牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的研究

牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的研究 四川农业大学 硕士学位论文牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的研究 姓名:肖正中 申请学位级别:硕士 专业:动物遗传育种与繁殖 指导教师:赖松家 20030501 摘要 本试验从屠宰场收集了,,头黄牛、,,头水牛和,头黑白花奶牛的卵巢共,,,个。共回收卵母细胞,,,,枚。其中获得可用卵母细胞,,,枚。水牛平均每个卵巢可收集,(,,枚可用卵母细胞，只相当于黄牛和黑白花牛(分别为,(,,和,。,,)的一半;从水牛卵巢收集的可用于?,的卵母细胞的比率(,,(,,,)也极显著(,,,(,,)低于黄牛或黑白花牛(分别为,,(,,,和,,(,,,)。结果明，水牛卵巢有腔卵泡少，卵母细胞产量少、质量差。 本研究比较了三神采集黄牛卵泡卵母细胞的方法。用抽吸加切割法平均从每个卵巢回收的卵母细胞数(,(,,枚)和可用卵数(,(,,枚)都极显著(,,,(,,)高于抽吸法(分别为,(,,和,(,,枚)和切割法(分别为,(,,和,(,,枚)，用切割法从单个卵巢回收的卵母细胞显著(,,,(,,)高于抽吸法。而回收的可用卵数与抽吸法之间差异不显著(,,,(,,)。结果显示，用切割法采集的裸卵比抽吸法多，抽吸加切割法是一种能够采集较多可用卵母细胞的好方法(但是该法手续繁杂，适于一次只能收集少量卵巢时使用。 在牛卵母细胞成熟培养液中不添加,, ,,,,的情况下。分别添加,(,,,,,和,,,,,,，黄牛卵母细胞的体外成熟率分别为,,(,,,和,,(,,,，受精率分别为,,(,,,和,,(,,,，二者无显著差异(,,,(,,);在成熟培养液中添加,, ,,,,,的情况下，分别添加,(,,,,,和，,,,,,，黄牛卵母细胞的体外成熟率分别为,,(,,,和,,(,,,，受精率分别为,,(,,,和,,(,,,，二者也无显著差异(,,,(,,)。结果表明，在成熟培养液中用,(,,,,,代替,,,,,,是可行的。在对水牛的试验结果也得出同样结论。另外，在黄牛(或水牛)卵母细胞成熟培养液中添加,, ,,,,时，卵母细胞的体外成熟率和受精率都显著(,(?(,,)或极显著(,,,(,,)的高于不添加,, ,(,,组，试验结果表明，,,,(,,对牛卵母细胞的成熟和受精是必要的。同时，本试验对现行的黄牛体外受精程序应用于水牛体外受精的可行性进行了探讨，结果显示，虽然水牛卵母细胞在体外培养可成熟和受精，但是在同一处理下，水牛卵母细胞的成熟率和受精率都显著(,,,(,,)或极显著(,,,(,,)低于黄牛，这表明。利用现行的黄牛体外受精程序进行水牛的体外受精是有效、可行的，但可能所用的受精液或受精过程的某些步骤不太适合水牛卵母细胞，还需进一步改进，今后水牛卵母细胞体外受精研究的重点应放在提高体外成熟的培养效果上，以提高水牛体外受精的整体效率。 本试验通过用两种不同的方法处理受精前的牛冷冻精液来研究其对卵母细胞体外受精率的影响。本试验用上游法和,,,;,,,法处理牛冷冻精液后，黑白花牛卵母细胞的体外受精率分别为,,(,,,和,,(,,,，二者无显著差异(,,,(,,)，在黄牛和水牛的研究结果中也得出同样结论。结果表明，上游法和,,,;,,,法是两种常用的精子处理技术，但,,,;,,,法更简便、快速，如果方法应用得当，,,,;,,,法是首选方法。 关键词:牛、有腔卵泡、卵母细胞、体外成熟、体外受精 , ,(前言 体外受精是指在体外环境下完成精卵结合的过程。自从,,,,,(,,,,)获得世界上第一例体外受精动物(兔)以来，哺乳动物体外成熟(,, ,,,,, ,,,,,,,,,,，，,,)、体外受耩(,, , ,,,, ,,,,,,,,,,,,,，，,,)和受精卵的体外培养(,, ,,,,, ;,,,,,,，，,,)技术研究进展很快。目前(体外受精过程的各个步骤都可在体外成功进行。例如，卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、卵母细胞的体外受精、受精卵的体外发育以及配予和胚胎的冷冻保存等。体外受精研究的深入开展，一方面加深了人们对受精机制的认识，另一方面为动物育种、治疗人类不孕症提供了有力的手段。 随着体外受精技术的发展，牛卵母细胞的体外成熟和体外受精技术显得愈来愈重要。,,,;,,,,等(,,,,)获得世界上第一头试管牛犊。随后世界首例完全体外受精化孪生试管牛犊降生(,,，,,,,)。目前，试管牛生产技术已逐步由研究向生产应用阶段发展，但是，受精卵囊胚发育率还比较低，一般为,,,,,,,。许多证据表明，体外受精囊胚期前的胚胎代谢活动主要由母源性基因及其产物，如,,,,、,,,,、蛋白质等所调控的，因此卵母细胞体外成熟和体外受精情况是决定其囊胚发育率高低的关键。 提高卵母细胞成熟率对其后受精率和囊胚发育率的提高有很大促进作用，影响卵泡卵母细胞体外成熟的因素很多，激素和血清是影响牛卵泡卵母细胞?,的两个重要因素。在对成熟培养液中添加雌二醇激素是否能促进卵母细胞培养效果还有争议，但现在许多学者认为雌二醇的存在对于卵母细胞的完全成熟是有益的。同时，大多数学者认为在培养液中添加适量血清可促进卵母细胞的?,和，,,。但是血清成分还不明确。无法研究其具体作用机理，并且血清价格昂贵。为了解决这些问题，本试验力求用一种成分明确且价廉的血清替代品来替代血清，研究其对牛卵母细胞?,和，,,的影响。 精子的体外获能是体外受精技术的关键环节之一，这关系到体外受精率的高低。影响精子体外获能的因素很多，主要包括温度、动物种类、采精位置、培养液组成等。其中培养液的成分是影响精予体外获能的主要因素。另外，?,中使用高活力的精子非常重要，可以通过精子的预处理(如糟子浮游，,,,;,,密度梯度离心等)来分离高活力的精子，还可通过添加一些化学试剂来刺激精予的活力并保持之。 ,(文献综述,(,卵母细臆体外成蕉的方法,(,(,卵母细?的成慧过程 哺乳动物卵母细胞依其生长发育阶段可分为生长期和成熟期两类。生长期是从第一次减数分裂休止期到完成生长这一阶段。卵母细胞分裂始于胚胎早期，出生时已达双线期，此时分裂停止进行(第一次减数分裂休止期)，染色体呈高度分散构造，这个阶段称为核网期(,,;,,,,,,, ,,,,,或,,;,,,,,, ,,,,,)。直到排卵前，即卵子重新开始减数分裂，其间持续很长时间，卵子(正是初级卵母细胞)的核呈静止核样外观，称胚泡(,,,,,,,, ,,,,;,,)。此时卵母细胞核大而圆，具有一至数个小体，并产生大量核液，使核增大。 人工采集的卵母细胞大都完成生长，进入成熟期。其表现为卵母细胞核经过第一次减数分裂的浓缩期、中期(,，)、后期(,，)、末期(,，)和第二次减数分裂的间期而达到中期(,，，)。在光镜下可看到生发泡破裂(,,,,)和第一极体排出。一般而言，,,,,代表减数分裂的开始。而第一极体排出标志着卵母细胞已达到核成熟。在电镜下观察，线立体由近核区移向质膜下区，在一端出现大空泡，即帽状线立体，这是卵母细胞成熟的一个重要标志。 胞质成熟与核成熟关系密切(并涉及受精率以及早期胚胎发育率。在胞质成熟的过程中，颗粒细胞和卵丘细胞起着重要的作用，而大量的蛋白质合成可以激活成熟促进因子(,,,)，促进卵母细胞自身的成熟。现已证明，卵母细胞的卵丘细胞群完整度、紧 密度直接影响着体外成熟的效果。选用卵丘细胞较多的卵母细胞进行培养。可明显提高成熟率和后期发育能力。颗粒细胞可以启动卵母细胞内蛋白质的合成，它的存在对牛、羊、猪等家畜卵母细胞最终成熟是绝对需要的。一些研究结果表明，核成熟和胞质成熟存在着明显的时间差，即体外培养时核成熟所需时间短于胞质成熟时间。,(,(,，,母蛔?的体外成麓条件(,)卵子体外成熟的培养液和培养条件 近年来，人们大都使用合成培养液，如,,,,,,、,,,?, ,,,和,,,?, ,,,等，目前尤为使用由碳酸氨钠或,(,,羟乙基哌嗪,,?(,(乙磺酸(,,,,,)缓冲的,,,,,,较为广泛。使用这种培养液，牛的卵母细胞体外成熟率可达到,,,以上(,,,,, ,,,,,,， ,,,,)。培养条件主要有两种,,,,,,、,,,空气、,,(,?,,,?，饱和湿度;,,,,,、,,,,,,、,,,,,、,,(,”,一,,”,，饱和湿度。培养方法现多采用微滴法培养。在基础培养液中添加血清及促性朦激素都能促进卵子的体外成熟，起到诱发卵丘细胞扩展，促进卵裂的作用。(,)成熟卵子的检查判断 用倒置显微镜(,,(,,,,倍)按下列项目检查培养成熟的卵母细胞。 ?有无胚泡; ?有无第一极体; ,卵丘细胞层的状态;,(紧密包围卵母细胞;,(从卵母细胞脱落，露出卵母细胞透明带;,(卵丘细胞间分泌粘稠的基质，细胞层显著膨大，细胞以卵母细胞为中心，大体呈放射状排列。 将有第一极体和保持?《卵丘的卵母细胞判定为体外成熟卵。但是，以重新开始成熟分裂作为成熟指标时，不管卵丘的状态如何，将有第一极体排出的卵母细胞作为体外成熟卵。,(,黟?牛，,母一?体外成稿的因素 卵母细胞体外成熟情况是决定其受精率及其囊胚发育率高低的关键。影响牛卵母细胞体外成熟的因素很多，主要包括来自卵巢的因素(卵巢所处性周期阶段，卵母细胞质量。卵泡的大小等)，基础培养基的因素，培养液中添加的成分(诸如激素、血清、生长因子等,的因素等。,(,(,簟二—对牛，,母囊?体外成麓的影? 激素的种类很多，在培养液中添加的激素主要包括促卵泡素(,,,)、促黄体素 (,,)、孕马血清(,,,,)、绒毛膜促性腺激素(,,,)、雌二醇激素(,,)等。这里主要介绍雌二醇激素对牛卵母细胞，,,,，,,的影响。 在卵母细胞体外成熟培养中，雌二醇激素对卵母细胞培养效果的影响结果不尽相同。其对?,是否起促进作用仍有异议(因为哺乳动物卵母细胞减数分裂并非由雌二醇所激发)。早先的研究认为,, ,(雌二醇(,, ,(,,)会显著降低牛卵母细胞的成熟率(,,,,, ,，,,,,)。,,等和旭日干等报道在培养基内添加发情牛血清(,,,)和,,,的情况下，雌二酵对牛卵母细胞，,,和胚胎发育并不十分重要。近年来。许多学者认为雌二醇是促进胞质成熟的重要成分，它能促进卵母细胞成熟分裂的复始，又能显著提高卵母细胞的受精能力及早期胚胎的发育能力。一些研究表明添加促性腺激素和(或)雌二醇激素，取得了较好的卵母细胞成熟、受精效果。据,,,,,,,等(,,,,)报道在人卵母细胞体外成熟培养基中加入雌二醇，不影响减数分裂，但能提高其以后的受精率和卵裂率。这表明雌二醇支持受精和发育所必须的卵母细胞成熟过程中细胞质的变化。现在有些学者认为雌二醇的存在对于卵母细胞的完全成熟是有益的，且添加量以,?,,,,为宜，因为这一浓度与,,峰后排卵前卵泡液中雌二醇的浓度大致相同。,(,，,牛，,母鲴毫体外成麓无血清培养 根据培养液中有无血清，可将体外成熟培养大体分为含血清培养和无血清培养。所用的血滂一般为牛血滂，牛血 清的种类随着对其开发利用现已有多种;如胎牛血清 (,,,)、新生牛血清(,,,,,,,)、犊牛血清(,,,)、胎犊血清(,,,)、发情牛血清(,,,,,,,)、发情前期母牛血清(,,,)、超排母牛血清(,,,,、阉牛血清(,,)等。目前研究者对培养体系中添加血清的有利作用已基本形成共识，血清在体外成熟培养基中除为卵丘卵母细胞复合体(;,,,,,, ,,;,,, ;,,,,,,,,，,,,,)提供所必需的蛋白质外，它还能强烈地改变细胞功能，使颗粒细胞和膜细胞对卵母细胞减数分裂恢复的抑制失去效果。另外，它还可与卵母细胞周围的卵丘细胞一起防止透明带硬化 (对受精不利)，有利于精子的穿入，提高卵母细胞的受精能力(,,,,,等，,,,,)，,;,,,,,,,等(,,,,)认为,,,中的胎球蛋白(,,,,,,)可在体外成熟过程中防止透明带硬化。 随着对体外受精研究的不断深入，许多研究者认识到:虽然血清对牛卵母细胞体外成熟有促进作用，但血清成分十分复杂。血清中的激素、生长因子、细胞因子、维生素和其他物质差异也较大，血清中还含有许多至今仍不明确的物质。血清的质量不同，批次不同、来源不同以及血清中含有的对附植前胚胎具有毒素的物质和携带的病菌，使得对于明确血清中含有的成分十分困难，而且应用于，,,中，不仅影响胚胎生产的成本，还造成胚胎生产的不稳定。近年来，研究者对牛卵母细胞体外成熟培养和对早期胚胎体外培养的注意力转向了无血清培养(应用无血清培养系统可以准确调配培养基的各个组分，便于精确研究卵母细胞的调节机制，其主要意义在于利用化学成分明确的培养液对单一因子进行研究，探明不同阶段的营养需要。防止血清带来的污染，同时，血清价格昂贵，从而在体外胚胎生产上节约了成本。现已有一些商品化的 ,血清替代品用于细胞培养，其中之一是，，，,,,,,,(,,)。这种物质由六类组成成分:生长因子、黏附因子、矿质元素、激素、结合蛋白和维生素。,,中蛋白质含量较低(仅为,,,的,，,)，化学组成稳定，无微生物污染。,,用于体外成熟的报道很有限，但其常用于胚胎的培养中。另外，,,,,,和,,,;,(,,,,)认为?,爪，,,，,,常用的,,,很昂贵，他们用一种便宜的替代品“,,,,,;,,,,”(价格相当于,,,的一半)，效果完全可以与,,,媲美， 大分子量的有机物质也被用作血清替代品，在无血清培养时，,般都加入牛血清 白蛋自(,,,,,, ,,,,肋,,,,,,,，,,,)、聚乙烯吡咯烷酮(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,)、聚乙烯醇(,,,,,,,,, ,,;,,,,，,,,)等。,;,,,,等(,,,,)以,,,,,,为基础液，用,,,(,,,,,,)取代血清，使牛卵母细胞在非蛋白液中体外成熟、受精并培养发育至囊胚率为,(,‰加入,,,(,,,,,,)囊胚发育率为,,(,,。,,,,,等(,,,,)利用,(,,的,,,代替牛卵母细胞成熟培养液中,,,,,,，成熟率、受精率和囊胚发育率和有血清存在时无显著差异。当然，许多学者在早期胚胎的体外培养体系中也曾采用这些大分子量的血清替代品，如,,,,,,,,,,等(,,,,)将单细胞牛胚胎培养在加有,,,(,,,,,,)的,,,,,,培养液中，囊胚发育率为,(,,。朱裕鼎等(,,,,)以,,,,,,为基础液，对常规，,,,，,,牛早期胚胎进行了无血清(,,,,,,，,,,)和有血清(,,,,,,)培养的对比试验，无血清培养和有血清培养囊胚率(,(,,对,,(,,)、扩展囊胚率(,(,,对,(,,)，均无显著 差异，试验结果还表明，有血清与无血清组胚胎的各发育阶段(桑椹胚、囊胚、扩展囊胚)细胞核数量无明显差异。但是，这些血清替代品对卵母细胞成熟和对早期胚胎的发育的作用机理尚不清楚。,(,謦晌糟子的停井获德莳囡素,(,(,糖予获蠢机翻 ,,,,年，,,,,,和澳大利亚的,,,,,,几乎同时发现只有在雌性生殖道停留一定时间的槽子才能成功地与卵子结合，进行体外受精，,,,,,,于次年将这种现象命名为 “;,,,;,,,,,,,(获能)”。精予获能过程是多时相、多步骤的复杂变化过程。一般认为获能的第一阶段是脱去精予表面附着的抗原物质和去能因子(,,;,,,;,,,,,,, ,,;,,,,，,,)，此过程是生理学变化，在一定程度上是可逆的。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，印发生顶体反应(,;,,,,, ,,,;,,,,，,,,)(此过程是精子在结构上的获能，,,是指获能之后(精子在穿过卵丘、放射冠和透明带之前。或穿过这些部位期间，发生 ,的顶体破裂、项体内容物释放，形态上发生明显变化的生理过程。这种变化不是可逆的。这两个阶段是两个连续的不可分割的过程。 精 有能力到达卵母细胞并穿过透明带;?有能卵结合之前，精子须具备如下能力:? 力进行获能和顶体反应;?成熟过程中获得的结合蛋白结合位点，适时暴露给卵母细胞以结合透明带;?可以和卵母细胞膜融合并进入到卵质中。精子通过附睾时已获得上述大部分能力(,,,,,,，,,,,『;,,,,,,, ;, ,,((,,,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,，,,,,)。精子获能的理想场所是新近交配的雌性生殖道。精予体外获能的实质是模仿体内获能，但并不意味着体外获能的机制与体内获能完全一致，体外获能所发生的事件与体内可能完全不同。事实上，精子体内获能的效率远远比体外获能的高(,,,,,,,,;,,，,,,,)。早期人们采用体内获能方法，即精子从交配母畜的子宫中冲取，再与卵子受精(,,,,,，,,,,)。以后主要采用高离子强度处理法(,,,;,,,,，,,,,)，钙离子载体法(,,,,,,，,,,,)，肝素处理法(,蛆,,,，,,,,)，咖啡因处理法(，,,,,,,，,,,,)以及添加牛卵泡液、子宫液、输卵管液等。一般说来，凡能促使;,,，进入糖子顶体和使精子内部,,升高的刺激，均可诱发精子体外获能。,。,(,牛糟子体外获奠的方法 自从发现精子获能现象后，许多学者对精子体外获能进行了研究，并证明:应用特定的培养体系，添加诱导精子获能和顶体反应的特定成分，可以褥到活力极高的获能精子，而精予获能所用的培养体系及这些特定物质均成为精子获能效果的影响因素。这些特定成分有高离子强度液(,,,,, ,,,,; ,,,,,,,, ,,,,,,，,，,)、钙离子载体 (,,,,,,,,,, ,,,,,,。，,)、肝素(,;,,,,,)、氨基多糖(,,,;,,,,,,,,,,;,,,，,,,,)、,,,及其他的精子活力激动剂(如咖啡因(;,,,,,,,)等。 目前，牛精子获能所用的基础培养液有好几种，绝大部分以台氏液(,,,,,,?,,,,,,,)、,,液(,,,;,;,,,,,,,,,,,)和,,,,液为基础加以改良。常用的基础培养液组成见表,。牛精子获能普遍采用肝素处理法和;,,，载体法。(,);,抖,律法 细胞外钙离子内流据认为对糟子获能十分重要。,,,,,,,,;,,等(,,,,)发现精子的顶体反应是一个钙离子依赖过程。他们利用钙离子载体(，,)与;,,，形成复合物，携带,,,，流进入精子内，从而诱发精子的顶体反应并 激活顶体酶。处理时添加咖啡因，则获能效果更佳。咖啡因的浓度为,,,,,,,,,,为宜。认虽可有效地诱发各 ,种哺乳动物精子的顶体反应，但，,作用较强， 处理时问过长或浓度过高会导致糟子死亡(刘灵，,,,,)，浓度低于,,,,,,,,时， 不论处理时间多长，均不能诱导牛精子获能(袁建民，,,,,)。 表, 牛体外受精用的各种培养液(,,,) 成分 ,, ,,?,,, ,,, ,,,, ,,,， 九 四 舯 ,,， 弛 抛 弛 ,,,,, 加 揸 ” ,,,，,), 一 一 拇 ,,,,,,, ? 吣 一 ,,,,„ 一 一 坶 ,,,,, ? 呈, 一 ,,,,,, 踟 , 肿 葡萄糖 孙 啪 丙酮酸钠 ? 瞄 钻筋 乳酸钠 , 一 傩 乳酸钙 一 一 一 ,,,(,,,,,) , , ; ,肾上腺素 一 一 一 牛磺酸 一 一 一 青霉素(,,，,,) , 如 ?獬?一蜥一嘴姗螂咖二悸～;,, 一栅九,～,淄,，,:二? , 加堋一?一嘣一踟蛳四, 。二, 链霉素(,,,,,,,) ,, 一 一 一 ,,(,)，,素处基法 ,,,,,和,,,,,,,(,,,,)发现(牛精子体内获能的活性物质是存在于发情期输卵管液中的,,,,。,,,,可促进槽子对钙离子的吸收，从而诱发顶体反应，,,,,诱发糟予体外获能有赖于其硫酸化(肝素是高度硫酸化的,,,，其作用最强。自,,,,,,,等(,,,,)首次报道了应用肝素诱导精子体外获能取得成功之后，相继在牛、猪和山羊上取得成功，其重复性和成功率之高是其他方法所不及的。一般认为，肝素的浓度以,,,,,,,，,,,,,为宜，处理时间为,舶,,,,(如再加咖啡因，还可能提高获能效果 (刘灵，,,,,)。,,等(,,,,)以,,(,,,,的肝素处理牛糖予进行体外受精，移植到,,头受体牛产犊,,头。,,,,,等(,,,,)认为肝素剂量和精子获能的孵育时间是?, ,和胚胎发育的重蜃影响因素。已知肝素结合蛋白存在于精浆，并且射出的精子比附睾精子有更多的肝索结合位点(,,,,,,，,,,,)。有证据表明，肝素结合蛋白通过附着在精子表面，从而使得雌性生殖道中肝素样,,,诱导获能。有人认为，肝素可与精子顶体帽处的质膜结合，刺激精子吸收钙离子，从而诱发顶体反应。除肝索外，其他,,,(如硫酸软骨素)也能诱导精子获能。但其效果不如肝素。 另外，血清白蛋白是血清中主要的大分子物质，现已证明牛、马、兔的血清白蛋 白均可有效地诱导小鼠等试验动物精子的体外获能。其中以牛血清白蛋白(,,,)报道的居多，在同时有丙酮酸钠和乳酸钠存在的情况下，受精率可达,,,,,,,。初步认为，,,,可能具有很强的结合胆固醇和锌的能力。因而可去除精子膜中的部分胆圃醇和锌。调整精子膜的脂肪水平(从而改变了精子膜的稳定性(,,, ,,, ,,,,,,,,，,,,,)。精予一旦获能。,,,可促进其迅速穿透卵子。鉴于上述作用。,,,作为辅助成分，被广泛地应用于牛、猪、绵羊、山羊等家畜的体外获能，但只有,,,是不够的(,,,,,,，,,,,;刘灵，,,,,)。,(,体外受糟过程中提高精于活力方法 精子活力是一项十分重要的指标，它是精子穿透透明带并成功受精的前提。精子头穿透透明带需要精予尾的特别剧烈的推进(超激活)运动。在?,中通常是通过对精子的预处理和添加一些化学试剂来刺激精子的活力。,(,(,糟子的预处理 由于精浆中含有大量对待子品质有重要影响的物质，近年来国外相继展开了除去(或部分除去)精浆后精子冷冻性能的研究，以期提取质量佳的精子，增加精子的运动能力和穿透能力(除去糖液中有害物质(改善精子获能。提高解冻后精子品质。目前对牛精子常用的预处理方法有?精子浮游 处理法(或称上游法)匡),,,;,,,密度梯度离心法?离心洗涤法等.