微流控液滴单分子PCR

微流控液滴单分子PCR n 微流控液滴单分子 PCR# 朱志，王春明，官志超，杨朝勇** (厦门大学化学化工学院化学生物学系，固体表面物理化学国家重点实验 室，分析科学重点 5 10 实验室，福建 厦门 361005) 摘要:近年来，微流控液滴 PCR 技术被广泛地应用于单分子的放大及分析。微流控液滴技术 具有许多优异的特性，如能将反应分割在多个独立的空间内进行，在单分散的液滴中同时进 行多个平行反应，避免了液滴间的交叉污染，消除 PCR 偏好与非特异性放大，以及进行快速 的热循环从而实现高效放大。本文将对近五年来微流控液滴领域的重大技术突破以及它们在 单分子放大分析中的应用如高通量筛选、下一代 DNA 测序技术、稀有突变检测等进行评述。 虽然目前微流控液滴单分子 PCR 目前还在起步阶段，但其已展现了巨大的 应用前景，未来有 望继续为生物医药工程领域在单分子放大分析面临的挑战提供新的解决思 路。 关键词:单分子放大;乳液 PCR;微流控液滴;高通量;稀有突变检测 中图分类号:O652.6 15 Microfluidic Droplets for Single-Molecule PCR ZHU Zhi, WANG Chunming, GUAN Zhichao, YANG James Chaoyong State Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Surfaces, Department of Chemical Biology, Key Laboratory of Analytical Science, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen 20 25 30 University, FuJian XiaMen 361005 Abstract: The application of microfluidic droplet PCR for single-molecule amplification and analysis has recently been extensively reported. Microfluidic droplet technology has the advantages of compartmentalizing reactions into discrete volumes, performing highly parallel reactions in monodisperse droplets, reducing cross-contamination between droplets, eliminating PCR bias and nonspecific amplification, as well as enabling fast amplification with rapid thermocycling. Here, we have reviewed the important technical breakthroughs of microfluidic droplet PCR in the past five years and their application to single-molecule amplification and analysis, such as high-throughput screening, next generation DNA sequencing, and quantitative detection of rare mutations. Although the utilization of microfluidic droplet single-molecule PCR is still in the early stages, its great potential has already been demonstrated and will provide novel solutions to today’s biomedical engineering challenges in single-molecule amplification and analysis. Keywords: Single-molecule amplification; emulsion PCR; microfluidic droplets; high-throughput; rare mutation detection 35 0 前言 有选择性地针对单分子尤其是单个生物分子的灵敏检测对化学、生物、医疗以及环境科 学都有着重大而深远的影响[1-3]。 对比于群体研究的方法，针对单分子的研究能够表征单个 分子在时间轨道和状态分布等方面的具体信息，从而可以深入探讨化学和生物反应的过程和 40 途径[3-6]。例如，核酸分子对细胞的生理功能其着广泛的作用:可以调节和沉默基因表达， 是分子机器的结构组成，同时还可以精确控制细胞的行为[7-9]。因而，单分子水平上对于基 因表达的灵敏检测将在生物医学的基础研究、药物开发和医学诊断等方面起到重要的作用 [7-9] 分类似的相关基因也是单分子基因检测的必须要求[10, 11] 基金项目:教育部高校博士点基金(200803841013 作者简介:朱志，女，副教授，主要研究方向:DNA 分子工程、微流控技术。 通信联系人:杨朝勇，男，教授，主要研究方向:微流控技术，DNA 分子工程，化学生物学。 E-mail: cyyang@ -1- n 45 50 55 析方法就是聚合酶链反应(PCR)。PCR 具有将目标物放大几个数量级的能力，甚至可以由 单拷贝的基因得到成千上万条产物链[12-15]。 与微全分析技术和芯片实验室紧密结合的微流控技术近年来得到了大力的发展，对现代 化学和生物领域有着革新性的意义。微流控技术具有许多优点，包括减少样品试剂消耗量、 进行高通量分析、加快反应速率和热传递、以及制作廉价便携的装置等。微流控技术的一个 重要分支就是利用不互溶的两相产生离散体积的液滴微流控技术。液滴微流控可以超高通量 地产生 nL 至 pL 的均匀液滴，在不增加装置体积和复杂性的前提下，可在液滴中同时进行 大量化学反应。在过去的十年中液滴微流控技术已被广泛地应用于材料合成、分子筛选、蛋 白结晶、药物运输、以及单分子单细胞分析等方面[16-20]。 本文主要综述近年来液滴微流控技术在单分子 PCR 方面的发展和应用。首先，我们将 简要介绍传统的单分子 PCR 技术及其局限性;其次，详述液滴微流控在该研究方向的突破 性进展;最后，提供几个由此展开的新的研究领域。关于液滴微流控的更为 全面的综述可以 在参考其他文献[16, 21-24]。 1 传统 PCR 及其在单分子分析方面的局限性 自 1983 年 Kary Mullis 发明了 DNA 指数放大的 PCR 技术[25, 26] 60 65 室的必备，并且对生命科学及其相关领域，如生物、医学、临床、法医学等，产生了革命性 的影响。由于其几个数量级的放大能力，PCR 是单分子基因检测方面最有前景的技术[12-15]。 然而，为了实现单分子分析，传统 PCR 必须满足非常苛刻的实验条件以达到最大产率，同 时又要避免非特异性扩增[27]。此外，传统 PCR 需要消耗大量的昂贵试剂，更存在着短序列 的放大偏向性，这对于低模板浓度的单分子分析的影响是致命的[13, 15]。传统 PCR 的通量性 也被实验空间和长热循环时间所限制，很难实现高通量的分析[27]。 为了克服这些缺点，科学家们也提出并进行了一些尝试性改进以期实现单分子放大分 析。例如，采用嵌套式引物的两次或多次相继 PCR 技术可以消除影响 PCR 效率的非特异性 产物，达到单分子分析的灵敏度[28, 29] 容易造成交叉污染。随后，人们意识到反应体积是单分子 PCR 的一个关键 因素[30]。Kalinina 70 75 80 及其小组利用玻璃毛细管进行 nL 的 PCR 放大和 TaqMan 探针荧光检测放大产物，实现单分 子检测[30]。同时，随机 PCR 单分子放大和毛细管电泳检测在微流控上的整合也为单分子检 测提供了一种新思路[31]。这些微型装置通过减少反应体积增加了初始 DNA 模板的有效浓度。 但是，由此带来的高比表面积增加了管道表面和试剂、样品的接触，导致 PCR 抑制和污染。 当作用于单个 DNA 模板时，这一问题尤为严重。此外，对于装置和技术的特殊要求也大大 限制了这些方法在单分子检测的通量性。 为了进一步降低反应体积同时保持 PCR 效率和通量性，发展了单分子微乳 PCR(ePCR) [32] 于一个 2-10 μm 的液滴，其体积大约为 4.2 fL - 0.52 pL，单分子 DNA 在这样体积中的有效 浓度可高达 3.2pM - 0.4nM，足以进行单分子 PCR。较高的有效 DNA 模板浓度大大减低了 引物二聚体的影响，提高了 PCR 的特异性[33]。液滴周围的疏水油相也有效地防止液滴内的 样品和反应容器壁的接触。虽然 ePCR 可以实现单分子放大，但是随后的高通量处理和分析 却很难实现，因为去除油相后液滴将相互融合失去单克隆性。 为了解决这些问题，科学家开发了一种称为 BEAMing 的技术[34, 35] 每个微乳液滴中都含有一个大量引物共价相连的磁珠和单分子 DNA 模板。 DNA 模板在磁 -2- n 85 珠表面被复制放大，从而使得几千个 DNA 放大产物被固定在磁珠上，防止了去除油相后不 同液滴中 DNA 产物的混合。磁珠的采用可以在后续处理中很好地保持液滴的单克隆性，利 用流式细胞术或光学扫描技术可在几分钟内分析成千上万的磁珠。技术上的革新使得高背景 下稀有变异基因的定性和定量分析成为可能，同时也直接促使了二代高通量 DNA 测序的发 展[36, 37] 。在理想状态下，每个液滴中应该只含有一个磁珠以及相同体积和含量的模 板和试 90 95 100 105 110 115 剂，使得每个液滴中的反应条件相似，从而保证可靠和有效的结果。然而，目前常用的液滴 产生技术，如剧烈的搅动，导致液滴产生的单分散性差、尺寸不均匀，从而使液滴中 PCR 试剂的含量不均且仅有一个磁珠的液滴产率低。这些因素的直接结果就是低 PCR 效率、不 均匀放大、短 DNA 放大产物(,250bp)，同时也大大减少了液滴中成功进行的平行反应 数量，产生较多无用液滴[38]。 2 液滴微流控 PCR 微流控技术能够以每秒钟几千个的速度产生单分散性好的液滴，同时又能很好地控制液 滴的尺寸和成分。由于液滴在微尺寸上的大比表面积，热和物质在液滴中的传递时间短，有 利于反应快速进行。类似油包水微乳，液滴中的样品与管道壁的不利接触被油相阻止。液滴 微流控实现了单个液滴的混合、传输和分析的独立控制，在单个实验中快速产生大量均一的 液滴，使得大量平行反应能够在短时间内快速进行，并具有很好的重现性。 基于以上的优点，液滴微流控被很好地应用于 ePCR，将反应分割在离散体积中，可以 同时进行大量平行反应，减少液滴间的交叉污染，消除 PCR 偏向性和非特 异性扩增，且液 滴中的放大反应和热循环速度也得到提高。在此，我们将小结近年来基于液滴微流控技术的 单分子 PCR 实例。 2.1 无磁珠的芯片液滴微流控 ePCR Beer et al. 报道了第一例 ePCR 和微流控技术的成功结合[39]，构建了一个芯片数字微流 控实时 PCR 仪器，在单一通道内产生单分散液滴、进行热循环放大、同时实时监测每个液 滴中的扩增结果。如图 1A 所示，单分散的油包水液滴由交叉流 T-管道产生，产生速率 1 kHz， 液滴直径依实验条件不同在 24-31 μm 间，误差 1 μm。图 1B 展示了仪器中液滴产生、热循 环和荧光检测的整合。其中，一个芯片外的阀门系统可以暂停液滴的产生，使得液滴在管道 内停止流动，进行芯片上的热循环和荧光监测。由于反应体积减少了 6 个数量级，减少了试 剂的消耗量，降低了 PCR 循环的荧光阈值，实现了单分子 DNA 放大检测(图 1C)。随后， 他们利用类似的系统进一步发展了芯片上的单分子液滴反转录 PCR[40]。这一仪器的开发大 大提高了单分子 PCR 的通量，实现了复杂体系中的 DNA、RNA 和病毒的分 离及单分子单 细胞的检测。 -3- n 图 1:芯片上的单分子实时液滴 PCR[39]。(A)管道的设计和流体构造。(B) 实时液滴 PCR 的装置原理 120 125 130 135 图。(C)实时液滴 PCR 数据对比:每个液滴中分别含有 7、0.06 和 0 个 DNA 拷贝。 Fig. 1 On-chip, real-time, single-molecule PCR in picoliter droplet reactors [39]. A Overall channel and flow configuration. B Schematic of the integrated instrument for real-time PCR in droplets. C Real-time PCR data from picoliter droplets at an estimated 7, ~0.06, and 0 copies of genomic DNA per single droplet, respectively. 然而，上述装置需对整个装置进行加热，限制了热循环的速率和通量。为了 进一步提高 单分子液滴 PCR 的通量，科学家们提出了一些新的装置设计。Kiss et al.设计了一种连续流 体的实时 PCR 体系(图 2)[41]。如图 2B 所示，该装置利用流动聚焦技 术以 500/s 的速率产 生成大量含有 DNA 模板和 PCR 试剂的液滴，然后这些液滴在流动油相的带 动下在芯片内流 动，依次交替穿过芯片上固定加热器控制的变性区和退火区。这一装置的优 点在于加热区域 固定，无需对整个芯片进行热循环，从而可以获得更短的热循环时间(55s/ 循环)和更高的 PCR 效率。通过在芯片内设计周期性地只能通过单个液滴的瓶颈区域，整个 PCR 放大的过 程可以在这些特殊的区域被实时监测(图 2C)。该装置实现了对一条 245-bp 的 DNA 进行 放大，完成 35 个循环仅耗时 35 分钟，而且 DNA 的最低浓度可以达到 167 个液滴中只有一 条模板 DNA，成功地证明了流动 PCR 芯片在高通量单分子 DNA 放大和定量 上的应用。 图 2:连续流体液滴 PCR 芯片[41]。(A)装置的整体示意图。(B)液滴在 喷嘴处产生的图像。(C)均匀 液滴在管道内的流动和单个液滴依次通过瓶颈的图像。 Fig. 2 Image of continuous flow droplet PCR chip[41]. A Schematic of the overall flow configuration. B Optical image of droplet generation at the nozzle. C Optical image of uniform droplets in the downstream channel and flowing through one of the neckdowns. -4- n 140 145 150 155 160 图 3:圆盘式连续流体液滴 PCR 芯片[42]。装置包括油相进口(A)和两个 水相进口(B1 和 B2)，在 T-管 道(C)中产生液滴。液滴经过中心加热区(D)变性，然后驶往周围低温区 (E)进行退火和延伸。随后 液滴再次回到中心区开始一个新的热循环。最后 34 个循环结束，液滴离开 装置(F)。 Fig. 3 Design of the continuous-flow radial PCR device for single-molecule DNA amplification[42]. The device contains an oil inlet A that joins two aqueous inlet channels B1 and B2 to form droplets at a T-junction C . The droplets pass through the inner circles in the hot zone D to ensure initial denaturation and travel on to the periphery in 200-μm wide channels where annealing and extension occur E . The droplets then flow back to the center where the DNA is denatured and a new cycle begins. Finally, the droplets exit the device after 34 cycles F . 同时，Schaerli et al. 报道了另一种流动液滴 PCR 芯片的设计[42]。如 图 3 所示，他们设 计了一种圆盘式的芯片，中心部位为 DNA 变性的加热区，周边为 DNA 退火 和延伸的低温 区。液滴由交叉流 T-管道产生，然后在流动油相的推动下从中心流向外围 再流回中心区域， 依次循环，通过各个温度区域，完成 PCR 的热循环。利用罗丹明 B 的荧光寿命成像来监测 液滴内的温度，从而可以精确控制各个区域的温度，确保 PCR 效率。但是，最终产物的分 析需要在芯片外通过凝胶电泳、实时 PCR 或者测序来完成。这一装置可以实现 17 分钟内对 85-bp 的 DNA 实现 34 个 PCR 循环，最低浓度为每个液滴中含有 0.3 个 DNA 模板。对长链 DNA(505-bp)的放大效率不是很高。上述两个实例证明了液滴中的高通量单分子 DNA 放 大，为液滴微流控 PCR 的发展开辟了道路。 2.2 基于磁珠的液滴微流控 ePCR 如前所述，从简单的 ePCR 到更为广泛应用的 BEAMing 技术，PCR 放大的后续高通量 分析和处理得到了大幅提高。因此，自从实现了微流控液滴技术上的 ePCR，科学家们一直 在探索 BEAMing 技术和液滴微流控的结合途径，以期实现可控的液滴产生、便捷的操作和 -5- n 灵活的后续分析处理。近年来终于在这方面有了一些突破性进展。 将磁珠应用于液滴微流控的最大难点在于液滴产生过程中磁珠容易在注射器内沉降。 165 170 175 180 185 Kumaresan et al. 通过在玻璃-PDMS-玻璃的杂和液滴产生器(μDG)的三通阀中引入隔膜泵， 成功地解决了这一问题，实现对液滴尺寸、产生速率、磁珠传输和包裹的控制(图 4)[38]， 从而发展了一种高通量单拷贝的基因放大技术(SCGA)。在芯片上，DNA 或者细胞、固 定有引物的磁珠和 PCR 试剂被一同包裹进液滴中。然后在芯片外完成 PCR 放大过程，破乳， 收集磁珠，便于后续分析处理。该研究小组报道了首例 在磁珠上从单拷贝模板获得 100 amol 大于 600 bp 的 DNA 放大产物，可直接应用于二代 DNA 测序和高通量单细胞基因分 析。 图 4:单拷贝基因放大技术(SCGA)[38]。(A)在芯片上产生含有 DNA 或细胞、磁珠和 PCR 试剂的液滴， 收集于试管中进行热循环。(B)每个有效的液滴中含有反向引物共价相连的磁珠、荧光染料标记的正向引 物和单拷贝的靶标 DNA。PCR 反应在磁珠表面产生荧光标记的双链 DNA 产物。(C)装置示意图，包括 PCR 溶液进口、两个油相进口和液滴出口(红色)。三层结构的空气泵与芯片相整合，用于控制 PCR 试剂 的传输。(D)三种条件下 PCR 效率的对比:380 bp , 175 amol/bead , 624 bp , 155 amol/bead , and 1139 bp , 10 amol/bead 。(E)流式细胞术对 624 bp 产物的分析:每个液滴中 含有 1 个(上图)或 0 个模板(下 图)。 Fig. 4 Single copy genetic amplification SCGA [38]. A Monodisperse droplets containing target DNA or cells, beads and the PCR reagent blue are formed in a carrier oil yellow at the cross-injector and routed into a tube for temperature cycling. B Each functional PCR droplet contains a bead covalently labeled with the reverse primer, dye-labeled forward primer, and a single target copy. Subsequent steps of PCR generate dye-labeled double-stranded product on the bead surface. C Layout of the device, showing the PCR solution inlet, the two oil inlets, and the droplet outlet ports red . A three layer glass-PDMS-glass pneumatically controlled micropump is integrated on-chip to deliver PCR reagent. D Comparison of PCR yields for 380 bp , 175 amol/bead , 624 bp , 155 amol/bead , and 1139 bp , 10 amol/bead amplicons. E Flow cytometry analysis of beads carrying a 624 bp product amplified from 1 template per droplet upper and 0 template per droplet lower . -6- n 190 195 200 205 210 215 220 图 5:微流控微乳产生阵列装置(MEGA)[43]。(A)4 通道的 MEGA 装置示 意图，三通阀空气泵控制着 4 个喷嘴的液滴产生。(B)32 通道的 MEGA 装置示意图，8 个空气泵阵列控 制着 32 个喷嘴的液滴产生。(C) 96 通道的 MEGA 装置示意图，左上方是含有 4 个 T 型喷嘴的单个结构单 元示意图，右上方显示了三对共 轴阀门和沟槽组成的空气泵结构。(D)96 通道的 MEGA 装置内部构造详图， 由树脂玻璃构成的模块控制 油相的进口和收集微乳液滴。(E-F)96 通道 MEGA 装置用于细菌 O157 的 检测，结果与输入值一致:(E) 0.94/103 vs 1/103 10 cpd 和(F) 0.85/104 vs 1/104 100cpd 。 Fig. 5 Microfluidic emulsion generator array MEGA devices [43]. A Layout of a glass/PDMS/glass hybrid four-channel MEGA device with a pneumatically controlled three-valve micropump integrated to drive four nozzles for droplet generation. B Design of a 32-channel MEGA device using an array of eight identical micropumps to operate 32 nozzles simultaneously. C Layout of 96-channel MEGA on a 4 in. wafer composed of a single ring pump and 96 droplet generators. Inset: close-ups of a single repeating unit composed of four T-shaped nozzles left and the pump structure schematically showing three pairs of coaxial ring-shaped valves and displacement trenches right . D Exploded view of the complete four-layer 96-channel MEGA device and the plexiglass assembly module used to infuse oil and to collect the generated emulsion. E-F E. coli O157 detection using a 96-channel MEGA shows the measured O157 ratios consistent with the inputs: E 0.94/103 vs 1/103 10 cpd and F 0.85/104 vs 1/104 100cpd . 第一代的 μDG 的最大缺陷在于液滴的产生效率较低，仅为 6 Hz。为了拓 展 μDG 的应 用，必须提高其液滴产生的通量性，从而可以在高背景下对低频目标物进行 检测。由此，单 通道的 μDG 被升级为 4、32、或 96 的多通道装置(MEGA)， 最多每小时 可产生 340 万 个 nL 液滴[43]。如图 5 所示，芯片上的隔膜泵提高了足够的动力同时产 生多个液滴，对称性 的设计保证了流体的传输。利用这一装置，该研究小组证明了针对不同细胞 和靶标的多元单 分子 PCR。由于采用了较大的磁珠(34 μm)，其表面可以被有效地固定上 多种不同的正向 引物，PCR 混合试剂中含有不同荧光染料标记的反向引物。单个细胞、磁珠 和 PCR 试剂被 包裹进每一个液滴中，然后进行 PCR 热循环放大，破乳收集磁珠，随后通过多色细胞流式 仪进行快速分析。该方法实现了在 1/105 的高背景下的病原体识别和定量，证明了多元 MEGA 技术在单分子和单细胞水平上的高通量、大规模的定量分析应用。 2.3 基于琼脂糖液滴微流控的单分子 ePCR 由于附着引物的磁珠可以将单分子或单细胞 PCR 得到的扩增产物固定在磁珠上，大大 便捷了后续高通量的分析和处理。然而，磁珠导致的空间位阻和电荷排斥也给 PCR 带来了 一系列问题，包括低 PCR 效率( 磁珠 ePCR 的效率仅为 40% [38])和短 PCR 扩增产物。而 且，根据泊松分布，当模板浓度较稀时，同时含有目标分子和磁珠的有效液滴产率很低，大 量的液滴仅含有目标分子，或仅含有磁珠，或为空液滴，导致试剂浪费，也影响 PCR 效率 。 -7- n 225 230 235 240 245 250 图 6:基于琼脂糖液滴微流控的单分子 ePCR[44]。(A)琼脂糖微乳液滴微 流控用于单分子基因分析的示意 图，系统稀释的模板被包含在 nL 的油包琼脂糖液滴，进行热循环 PCR 放 大，随后降温将琼脂糖液滴固化 为琼脂糖微球，便于后续的基因分析。(B-C)琼脂糖微球的荧光显微镜成像: (B) 1.5 和 (C) 0 拷 贝/微球。(D)微球包含 PCR 产物的比例，泊松分布得到的理论值(蓝色) 与实验值(绿色)基本相符。 Fig. 6 Agarose droplet microfluidics for single-molecule emulsion PCR[44]. A Schematics of the agarose emulsion droplet microfluidic method for single copy genetic analysis. Statistically diluted templates are encapsulated into uniform nanolitre agarose-in-oil droplets, which are then thermally cycled for PCR amplification. Following ePCR, the droplets are cooled to gelate to agarose beads for downstream genetic analysis. B-C Fluorescence microscope images of agarose beads after amplification from template concentrations of B 1.5 and C 0 copy/bead. D Percentage of microbeads carrying PCR product. The theoretical value blue was calculated according to Poisson distribution and the observed value green was the statistic result according to the experimental data. 为了解决这些挑战性问题同时保持 DNA 在液滴内的单克隆性，我们研究小组最近利用 琼脂糖取代传统的磁珠作为 DNA 的载体[44]。如图 6 所示，利用流动聚焦技术产生的油包琼 脂糖液滴中包含有琼脂糖溶液、PCR 试剂和 DNA 模板。琼脂糖有一个非常特殊的热响应溶 胶-成胶转变特性。琼脂糖在所有的 PCR 温度区域均以液态存在，从而避免了固相空间位阻， 使得 PCR 能高效进行。随后，简单地将琼脂糖液滴降温至低于其凝胶点，使琼脂糖从液态 转变为凝胶态，即可形成琼脂糖微球。由于，PCR 正向引物已被固定在琼脂糖上，放大得 到的产物也就被固定在琼脂糖微球中，从而类似磁珠的效果，保持了扩增产物的单克隆性， 便于后续的灵活分析和处理，例如流式细胞术、DNA 测序以及长期保存等。该方法不需要 同时包裹模板和含有引物的磁珠，保证了高通量的有效液滴产生(~500 Hz)和高 PCR 效率 (,95 %)，为单拷贝基因分析研究提供一种新的思路。 3 液滴微流控 PCR 的应用 最近，液滴微流控 PCR 在技术方面的迅速发展已经证明了该技术的优越性并被广泛地 应用于生物、化学等领域，尤其在单分子放大和分析方面的优势更加明显。在此，我们将主 要介绍该技术在三个重要科学领域的应用。 -8- n 3.1 高通量筛选 近几十年来，生物学家一直致力于开发高通量筛选的各种技术，以期从较大的文库中获 得更多功能性的基因和蛋白[45-47]。其中一种特别的技术是的指数富集配体系统进化技术 255 260 265 270 275 280 (SELEX)，通过筛选获得针对靶标具有高结合力和高选择性的 DNA 或 RNA 的核酸适配 体[48-52]。SELEX 技术的核心是从一个含有 1014-1016 条单链 DNA 的文库中进行 8-30 轮的筛 选和放大，逐步富集得到核酸适配体[48-50]。经过多轮的筛选后得到的富集 DNA 文库将被克 隆进质粒，转染进细菌。然后细菌培养，挑选单克隆菌落，进行 DNA 测序，获得核酸适配 体的候选者。利用生物统计学的分析方法，可能的候选者将被化学合成出来，然后逐一表征 其结合力和特异性。这样的过程耗时费力、低效且昂贵。 图 7:基于琼脂糖液滴微流控技术的核酸适配体筛选[53]。(A)实验图，由传统 SELEX 获得的富集文 库被分散进单个的琼脂糖液滴中，进行单分子液滴 PCR，随后降温将琼脂糖液滴固化为琼脂糖微球，用 SYBR 绿色染料对 DNA 进行染色，挑选出高荧光的微球，对每个微球中的 DNA 进行结合力的考察，鉴别 核酸适体序列。(B-C)PCR 放大后 SYBR 绿色染料染色后的琼脂糖微球的显微镜成像:(B) 0 和 (C) 1.5 拷贝/微球。(D-E)流式细胞术对单克隆微球中的 DNA 对 Shp2 蛋白(D)和 GST 蛋白(E)的结合力 考察。 Fig. 7 Aptamer screening by agarose droplet microfluidic technology[53]. A Schematic working-flow. Single DNA sequences of an enriched library obtained by traditional SELEX are encapsulated individually into agarose droplets for high-throughput single copy DNA amplification. The resulting agarose droplets are cooled to become agarose beads and stained with SYBR Green in order to pick out high fluorescent beads containing DNA colonies. Binding affinity of DNA in each fluorescent bead against target molecule are screened and aptamers are identified. B-C Microscope images of agarose beads after PCR amplification and SYBR Green staining at DNA template concentration of 0 B and 0.3 copies/droplet C . D-E Binding assay of DNA in clonal beads with Shp2 protein D and GST protein E monitored by flow cytometry. 为了解决上述问题，最近我们发展了一种基于琼脂糖液滴微流控的 ePCR 技 术，直接从 复杂的单链 DNA 文库中筛选核酸适配体[53]。如图 7A 所示的实验流程图， 针对癌症标志物 Shp2 蛋白进行筛选获得的 DNA 富集文库被系统稀释并在芯片上被包裹进 单个琼脂糖液滴 中，使得每个液滴至多含有一条 DNA 序列，通过 PCR 进行放大扩增，产生 单克隆的琼脂糖 微球。DNA 染色后，含有 DNA 的明亮微球被挑选出来(图 7B-C)。利用高通量的荧光流 式细胞术，对单克隆微球中的单链 DNA 进行结合力表征(图 7D-E)。 那些具有高结合力 -9- n 和特异性的单链 DNA 序列被挑选出来作为核酸适配体，或者被 DNA 测序，或者即可直接 用于后续的生物医学实验。与传统的克隆-测序-合成-表征的实验流程相比，我们的方法利用 285 290 液滴微流控的分割性，从含有大量序列的 DNA 文库中获得仅含有单一序列的液滴，在未知 序列信息的前提下，对每一条序列进行表征，使得整个过程更加快速、有效、经济。该方法 还可以进一步推广应用于其他分子进化技术，如 mRNA 展示、噬菌体展示等等。 3.2 下一代 DNA 测序 DNA 测序已被广泛地应用于诊断学、生物技术、法医生物学、生物信息学等领域[7, 54, 55]。 人类基因组工程也已与 2003 年顺利完成。然而，为了将 DNA 测序技术真正应用于人们日 常的医学诊断和医疗保健，高准确性、长程连续性、高通量及低成本依旧是必须解决的问题， 也是科学家发展下一代测序技术的主要目标。其中，消除传统的克隆技术 DNA 文库准备法 是下一代测序发展的首要解决问题。基于 BEAMing 的微乳技术已经成为快速、经济的取代 法[34, 35] 。但是，由于产生的微乳体积小且不均匀，该方法依旧存在着非特异性扩增、 放大 295 300 305 链长有限(,250 bp)等许多问题 。Kumaresan et al. 发展了一种高通量的 SCGA 技术，并 证明了它在 DNA 测序方面的应用[38]。芯片上可以很容易地产生均匀且尺寸可控的液滴(2-5 nL)并包含有 34 μm 的磁珠。与 BEAMing 技术中小磁珠和小液滴相比，大磁珠具有更大 的表面积可以标记上足够多的正向引物(大约每个磁珠上 4.4 fmol 正向引物)，同时反向引 物等其他 PCR 试剂的含量也达到 10 倍过量，保证了 PCR 的效率[43]。如图 4D-E 所示，每个 磁珠上可产生 ,175 amol 的 380 bp DNA 产物， ,150amol 的 624 bp DNA 产物，或者, 10 amol 的 1139 bp DNA 产物。其中从单一磁珠得到的~100 amol 的 624 bp DNA 产物已经 足够直接用于 amol-尺度的桑格测序[56]，从而证明了 SCGA 技术可以从单一 DNA 模板扩增 放大获得含有足够量长链 DNA 的磁珠直接用于下一代桑格测序和焦磷酸测序法[57-60]。 3.3 稀有突变的定量灵敏检测 基因改变，例如删除、定点突变和重组等，在癌症的发生和发展中起着重要的作用，也 被认为是癌症诊断中的生物标记物[10, 61] 尿液中，就要求这些突变的检测常常要在大量正常细胞释放的非突变 DNA 的高背景下进行。 因此，一种能够利用临床样品，进行简单、高灵敏、定量检测突变型和野生型比例的方法是 非常必要的。 310 315 320 针对这些低频基因突变的检测，为了获得统计学上有意义的数据，必须进行高通量的分 析。Zeng et al. 利用他们开发的含有 4、32 和 96 通道的高通量微乳产生阵列(MEGA)定 量检测了野生型和突变型细胞和细菌[43]。其中以细菌为例，在正常细菌 K12 的高背景下， 检测致病菌 E. coli O157。磁珠表面被标记上了针对不同基因的多种正向引物用于液滴 PCR。 通过提高每个液滴中细胞的数量(cpd)，从 0.2 cpd 到 10 cpd，甚至 100 cpd，需要处理的 液滴数量得到 50 倍或 500 倍的降低。如图 5E 所示，在检测千分之一(1/103)的 E. coli O157 细胞时，每个液滴中含有 10 个细胞(10 cpd)，9492 个液滴被分析处理得到 88 个阳性结果， 比例为 0.94/103。为了进一步降低检测限，每个液滴中包含了 100 个细胞(100 cpd)，在检 测万分之一(1/104)的细菌时得到的结果是 0.85/104 (图 5F)。值得一提的是，当使用 96 管道的 MEGA 时，5 分钟内即可产生包含 104 细胞量的液滴。最终，该方法的检测限达到 3/105 ，准确度为 99%。 这些结果证明了高通量的微流控平台可以在复杂体系中实现单分 子和单细胞水平的定量基因型研究。 - 10 - n Pekin et al. 设计了另一种液滴微流控 PCR 方法，应用于高背景下的灵敏定量检测突变 DNA [62]。如图 8 所示，在微流控系统中，单个 DNA 靶标和 PCR 试剂一起被分散到每个液 滴中，利用红色和绿色的两种荧光 TaqMan 探针分别标记突变型和野生型的 KRAS 基因。液 325 330 335 340 345 350 滴在芯片上产生后被收集在试管中，进行芯片外的热循环 PCR 放大，然后再重新注射进芯 片中，在芯片上用激光激发逐一读出每个液滴中的红绿荧光信号，并且从红绿荧光的比例定 量获得突变型和野生型的比例。利用 pL 液滴的单分子分割性和芯片上快速的荧光分析，该 方法实现了几种癌症突变基因的检测，最低可在分析,106 个荧光液滴的条件下检测到 20 万个野生型基因中的一个突变型。如果分析更多的液滴，将有望提高检测灵敏度。此外，该 装置还可被推广应用于多靶标的同时定量检测。最近， Hindson et al. 报道了另一种液滴数 字 PCR 体系，并证明了在 10 万个野生型基因背景下的单个突变型灵敏检测[63]。他们更进一 步提出了在血浆中的循环 DNA 的绝对定量检测方法。因此，这些高灵敏的定量方法还可被 应用于其他复杂体系的检测，如传染病的检测、等位基因的鉴定、基因翻译的分析等等。 图 8:液滴微流控 PCR 应用于稀有突变的检测[62]。(A)微流控装置上生成微乳液滴，包含有 gDNA、PCR 试剂和分别标记野生型和突变型基因的 TaqMan 探针。(B)产生的液滴被收集在 PDMS 密封的小试管中 进行热循环 PCR。(C)液滴又被重新注入微流控芯片中，分析每个液滴中的 荧光信号。(D-F)荧光共聚 焦成像对液滴进行分析:从单一野生型 KRAS 细胞得到的 gDNA(D，红色)， 从单一突变型 KRAS 细胞得 到的 gDNA(E，绿色)，从杂合细胞中得到的 gDNA 含有突变型和野生型(F， 红色和绿色)。 Fig. 8 Microfluidic droplet PCR for rare mutations detection[62]. A An aqueous phase containing the gDNA, PCR reagents and TaqMan probes specific for the wild-type and mutant genes is emulsified within a microfluidic device. B The emulsion is collected in a PDMS sealed tube and thermocycled. C The emulsion is then reinjected onto a microfluidic chip, and the fluorescent signal of each droplet is analyzed. D-F Fluorescence confocal microscopy analysis of thermocycled droplets. gDNA extracted from homozygous cell-lines bearing wild-type KRAS alleles SW48 D, red , mutant KRAS alleles SW620 E, green , and a heterozygous cell-line bearing both mutant and wild-type KRAS alleles H358 F red and green were analyzed by fluorescence confocal microscopy. 4 结论 液滴微流控技术极大地改变了传统的 PCR 技术，尤其是在单分子 DNA 扩增 放大方面。 微流控技术保证了对液滴尺寸和组分的严格控制，也可以独立地对每一个液滴进行混合、传 递、和分析等操作。其次，由于在微尺度上的高比表面积，液滴可以减少热量和物质传递的 时间，加快 PCR 反应，有利于快速的医学诊断和野外检测。再次，作为载体的油相可以很 - 11 - n 好地阻断液滴内样品与管道壁的接触，避免了液滴间的交叉污染、模板损失和 PCR 偏好。 此外，一次实验中能快速地产生大量均匀相同的液滴，从而可在短时间内完成大规模的平行 355 360 365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 实验和反应，并具有很好的重现性和单分子定量分析的能力。虽然液滴微流 控 PCR 的发展 和应用还刚刚起步，它已经在单分子 PCR 放大方面展现出了巨大的潜能， 未来应向着更为 精巧和多功能的方向发展，例如系统的集成、装置的设计优化、装置的制造、 以及系统的自 动化等。 致谢 感谢国家自然科学基金以及高等学校博士学科点专项科研基金对本工作的 支持。 [参考文献] References [1] X. S. Xie, J. Yu, W. Y. Yang, Science 2006, 312, 228. [2] C. E. Sims, N. L. Allbritton, Lab on a Chip 2007, 7, 423. [3] G. W. Li, X. S. 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