂(disinfectant);用于抑制微生物生长繁殖的化学药物称为防腐剂(antispetic)或抑菌剂(bacteriostat)。实际上，消毒剂在低浓度时只能抑菌，而防腐剂在高浓度时也能杀菌，它们之间并没有严格的界限，统称为防腐消毒剂。用于消除宿主体内病原微生物或其它寄生虫的化学药物称为化学治疗剂(chemotherapeutic agent)。消毒剂与化学治疗剂不同，它在杀灭病原微生物的同时，对动物体的组织细胞也有损害作用，所以只能外用或用于环境的消毒，其中少数不被吸收的化学消毒剂亦可用于消化道的消毒;而化学治疗剂对于宿主和病原微生物的作用具有选择性，它们能阻碍微生物代谢的某些环节，使其生命活动受到抑制或使其死亡，而对宿主细胞毒副作用甚小。 关于消毒剂的这类及其应用以及影响消毒剂作用的因素等问请自学。 第三节 生物因素对微生物的影响 36 自然界中能影响微生物生命活动的生物因素很多，在各种微生物之间，或是在微生物与高等动植物之间，经常呈现相互影响的作用，如寄生、共生和拮抗现象等。导致拮抗的物质基础主要是微生物的代谢产物抗生素、细菌素，植物杀菌物质如黄连素(小蘖碱)，以及噬菌体对细菌等活微生物的裂解作用。 一、抗生素、植物杀菌素和细菌素 (一)抗生素(antibiotics) 某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死另一些微生物的物质称为抗生素。它们主要来源于放线菌(如链霉菌)，少数来源于某些霉菌(如青霉菌等)和细菌(如多粘菌素)，有些亦能用化学方法合成或半合成。到目前为止，已发现的抗生素达2500多种，但其大多数对人和动物有毒性，临床上最常用的抗生素只有几十种。 抗生素的抗菌作用主要是干扰细菌的代谢过程，达到可抑制其生长繁殖或直接杀灭的目的。抗生素的作用原理可概括为4种类型:干扰细菌细胞壁的合成;损伤胞浆膜而影响其通透性;影响菌体蛋白质的合成;影响核酸的合成。 (二)植物杀菌素(phytocide) 某些植物中存在有杀菌物质，这种杀菌物质一般称为植物杀菌素。中草药如黄连、黄柏、黄芩、大蒜、金银花、连翘、鱼腥草、穿心莲、马齿苋、板蓝根等都含有杀菌物质，其中有的已制成注射液或其它制剂的药品。 (三)细菌素(bacteriocin) 是某种细菌产生的一种具有杀菌作用的蛋白质，只能作用于与它同种不同菌株的细菌以及与它亲缘关系相近的细菌。例如大肠杆菌所产生的细菌素称为大肠菌素(colicin)，它除作用于某些型别的大肠杆菌外，还能作用于亲缘关系相近的志贺菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和巴氏杆菌等。细菌素可分为三类，第一类为多肽细菌素，分子量2000~10000，多由革兰氏阳性菌产生;第二类为蛋白质细菌素，分子量30000~90000，多由革兰氏阳性菌产生。大肠菌素是其代表，也是所有类型细菌素中研究得最多的一种;第三类为颗粒细菌素，分子量大 7于10，超速离心可将其沉淀，形态类似噬菌体，由蛋白亚单位组成。如铜绿假单胞菌产生的pyocin等。 二、噬菌体 噬菌体(bacteriophage，phage)是寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等的一类病毒，亦称细菌病毒。有人将真菌病毒列属此类。 37 (一)形态和结构 噬菌体有四种外形，即蝌蚪形、微球形、细杆形和柠檬形。 典型的蝌蚪形噬菌体由头部和尾部两部分组成，头部呈二十面 体，等轴对称(直径约60nm)或延长(约111×78nm)，是由 蛋白质衣壳内含一分子的线状双股DNA构成;尾部主要含蛋白 质，呈螺旋型并能收缩(80,455nm)、或细长而不能收缩(64, 570nm)、或短而不能收缩(约20nm)三种类型。螺旋型能收 缩尾部由一个中空管状的尾髓和可收缩的尾鞘组成，由尾领将其 图3-1 蝌蚪形噬菌体结构模式图 与头部相连接，末端具有一个基板，其上伸出6个短的尾刺和6 根长的尾丝(图3-1);细长不能收缩的尾部，具有短的末端和亚末端尾丝;短而不能收缩的尾部，具有6根短的尾丝。微球形噬菌体，呈等轴二十面体，小者直径24nm或27nm，大者 直径60nm或63nm，无囊膜或有囊膜，衣壳内含双股DNA、或单股DNA、或单股RNA， 有的具双层衣壳或多层衣壳，有的顶角上具有突刺。 (二)噬菌体的增殖 噬菌体的增殖过程可分为吸附、侵入、生物合成和成熟与释放四个阶段，参见动物病毒增殖。 噬菌体可使混浊的细菌液体培养物变得清朗，在固体培养基上可使细菌裂解而呈现无细菌生长的区域，即为噬菌现象。由于噬菌体裂解宿主细胞致使菌苔上形成的透亮不长菌的圆斑，称为噬斑，亦称空斑(plaque)。每一个噬菌斑理论上是由一个噬菌体粒子繁殖形成的。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的形态、大小、边缘和透明度，故可用作噬菌体的鉴定以及纯种分离和计数。若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬菌斑计数，可测得每毫升容积内的噬斑形成单位(plaque forming units，pfu)数。 (三)噬菌体与寄主细菌的关系 噬菌体与寄主细菌的相互关系可分为溶菌反应和溶原化两种类型。凡能使寄主细胞迅速裂解引起溶菌反应的噬菌体，称为毒性噬菌体(virulent phage)或烈性噬菌体。另有些噬菌体侵入寄主细胞后，将其基因整合于细菌的基因组中，与细菌DNA一道复制，并随细菌的分裂而传给后代，不形成病毒粒子，不裂解细菌。这种现象叫溶原化(lysogenization)，引起溶原化的噬菌体叫温和噬菌体(temperate phage)或溶原性噬菌体(lysogenic phage)，整合到细菌DNA上的噬菌体基因叫前噬菌体(prophage)，带有前噬菌体的细菌叫溶原性细菌(lysogenic bacteria)。有的前噬菌体与细菌的毒力因子有关，例如带有前噬菌体的白喉杆菌获得了产生毒素的能力。 38 溶原性细菌可自发地终止其溶原性，引起溶菌反应而释出噬菌体。也可通过紫外线、电离辐射、氮介子气、过氧化物、乙烯亚胺等处理溶原性细菌，可诱导前噬菌体脱离细菌DNA，使其在寄主细胞内完成生物合成，装配成完整的噬菌体引起细胞裂解而释放。 (三)噬菌体的应用 1. 细菌的鉴定和分型:噬菌体的噬菌作用具有种和型的特异性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，或仅能作用于该种细菌的某一型，故可用于细菌的鉴定与分型。这对流行病学调查、追踪传染源以及细菌研究等具有重要意义。 2. 未知细菌:应用噬菌体效价增长试验可检测标本中的相应细菌。若其效价有明显增长，则表明标本中有某种细菌的存在。 3. 分子生物学研究的工具:噬菌体曾作为研究病毒增殖的模式，研究核酸复制、转录、重组以及基因表达的调节、控制等的重要对象，还可作为基因的载体，应用于遗传工程的研究。近年来应用丝状噬菌体表达特特抗原的基因，所谓噬菌体表面展示(phage display)技术，已成为制备基因工程抗体的重要手段。 第四节 微生物的亚致死性损伤及其恢复 受各种理化因素作用，往往致使部分微生物细胞未完全死亡，而处于一种介于正常和死亡的状态，即濒死状态，这些细胞在适宜的条件下，能够自我修复并恢复正常的特性，该损伤称之为亚致死性损伤(sublethal injury，SI)，这种在生理上存在缺陷但仍然活着的微生物细胞称为亚致死性损伤细胞(sublethally injured cell，SIC)。 研究微生物的亚致死性损伤及其恢复，这不仅是消毒理论研究还是传染病预防以及公共卫生学实践，均具有重要意义。 39 40