晚期肺腺癌患者EGFR基因突变检测及化疗疗效观察

晚期肺腺癌患者EGFR基因突变检测及化疗疗效观察 南方医科大学级硕士学位 晚期肺腺癌患者基因突变检测及化疗疗效观察课题来源: 自选 业 专 名 称 心胸血管外科 刘德纲 学位申请人 指 导 教 师 蔡开灿教授 答辩委员会主席 闫玉生教授 答辩委员会成员 曾伟生教授 谷力加教授 杨锡耀教授 王振康教授 论文评阅人 傅剑华教授 吴旭教授日 年月 广州燃 硕士学位论文 晚期肺腺癌患者基因突变检测及化疗 疗效观察 硕士研究生:刘德纲 指导教师:蔡开灿 摘要 背景:肺癌是一种严重威胁人类健康的疾病,全球每年新发病例约万, 如果我国吸烟和空气污染不能及时得到控制,至年,我国每年肺癌新发患 者数将超过万,成为世界第一肺癌大国。中国疾病预防控制中心最近发表的 文献报道显示,最近几年我国肺癌患者的发病率上升较快,而且肺癌患者的死 亡率亦明显上升。肺癌患者发病年龄也有所提前,越来越多年轻患者发病。近 年以来,我国常见的癌症变化很大,肺癌患者在世纪年代的死亡人数占 所有癌症患者死亡总数的第四位,至年,已跃居至第一位,上升幅度最大, 而且呈现出持续升高的趋势。与国外类似,我国肺癌患者的发病率及死亡率也 呈现出男性高于女性,城市高于农村的趋势。而且,我国肺癌患者的发病率及 死亡率也是从岁开始上升,到岁达到最高峰。还有研究显示,肺癌患 者早期症状轻微,不典型,和常见疾病相似,容易被忽视,一旦出现明显症状 才去就诊,往往就比较晚期,治疗效果也较差。因此,早期治疗是提高肺癌患 者预后的主要办法。最近年,随着科学的发展,医学影像学有了明显进步, 更多患者能够在早期就被发现,临床治疗也有了较大改善,能行根治手术的肺 癌患者的年生存率能达到%.%,但是肺癌总的年生存率在发达国家也只 有%,我国更是低于%。究其原因,主要是绝大多数患者就诊时已属晚期, 失去外科手术治疗的机会。非小细胞肺癌占肺癌总数的%是最常见的肺癌类摘要 型,也是威胁肺癌患者生存的最主要原因。根据年发布的肺癌国际分 期可将肺癌分为:.?期,期指原位癌,?期指有远处转移,常见的远处 转移部位主要有脑、全身骨骼、双侧肺叶、肝脏、双侧肾上腺。.期的非小 细胞肺癌患者约占所有肺痛患者的%,这部分患者可以行根治性手术,年生 存率为%.%,和期的非小细胞肺癌患者约占%,其中期的患者 有可能能行根治性手术,但年生存率也只有%.%,期及?期肺癌患者 因为有局部转移或远处转移是不能行根治性手术的。期患者即使可以行手 术治疗,但除了和部分期外,都推荐术后给予化疗,及?期非小细胞肺 癌患者只能选择传统化疗或加局部放疗。而期伴高危因素的肺癌患者术后也 需给予化疗,高危因素包括:低分化腺癌包括肺神经内分泌病、脉管侵犯、 脏层胸膜受侵犯、楔形切除术后、、肿块。这点已取得了初步共识。非 小细胞肺癌患者目前的标准化疗为:铂类药物加上第三代化疗药物即紫杉 醇、吉西他滨、长春瑞宾。一般化疗效果较差,有效率只有%.%,中位总 生存期也只有约个月,年生存率仅%。而且一线化疗后患者绝大部分很快 会出现疾病复发,所以一般都需要二线治疗,二线化疗主要为多西他赛或培美 曲塞单药化疗,有效率更是低于%。近年来,大量临床研究都证实表皮生长因 子酪氨酸激酶抑制剂作为二线治疗药物效果不比化疗差,而且毒副反应轻,但 是由于其价格昂贵,限制了在临床使用。生物靶向治疗是目前非小细胞肺癌研 究的一个热点。靶向治疗有更高的选择性,因此毒副反应小,是今后肿瘤治疗 的新趋势。肺癌分子靶向治疗常用的治疗靶点有:细胞受体、信号传导和抗血 管生成等,其中表皮生长因子受体是目前最为主要的靶点,有多种药物 均是针对此靶点,且在临床试验或临床应用中取得很好疗效。和等首 次报道表皮生长因子受体酪氨酸激酶编码区基因突变是给予非小细胞肺癌 ,患者靶向药物治疗的一个必要前提。有文献 报道显示,吉非替尼;商品名:易瑞沙,对有基 因突变的非小细胞肺癌患者有效率可达%以上,而对基因无突变的野生 硕士学位论文 型患者则基本无效。各国学者也相继证实了此结论。因此,通过基因检测, 可以从晚期肺癌患者中筛选出最适治疗对象,进行针对性治疗,从而显著提高 药物疗效。根据国内外一些学者的研究显示:在非小细胞肺癌中,腺癌突变率 较高接近%,其中的支气管肺泡癌突变率更高;女性比男性,非吸烟比吸烟患 者突变率高;而鳞癌突变率很低,只有%到%左右,所以靶向药物主要应用 在基因突变的晚期肺腺癌患者中。在基因突变的晚期肺腺癌患者中, 接受化疗及靶向药物维持治疗效果要好于单纯接受化疗。但是,由于经济等多 方面因素限制,大部分有基因突变的晚期肺腺癌患者无法接受靶向治疗, 只能单纯接受化疗。那么,有基因突变的晚期肺腺癌患者单纯接受化疗或 者接受化疗及靶向药物维持治疗以及野生型晚期肺腺癌患者接受化疗之间的效 果相比较又如何昵国外相关文献报道:基因突变可能增加铂类药物的疗 效。 【目的】:观察晚期肺腺癌患者总体基因突变率,吸烟及性别对突变率 的影响;基因野生型晚期肺腺癌患者接受化疗、基因突变型晚期肺 腺癌患者接受化疗或者化疗靶向药物维持治疗后的无进展生存期、总生存期。 【方法】:收集南方医科大学附属南方医院年月至年月间的例 患者,均为经病理或细胞学证实的局部晚期或转移的晚期肺腺癌患者,根据肺 癌国际分期标准均为.期或期。采用法行基因检测。根据 患者检测结果及临床治疗方法分为三组:组:基因为野生型患者给 予个周期含铂类方案化疗,每个星期一次;组:基因为突变型患者接 受个周期含铂类方案化疗,每个星期一次:组:基因为突变型患者接 受个周期含铂类方案化疗,每个星期一次,化疗结束两周后给予口服易瑞沙 维持治疗,/,持续用药直到疾病进展或出现不可耐受的毒副作用。每次 化疗前先给予行胸部片或胸部增强,化疗结束后每两个月复查胸部片或胸 部增强,半年及一年给予行全身检查或头颅增强磁共振胸部增强 全身骨扫描腹部超,以观察患者疾病进展情况。收集所有病例的临床病理资 摘要 料并对患者进行电话或通信随访,随访时间定为月,患者总生存时间小于 月则随访至患者死亡结束。 【结果】:例肺腺癌组织中检出基因突变例,基因突变检出率. %,其中男性肺腺癌患者例,基因突变例,突变率为.%,女性 肺腺癌患者例,基因突变例,突变率为.%;吸烟肺腺癌患者共 例,基因突变例,突变率为.%,不吸烟肺腺癌患者共例, 基因突变例,突变率为.%;女性、不吸烟肺腺癌患者例,基因突 变例,突变率为.%,男性、不吸烟患共例,基因突变例,突变 率为%,男性、吸烟肺腺痛患者例,基因突变例,突变率为. %。收集例晚期肺腺癌患者的临床病例资料,有例患者失访,随访率为. %。根据基因检测结果,基因为野生型的患者有例,均接受含 铂类化疗方案化疗,基因为突变型的患者有例,其中例单纯接受含 铂类化疗方案化疗,例除接受化疗外还给予靶向药物维持治疗。例 基因为野生型的患者无进展生存期为.月,无进展生存期为..,总生 存期为.月,总生存期为..,例单纯接受含铂类化疗方案化疗的患 者无进展生存期为.月,无进展生存期为..,总生存期为.月, 总生存期为..,例除接受化疗外还给予易瑞沙维持治疗的患者无进展 生存期为.月,无进展生存期为..,总生存期均超过月,总生存 期为.士.。三组病例间无进展生存期及总生存期两两比较,组与组 患者之间的无进展生存期、总生存期比较.,均有显著性差异,而组患 者的无进展生存期及总生存期比组、组患者的无进展生存期及总生存期比 组均有改善,但无显著性差异。 【结论】:肺腺癌患者基因总体突变率接近%,与报道相近。女性比 男性,不吸烟比吸烟的肺腺癌患者突变率高,而女性不吸烟肺腺癌患者突变率 最高,男性吸烟肺腺癌患者突变率最低。有基因突变的晚期肺腺癌患者接 受化疗及靶向药物维持治疗比单纯接受化疗效果好,而且有基因突变的晚 硕士学位论文 期肺腺癌患者单纯接受化疗也比基因为野生型的患者接受化疗效果好。 关键词:肺腺癌突变率化疗靶向治疗 硕士学位论文 : :.? , : . . , , . , ,, , . , . , . , . , . . ,, . .. , % %% ,% . , . %. 一 , . .%,,% ,% , % ; , %%;. , , ,, .,. . . ? ,, , %%, , 硕士学位论文 ? %. , ,, %., , .? .. : , . ,. . ;%:。 , , .%, 曲 , ; ,; % %, . 、,廿 .仃, 谢., : . 【: , ; ?、航. 【: ,,.、析 .、析 ? 、析 , . 、航 ,,/. ? , , ? 硕士学位论文 . 、析 . . , 廿 【: , .%; .%; , , .%;,.%; 、析 ,.%; 、, , .%; , .%; , .%; .%. . ? , .士., , . .;、撕,, . ., ,.士.; ,,? ..,, .:.. ., .. : %, ., ,?. . 、析 .:硕士学位论文 日 录 摘 要.. 第一章 前言??。 第二章资料与方法??。 .临床资料??。 . 基因测序 .临床治疗.临床指标.统计学分析? 第三章结果.基因突变的检出率: .基因突变与患者临床特征之间的关系.临床观察结果 第四章讨论??。 第五章结论附 录.. 参考文献?. 成 果.. 致 谢.. 南方医科大学学位论文原创性声明统计学审稿证明?硕士学位论文 第一章前言 晚期肺腺癌患者基因检测及化疗疗效观察 大多数起源于支气管粘膜上皮,因此也称支气管肺癌 肺癌 。近年来,全世界肺癌的的发病率明显升高, 据统计,在欧美某些发达国家和我国大中城市中,肺癌的发病率已居男性各种 肿瘤的首位,男、女之比约:,但近年的统计,女性肺癌的发病率迅速增 加,发病年龄大多在岁以上。肺癌已经成为全世界范围内死亡率最高的癌症, 并被认为是对人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤。目前,肺癌的发病率及死 亡率在男性癌症患者中占第位;在女性恶性肿瘤患者中发病率占第位或第 位,而死亡率却占第位。据统计,全世界每年估计有超过万新发肺癌患 者,死亡人数约 万人。在我国,肺癌致死率在城市居民中居恶性肿瘤死亡 的首位,而且青年及女性患者人群发病率和死亡率在迅速增长。来自我国肿瘤 防治研究办公室恶性肿瘤死亡抽样调查结果表明,近年来,不论城市还是农 村的恶性肿瘤发病率及死亡率上升幅度最大的均是肺癌,肺癌已成为严重危害 人类健康的主要疾病之一堙。据上海市报道,全部肺癌五年生存率仅为%一%, %肺癌病人在一年内死亡,肺癌对人类危害及社会影响之大显而易见。肺癌 的病因及发病机制迄今尚未明确,一致认为肺癌的发病与下列因素有关:一 吸烟:已经公认吸烟是肺癌的重要危险因素,国内调查证明%%的男性肺癌 与吸烟有关,女性约.%%与吸烟有关。经病理学证实,吸烟与支气管上皮 细胞纤毛脱落、上皮细胞增生、鳞状上皮化生、核异性变密切相关,而且被动 吸烟也容易引起肺癌。二职业致病因子:约有%的美国男性和%的女性肺癌 与职业因素有关。常见的职业因素有石棉、煤烟、焦油、石油中的多环芳烃及 烟草的加热产物等物。三大气污染:空气污染包括室内小环境和室外大环境 污染。有资料证明,室内用煤、接触煤烟或其不完全燃烧物为肺癌的危险因素, 特别是对女性腺痛的发生影响较大。烹调时加热所释放出的油烟雾也是致癌因第一章前言 素,不可忽略。四电离辐射:大剂量电离辐射可引起肺癌。五饮食与营养: 动物实验证明,维生素及其衍生物胡箩卜素能够抑制化学致癌物诱发的肿 瘤,美国开展的前瞻性研究也证明维生素及胡箩卜素的摄入量与十几年后癌 症的发生呈负相关,其中最突出的是肺癌。六慢性疾病:美国癌症学会将结 核列为肺癌的发病因素之一。有结核病者患肺癌的危险性是正常人群的倍, 其主要组织学类型是腺癌。七其他:病毒感染、真菌感染、机体免疫低下、 内分泌失调及家族遗传等因素,对肺癌的发生可能也起一定的综合作用。肺癌 起源于支气管粘膜上皮,按解剖学部位分类,发生在段支气管至主支气管的癌 肿称为中央型肺癌,约占/,以鳞状上皮细胞癌和小细胞未分化癌较多见;发 生在段支气管以下的癌肿称为周围型肺癌,约占/,以腺癌较为多见。从组织 学病理学上可分为两大类:小细胞肺癌 ,,约 占%,和非小细胞肺癌 ,,约占%。 小细胞肺癌和非小细胞肺癌这两种类型的肺癌,在治疗方法和预后等方面,都 存在着很大的差异。小细胞肺癌起源于神经嵴,包括:燕麦细胞型、中间细胞 型、复合燕麦细胞型,以化疗为主,辅以手术和或放疗;非小细胞肺癌起 源于肺的上皮细胞,根据细胞的起源类型又可分为:腺癌、鳞癌、支气管肺泡 癌、未分化癌,大细胞癌等口,早起主要以手术治疗为主,辅以化疗,晚期主要 采取化疗与放疗联合治疗。肺痛患者早期症状轻微,不典型,和常见疾病相似, 仅为一般呼吸系统疾病所共有的症状,如咳嗽、咯血、低热、胸痛、胸闷等, 很容易被忽略,容易被忽视,一旦出现明显症状才去就诊,往往就比较晚期, 治疗效果也较差。因此,在早期有轻微症状就去就诊、治疗是提高肺癌患者预 后的主要办法。最近这年以来,随着科学的发展,医学影像学有了明显进步, 更多的患者能在早期被确诊,临床治疗也有了较大改善,能行根治手术的肺癌 患者的年生存率能达至%%,但是肺癌总的年生存率在发达国家也只有 %,我国更是低于%。究其原因,主要是绝大多数患者就诊时已属晚期,失 去外科手术治疗的机会。%一%的患者在确诊时已进展为中晚期,难以进行 硕士学位论文 根治性切除。 目前肺癌的治疗方法依然以传统的手术、化疗和放疗为主。按版肺癌 国际分期标准可将肺癌分为一?期,期指原位癌,?期指有远处转移,常 见的远处转移部位主要有脑、全身骨骼、双侧肺叶、肝脏、双侧肾上腺。 期的非小细胞肺癌患者约占所有肺癌患者的%,这部分患者可以行根治性手 术,年生存率为%一%,和期的非小细胞肺癌患者约占%,其中 期的患者有可能能行根治性手术,但年生存率也只有%一%,期及?期 肺癌患者因为有局部转移或远处转移是不能行根治性手术的。期非小细 胞肺癌患者即使可以行手术治疗,但除了和部分期外,都推荐术后给予化 疗,及?期非小细胞肺癌患者只能选择传统化疗或加局部放疗。而期伴高 危因素的肺癌患者术后也需给予化疗,高危因素包括:低分化腺癌包括肺神 经内分泌病、脉管侵犯、脏层胸膜受侵犯、楔形切除术后、、肿块。 这点已取得了初步共识。细胞肺癌约占肺癌总数的%,是最常见的肺癌 类型。已有分析证实非小细胞肺癌患者以目前的一线标准化疗方案:铂类 药物加上第三代新化疗药物即紫杉醇、吉西他滨、长春瑞宾,可以提高患者的 生存时间及生存质量口儿础?瑚?儿引。但是尽管如此,仍只有 /%的少部分非 小细胞肺癌患者获益,大部分患者依然很快出现疾病进展,而且各方案之间显 示出的效果无明显差异,患者的中位生存期仅有个月,年生存率也只有 %左右们?。一般情况下患者在一线治疗失败后疾病很快会出现进展,如果不 再接受任何治疗,中位生存期只有个月,所以近年来很多临床研究开始着 重研究二线治疗方法。目前非小细胞肺癌患者标准的二线化疗方案为单药多西 他赛和单药培美曲塞。单药多西他赛用于二线化疗,其有效率仅为%一%, 中位生存期也只有.个月,年生存率仅%%培美曲塞是最近几年 发展起来的多靶点抗叶酸药物,通过抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶 、甘氨核苷酸甲酰基转移酶从而达到抑制肿瘤生长的目的。临床 研究证实,培美曲塞有效率在.%,中位生存期为.个月,年生存率为.第一章前言 %叫【】。 近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,肿瘤细胞信号转导机制的不断发 现,人们对肿瘤细胞的产生、发展、复发以及转移的认知越来越多,针对肿瘤 细胞信号转导途径的特异性分子的靶点,开发出多种抗肿瘤新药,是未来抗肿 瘤治疗极具前景的方法,出现的肿瘤细胞分子靶向治疗药物,给晚期非小细胞 肺癌患者带来了新的希望。分子靶向治疗药物针对的是正常细胞和肿瘤细胞之 间的分子差异,通过阻滞特定的靶分子从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用,它 与传统的细胞毒药物治疗不同在于其具有靶向性和非细胞毒性,这一特点使得 分子靶向药物治疗具有常规化疗所没有的高效低毒的优势,开辟了肿瘤治疗中 的一片全新的领域。其中,对表皮生长因子受体 ,信号通路酪氨酸激酶抑制剂的研究最为深入。表皮生长因子受 体 ,属于型生长因子家族,是原癌 基因的表达产物,定位于细胞膜上。该家族包括个跨膜受体: 、、、等。其中是一个分子量为的跨膜 蛋白,含有 个氨基酸残基,共有个区域组成:胞外配体结合区、跨膜区和 胞内区。的酪氨酸激酶功能区由个重要结构构成:氨基端小叶, 由条平行的一折叠构成,其中的磷酸结合环的序列是 螺旋 一磷酸基团的主要结合位点; ,此螺旋中含有的一和 一磷酸基团结合位点。当 螺旋与结合后,其构象发生改变,从而引起受 体自身磷酸化和激酶活化;羧基端小叶?,此小叶中的活化环 是酪氨酸激酶的活性中心,由个氨基酸组成,其中序列在所有酪氨酸 激酶中高度保守,改变此序列的组成或构象将显著影响激酶活性引。基因 位于第号染色体短臂的区,一共有个外显子构成。其酪氨酸激酶功 能区由外显子编码,其中外显子编码,外显子编码 ?。而目前所发现的非小细胞肺癌基因突变超过%位于号染色 体外显子。在上皮、间质、神经源性组织中都有表达,在调节正常细胞 硕士学位论文 的增生、生长及分化中起着非常重要的作用。有研究显示在许多肿瘤细胞 中都存在高表达或者异常表达。在肺癌中有%的鳞癌存在高表达,而腺癌 及大细胞癌只有%一%,小细胞肺癌中则罕见有表达‘舯。和肿瘤细 胞的生长、血管形成、肿瘤转移、细胞凋亡的抑制密切相关。其机制主要有: 的过表达使下游信号传导明显增强;受体突变或配体高表达致使 的持续活化;自分泌作用增强;受体下调机制的破坏;异常信号传导通路的激 活等。的配体包括一些生长因子如, 及一些细胞因子。当配体 与结合,形成二聚体复合物,表皮生长因子受体。酪氨酸激酶自 身磷酸化而活化。主要通过两条途径将信号传递至细胞核,一条是? ?途径,这条传导通路是研究中最透彻的。自身磷酸化后为 的区提供结合位点,/复合物通过其结构域直接或通过 间接与结合,使一/复合体锚定于细胞膜的胞质面,从而激活膜结合 蛋白,活化的可激活丝/苏氨酸蛋白激酶然后通过一系列中间激酶使 、磷酸化,最后转入核内催化核内转录因子的磷酸化,启动相关基 因的转录过程。研究表明的活化也可通过磷酸化,使/复合物 从胞膜上解离而发挥负反馈作用心。几乎所有的受体成员都可以通过蛋 白和或蛋白来激活激酶通路,该信号通路在生命的进化过程中是高 度保守的,在细胞增殖、分化、迁移中起了非常重要的作用膻别。还可以介导 调节细胞周期; 另一条是??途径 瞳,包括:催化亚基和调节亚基,可以通过的结构域结 合于/而被其中的活化,还可通过被磷酸化的活化。 催化生成磷酯酰肌醇一一磷酸第二信使,其靶蛋白是丝/苏氨酸蛋 /、 白激酶,/下游分子包括、、、 、、等?’朝,通过激活下游的和多个转录调节因子,抑制 细胞凋亡。一在细胞的增殖、相互黏附、转移、抑制细胞凋亡及促进血管 生成方面都起着重要作用。当信号传导至细胞核后,引起核内基因转录水平的第一章前言 增加,使细胞增殖、转化。信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。 以表皮生长因子受体为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼在 、期单药治疗晚期非小细胞肺癌的临床试验中均显示了较好的效果。 ,,存在于大 ?属于受体酪氨酸激酶 部分正常上皮和部分间叶来源的细胞,对细胞的生长、分化调节起重要作用, 在许多肿瘤组织中存在过表达现象,%%的细胞肺癌存在过表达 啪。其结构上分为细胞外配体结合区、跨膜区及细胞内酪氨酸激酶区三部分。 当与相应配体如或结合后,形成同源或异源二聚体,引起构象改 变,导致胞内酪氨酸激酶与结合,使胞区内酪氨酸残基磷酸化,进而激活下 游信号通路,主要是///通路、/通路和/信号传导 通路,最终导致肿瘤细胞的一系列生物学行为,如增殖、浸润转移、血管生成、 抑制凋亡、促进细胞增殖等。其中的二聚体化是整个信号通路传导的重要 前提,而受体酪氨酸残基磷酸化是一个关键的分子事件雎,矧。小分子酪氨酸激酶 抑制剂和的作用机制是与竞争结合于胞内区酪氨 酸激酶的结合位点,阻止通路的信号传导,从而达到治疗肿瘤的目的。 基因突变导致酪氨酸激酶区空间构相改变,使小分子酪氨酸激酶抑制剂更 易与之结合,增加了药物的敏感性汹。有学者证明,存在基因突变与小分 子酪氨酸激酶抑制剂发挥效果相关,小分子酪氨酸激酶抑制剂对有基因 突变的细胞肺癌患者的有效率明显高于无突变患者口卜。对基因突变的 数据分析表明?引,尽管突变部位分散在整个酪氨酸激酶编码区,但是%的突 变集中在外显子的缺失和外显子的点突变,这也是经实验验证的有功 能的突变啪,引。这些结果提示我基因突变可能是预测酪氨酸激酶抑制剂疗 效的分子生物学指标。因此,通过基因突变检测可以从晚期患者中筛 选出合适的治疗对象进行有针对性的治疗,从而提高药物的疗效。目前,针对 晚期细胞肺癌患者的基因检测方法有多种,有:、直接测序法:、 特异性位点的聚合酶链式反应;、荧光实时聚合酶链式反应;、高效液相色 硕士学位论文 谱法;、毛细管电泳;、聚合酶链式反应一单链构象多态性分析。目前大 部分研究者在进行基因突变检测时均应用蝎形探针扩增阻滞突变系统 和直接测序法。直接测序法是技术与自动测序技术相结合,是一种 最有效、最经典的测定核苷酸序列的方法。直接序列分析有两个主要的优点, 第一:由于它是一个不依赖于生物体如细菌、病毒等的体外系统,因而它更 容易标准化;第:对于每个待测样品,只需测定一个单链序列,因而更准确。 不足之处是操作过程繁琐, 检测时间长,结果判读复杂。蝎形探针扩增阻滞突 变系统是基于基础上发展起来的用于检测突变的技术。其技术原理 为在序列分析对比基础上,设计特异性引物,通过反应用于鉴别,主要步骤 包括设计引物、提取、扩增、电泳检测。相对比传统检测方法,其具有 一下优点:、操作方法简单、方便,在一般的实验室都能进行;、检测时间 短,所需成本低;、需使用特异性引物,退火温度高,一般污染不会影响 结果;、对质量要求不高,而且所需的量少;、灵敏度好、特异性高。 缺点有:、适用范围有限:、引物设计依赖基因序列;、选择基因片段要求 高,必须保证基因具有明显差异口。本研究主要采用蝎形探针扩增阻滞突变系 统对晚期肺腺癌患者进行基因检测。 多个临床试验已经证实,小分子酪氨酸激酶抑制剂和 对有基因突变的晚期非小细胞肺癌患者效果优于化疗,特别是对 东方不吸烟女性肺腺癌患者效果更佳。在非小细胞肺癌中,肺腺癌患者基 因突变率较高,接近%,而肺鳞癌及其他类型肺癌患者突变率较低只有%%。 所以,小分子酪氨酸激酶抑制剂主要应用于有基因突变的晚期肺腺癌患者, 有效率可达至%一%,效果明显好于化疗,且毒副作用较轻。啪和? 报道了例接受治疗的晚期非小细胞肺癌患者,例有效者中例存在 基因突变其中例为号染色体外显子的?位氨基酸缺失突变,例 为第号染色体外显子的点突变,例为号染色体外显子的,另 例的突变出现在号染色体外显子位氨基酸的点突变,而例无效者均为 第一章前言 基因野生型,这是首次揭示基因突变与靶向药物疗效的关系。除美国 学者外,亚洲学者也相继报道了各自的研究成果。韩国汉城大学等啪报道, 例有基因突变的非小细胞肺癌患者经过口服,有.%/ 的患者有效,而例基因为野生型的患者中只有例.%患者有效。 此外,该研究还显示:有基因突变的非小细胞肺癌患者接受吉非替尼治疗 后的疾病进展时间和总生存时间均明显优于为野生型的肺癌患 者,提示有基因突变是靶向药物有效的前提。日本癌症中心医院 等町报道:非小细胞肺癌患者术后病情进展接受口服吉非替尼治疗, 有例患者肿瘤灶缩小?%,其中例%患者有基因突变,而例 经吉非替尼治疗后仍进展的患者,只有例%为患者有基因突变。研究 还显示,号染色体外显子的位氨基酸缺失突变的有效率/, %显著高于号染色体外显子位氨基酸的点突变及号染色体外显子的 及点突变,/,%,而且对治疗有效的患者生存率也优于无效 者,这证明基因突变是影响患者预后的重要因素。以上研究证实,有 基因突变是晚期非小细胞肺癌患者接受?的一个必要前提,且治疗效果 较好。但是,因其价格昂贵,限制其在临床上的应用。那么对于有基因突 变的晚期肺腺癌患者如果单纯给予化疗的效果与基因为野生型的晚期肺腺 癌患者给予化疗的效果相比较又如何呢国内外有文献报道:基因突变可 能增加铂类药物的疗效??。本课题主要研究基因为野生型的晚期肺腺癌 患者接受化疗、基因为突变型晚期肺腺癌患者接受化疗或者化疗靶向药物 维持治疗后的无进展生存期、总生存期之间的差异。 硕士学位论文 第二章资料与方法 .临床资料 临床资料:收集南方医科大学附属南方医院年月至年月间的 例患者,均为经病理或细胞学证实的局部晚期或转移的晚期肺腺癌患者,根据 年肺癌国际修订的肺癌分期标准均为期或期。其中男性晚 期肺腺癌患者共例,占总例数的.%,年龄岁,年龄.?.岁, 女性晚期肺腺癌患者例,占总例数的.%,年龄岁,年龄.?. 岁;吸烟晚期肺腺癌患者例,占总例数的.%,年龄岁,年龄. ?.岁,不吸烟晚期肺腺癌患者例,占总例数的.%,年龄岁,年 龄.?.岁;女性、不吸烟晚期肺腺癌患者例,占总例数的.%,年 龄?岁,年龄.?.岁,男性、吸烟晚期肺腺癌患者例,占总例 数的.%,年龄岁,年龄..岁。收集所有病例的石蜡包埋癌 组织,采用法进行基因检测。根据晚期肺腺癌患者的基因检测结 果及临床治疗方法,分为三组,第一组为基因检测结果为野生型的晚期肺 腺癌患者,给予含铂类化疗方案化疗,第二组为基因检测结果为突变型的 晚期肺腺癌患者,给予含铂类化疗方案化疗,第三组为基因检测结果为突 变型的晚期肺腺癌患者,先给予含铂类化疗方案化疗,化疗结束两周后给予易 瑞沙/口服维持治疗。收集所有病例的临床病理资料并对患者进行随访, 随访内容主要为患者的无进展生存期和总生存期,随访时间定为月,患者总 生存时间小于月则随访至患者死亡结束。共获得例患者的随访资料,例患 者失访,随访率为.%。从患者确诊第天开始,到发现疾病进展那天为止, 这期间属疾病进展时间;患者确诊第天开始,到患者因疾病进展死亡那天为止, 这期间属总生存时间。所有死亡患者的死因均为肺癌相关疾病或其并发症。所 有入选患者确诊前均未接受过化疗或放疗等任何抗肿瘤治疗,评分均小于分 第二章资料与方法 且知情同意。所用标本均经%福尔马林固定,常规石蜡包埋连续切片,。 , 烤箱过夜,分别做、免疫组织化学染色。同时切取石蜡包埋组织,厚 肿瘤组织至少占切片组织的.%以上,肿瘤内无出血或坏死,周围组织无炎 症。 . 基因测序 ..、石蜡样品提取: .用解剖刀修剪去除样品的石蜡。 .样品切成胁样品表面不要接触空气。 .立即将组织块放入.离心管中,加入二甲苯,盖紧并混匀。。 .室温下最大离心速度离 .小心的吸去上清,切勿吸去颗粒沉淀。 .加入 无水乙醇到沉淀中,震荡混匀去除二甲苯。 。 .室温?最大离心速度离 .吸去上清,切勿吸去沉淀。 .打开离心管盖子,室温或。晾干,约 ,直到乙醇完全蒸干。 .沉淀中加? ,再加入 蛋白酶,震荡混匀。 .?消化,直到样品完全裂解。 .孵化在 中?孵化可逆转部分甲醛修饰的核酸如 果只有一个加热器,放在室温等温度升到?是再放上去。 .快速离心收集管壁上的液体等温度降到室温,如必需可加入“ 酶室温孵育 去除。 /.加入 混匀再加入“无水乙醇充分混匀,可能会产生 和乙醇预先加在一起再加 白色絮状沉淀如果样品比较多可以将 入以节省时间。 .快速离心收集管壁上的液体。 硕士学位论文 .将上清小心转移到 ,倒掉 离心柱中,×离 废液,如上清未完全离下,可加大转速再离直到完全离下。 。 .小心打开盖子,加入肛 ,×离 .倒掉废液,小心打开盖子加入“ ,×离 。 .倒掉废液,将柱子放入干净的 管中,空管离心 离 。.将柱子转移到. 干净的离心管中,小心打开柱盖加入 于膜中央。 .室温?。孵育卜 ,再×离 收集产 物。 .可重复上步。 注意事项: 。所有的离心步骤都在室温?下进行。 .所有的使用前放置到室温??。中加入 .确保 和 中加入了乙醇,的乙醇, 中加入 的乙醇。 .一次最好只打开一个盖子,注意避免产生气溶胶。 .如果 和 中有沉淀物,使用前?加热搅拌。 .残留的甲醛水福尔马林能抑制蛋白酶的消化。 .该试剂盒在?下可保存一年以上,室温??只能保存四周。 .蛋白酶应放置?保存。 .. 质控 超微量紫外分光光度计或法,测定的浓度和纯度,检测可扩增的 片段,评估是否存在抑制剂。 ..基因突变检测第二章资料与方法 根据试剂盒标准操作,把待测标本加入联管试剂条, 放入荧光定量中检测。该试剂盒采用联管设计,每一个联管检测一 个样品, 联管的卜或,或联管两端各有一个小孔,小孔居侧端为 号管,小孔居中端为号管号管内装有相应的基因突变检测和内控试剂, 突变探针由信号指示,内控由信号或信号指示;或号管作 为提取质量的外控检测管,由信号指示。内控和外控作为对试剂、质 量以及操作本身的质控,选择的检测区域是人类基因相对保守区段,约 ,这样即便有降解,外控和内控仍然能够最真实地反应有效基因 量。每个反应管内均含有~ 特异性引物、 双环探针、. 、 氯化镁、 硫酸铵、. 氯化钾和纯化水等。反应 混合液能检测外显子上的种缺失突变;反应混合液能检测外显子 上的种插入突变;能检测外显子上,和突变。详 见表和表 表试剂盒组成 试稠盆篾格 溯试 联管反瑰长 豢 孤貉诬嗑码 艏 阳性餍控晶 俎 表 关管反应条的组成 硕士学位论文 基因突变检测方法: 建议在每次反应中,每份样品和阳性对照试剂盒中的阳性质控品、 无模板对照超纯水,自备共同进行分析。 .取出阳性质控品和酶删,阳性质控品先解冻,再振荡混匀。阳性质 控品和酶目需快速离秒待用。.向. 待测样品样品浓度参见如下中加入. 酶删,向. 阳性质控 品中加入. 酶历:脚,向.超纯水中加入. 酶酽,涡旋器上混匀秒,然后快速离 秒样品的浓度推荐为/ / ,即每单个反应管添加的量 为..。根据石蜡切片样品保存的年限不同,建议:保存不超过三年 的石蜡切片样品每单个反应管添加的量为.;保存超过三年的石蜡切片 样品每单个反应管添加的量为.。 .在管冰架上,轻轻揭开联管反应条的条盖。 .将混好的样品依次取 加入联管反应条,然后小心盖上联管 反应条管盖。 .离心联管反应条。 .将联管反应条放入实时仪器。反应板布局见表中推荐方法。 .打开仪器窗口,按照下图中说明的扩增程序图进行设置。第二章资料与方法 第一阶段:。 分钟,个循环; 第二阶段:。 秒,。 秒, 秒,个循环; 第三阶段: 秒,。 秒,。 秒,个循环: 信号收集:第三阶段时收集和信号或信号, 执行实时 保存文件。 表 仪孔板建议布局 【检验结果的解释】 阴性对照的卜或?号管的信号应无曲线升起。若管其中任一 管信号升起,则此次实验结果无效,同时建议重做一次。若?或?号管 的信号及或号管的信号偶尔升起,此属正常现象,不影响对突变 检测结果的判断。 .阳性质控品的值一般小于,但可能会由于不同仪器的不同阈值设 置而发生波动。 .确定试验是否成功可信:外控对照反应孔的信号应该升起。若为石蜡硕士学位论文 切片样品,则其值应在~之间;若为非石蜡切片样品,其值应在 之间。若能满足的要求,则继续进行分析。如果其值小于其范围值, 说明加入的过量,应减少加入量再做。若外控对照分析为阴性或值 大于其范围,说明加入的含有抑制剂或力入量过少,需要重新提取 后再做。待测样品的内控信号应升起。 若内控对照分析为阴性或部分管分析为阴性,说明加入的含有抑制剂或 力入量不够,需要重新提取后再做或增力用量后再做。但如果管内 有信号,可能是由于突变序列的扩增抑制了内控序列的扩增,结果仍然可信。 .值的确定:确认未选择校正荧光参照,按管号顺序依次选择单一检测反应 管进行检测分析。需要同时选择阳性质控品反应孔、无模板对照孔和样品反应 孔,然后用户可根据实际情况确定扩增曲线升起的拐点处,得到值。 .突变结果的确定:首先确定样品各个反应管各自的突变值,然后确定该样 品的外控值。由于样品中突变百分含量各不相同,所得到的突变值也各不 相同。根据不同的突变值,把样品检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判 定见表。 当样品突变值大于或等于阴性临界值时,则该样品为阴性或低于试剂盒 的检测下限。 当样品突变值小于阴性临界值时,进行下列判断: .当某个反应管的突变值小于阳性临界值时,则该样品为该反应管对 应的突变阳性,即强阳; .当反应管的突变值大于或等于阳性临界值时,则计算该反应管的? 值。若反应管的?值小于相对应的? 值,则该样品也为该反应 管对应的突变阳性;反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。 . 值的计算:?值突变值控值。突变值是指样品突变信号 信号对应的值;外控值是指样品对应的外控信号信号的值。一 个样品可能同时含有个或多个突变类型,则该样品应有相对应的个或多个?第二章资料与方 法 值。 表结果判定 ‘蹦..结果分析与报告 根据说明书判读结果,判读流程如下: 检测结果无效 检查设置参数与说明书一致?至一 是 设定阈值 是 ?王一 相应突变数据无效 阴性对.无荧光信号 是 ?重二, 相应突变数据无效 阳性对照 是 石蜡标本外控 ?歪一 相应样品数据无效 非石蜡标本外控 不 相应样品数据无效 样品内控有×或信号??兰?硕士学位论文 .临床治疗 根据晚期肺腺癌患者基因检测结果及患者实际情况分为三大类给予治 疗:基因检测结果为野生型的晚期肺腺癌患者:给予铂类紫杉醇方案治 疗,每三个星期化疗一次,共四个周期。每次化疗前先行胸部正侧位片或胸部 增强、常规心电图及三大常规化验,第四次化疗前行全身检查,给予全身 ?或头颅磁共振胸部增强全身骨显像腹部超声,以观察患者病情变 化,四次化疗结束后定期观察,每两月行胸部正侧位片或胸部增强复查,半 年及一年行全身检查;基因检测结果为或号染色体为突变型的晚期 肺腺癌患者:给予铂类紫杉醇方案治疗,每三个星期化疗一次,共四个周期。 每次化疗前先行胸部正侧位片或胸部增强、常规心电图及三大常规化验,第 四次化疗前行全身检查,给予全身或头颅磁共振胸部增强全身骨显 像腹部超声,以观察患者病情变化,四次化疗结束后定期观察,每两月行胸部 正侧位片或胸部增强复查,半年及一年行全身检查;基因检测结果为 或号染色体突变型的晚期肺腺癌患者:给予铂类紫杉醇方案治疗,每三个 星期化疗一次,共四个周期。每次化疗前先行胸部正侧位片或胸部增强、常 规心电图及三大常规化验,第四次化疗前行全身检查,给予全身或头颅 磁共振胸部增强全身骨显像腹部超声,以观察患者病情变化,第四次化疗 结束两周后开始给予易瑞沙维持治疗,/口服治疗,持续用 药直到疾病进展或出现不可耐受的毒副作用。每两月行胸部正侧位片或胸部增 强复查,半年及一年行全身检查。 .临床指标 所有晚期肺腺癌患者期或期的临床随访时间定为个月,患者总 生存时间小于个月则观察至患者死亡结束。观察指标主要为晚期肺腺癌患者 的无进展生存期和总生存期。 ..国际肺癌的硼分期 版 第二章资料与方法 原发肿瘤分期 原发肿瘤大小无法测量;或痰脱落细胞、或支气管冲洗液中找到痛细胞,但 影像学检查和支气管镜检查未发现原发肿瘤 没有原发肿瘤的证据原位癌 原发肿瘤最大径?,局限于肺和脏层胸膜内,未累及主支气管;或局限 于气管壁的肿瘤,不论大小,不论是否累及主支气管,一律分为 原发肿瘤最大径,? 肿瘤有以下任何情况者:最大直径,?;累及主支气管,但肿瘤 距离隆突?;累及脏层胸膜;产生肺段或肺叶不张或阻塞性肺炎 肿瘤有以下任何情况者:最大直径,? 任何大小肿瘤有以下情况之一者:原发肿瘤最大径,累及胸壁或横膈或 纵隔胸膜,或支气管距隆突,但未及隆突,或心包;产生全肺不张或 阻塞性肺炎:原发肿瘤同一肺叶出现卫星结节。 任何大小的肿瘤,侵及以下之一者:心脏,大气管,食管,气管,纵隔,隆 突,或椎体;原发肿瘤同侧不同肺叶出现卫星结节 淋巴结转移分期 淋巴结转移情况无法判断。 无区域淋巴结转移。 同侧支气管或肺门淋巴结转移。 同侧纵隔和/隆突下淋巴结转移。 对侧纵隔和/或对侧肺门,和/或同侧或对侧前斜角肌或锁骨上区淋巴结转 移。 远处转移分期 无法评价有无远处转移。 无远处转移。 胸膜播散恶性胸腔积液、心包积液或胸膜结节 硕士学位论文 原发肿瘤对侧肺叶出现卫星结节;有远处转移/胸膜外 期 期 期 期,, 期, 期,,? 期,? 期任何任何 ..评价标准: 根据标准对客观缓解率进行评价。疗效分为完全缓解 ,、疾病稳定 , ,、部分缓解 和疾病进展 ,.客观有效率 ,包括,疾病控制率 ,包括。 实体瘤可测量病灶螺旋或病灶 直径,临床及其他影像学检查 病灶的客观疗效评价标准分为: .完全缓解:所有可见病变完全消失并至少维持周以上. .部分缓解:肿瘤病灶的最大两径乘积减少?%,维持周以上,无新 发 .病灶。 .疾病稳定:肿瘤病灶两径乘积缩、%,或增大%,无新病灶出现。 .疾病进展:肿瘤病灶两径乘积增大%,或出现新病灶。 疾病进展时间及总生存时间 疾病进展时间:从患者确诊第天开始,到发现疾病进展那天为止,这期间 属疾病进展时间。 总生存时间:患者确诊第一天开始,到患者因疾病进展死亡那天为止,这 第二章资料与方法 期间属总生存时间。 药物毒性反应按照世界卫生组织抗癌药物毒性反应分度 度 度 项目 度 度 度 腹泻 无 短暂天 能耐受天 不能耐受,需治疗 血型腹泻 口腔 正常 疼痛,红斑 红斑,溃疡, 溃疡,只能进流食 不能进食 可进一般饮食 皮肤 无 红斑、丘疹 干性脱皮、水疱、瘙痒 湿性皮炎溃疡 剥脱性皮炎 坏死需手术 肺 正常 症状轻微 活动后呼吸困难 休息时呼吸困难 完全卧床 .统计学分析 实验所得数据用均数?标准差表示,采用精确概率法和 ~法的统计学方法,使用 .统计软件进行分析,.为差 异显著性标准。硕士学位论文 第三章结果 .基因突变的检出率: 例晚期肺腺癌患者组织中检出有基因突变的患者有例,基因突变 检出率.%,其中号染色体突变例,占突变总数的.%,号染色体突 变例,占突变总数的.%;男性晚期肺腺癌患者例,有基因突变的患 者例,突变率为.%,其中号染色体突变例,占突变总数的.%, 号染色体突变例,占突变总数的.%;女性晚期肺腺癌患者例,有基 因突变的患者例,突变率为.%,其中号染色体突变例,占突变总数的 .%,号染色体突变例,占突变总数的.%;吸烟肺腺癌患者共例, 有基因突变的患者例,突变率为.%,其中号染色体突变例,占突 变总数的.%,号染色体突变例,占突变总数的.%;不吸烟肺腺癌患 者共例,有基因突变的患者例,突变率为.%,其中号染色体突变 例,占突变总数的.%,号染色体突变例,占突变总数的.%;女性、 不吸烟肺腺癌患者例,有基因突变的患者例,突变率为.%,其中 号染色体突变例,占突变总数的.%,号染色体突变例,占突变总数的 .%;男性、吸烟肺腺癌患者例,有基因突变的患者例,突变率为. %,其中号染色体突变例,占突变总数的.%,号染色体突变例,占 突变总数的.%。表 第三章结果 .基因突变与患者临床特征之间的关系 例肺腺癌患者组织基因突变率为.%,与报道结果%一%相符, 其中号染色体突变例,占突变总数的.%,号染色体突变例,占突变 总数的.%。男性肺腺癌患者基因突变率为.%,女性肺腺癌患者 基因突变率为.%,两组间比较..,有显著性差异:吸烟肺腺癌 患者基因突变率为.%,不吸烟肺腺癌患者基因突变率为.%, 不吸烟肺腺癌患者突变率显著高于吸烟肺腺癌患者,但两组间比较 ..,无显著性差异;基因突变率最高的为女性、不吸烟肺腺癌 患者,突变率为.%,而男性、吸烟肺腺癌患者基因突变率最低只有. %,两组间比较..,有显著性差异。 .临床观察结果 收集所有晚期肺腺癌患者的临床病例资料,其中例患者失访,随访率 为.%。所有患者接受化疗或靶向药物治疗均可耐受,无明显毒副反应。根 据基因检测结果,基因为野生型的肺腺癌患者有例,年龄?岁,硕士学位论文 年龄.?.岁,占总例数的.%,基因为突变型的肺腺癌患者有 例,其中单纯接受含铂类化疗方案化疗的肺腺癌患者有例,年龄?岁, 年龄.?.岁,占总例数的.%,接受化疗及靶向药物维持治疗的肺 腺癌患者有例,年龄?岁,年龄.?.岁,占总例数的.%。 例基因为野生型的肺腺癌患者无进展生存期为?月,无进展生存期为 ..月,例单纯接受含铂类化疗方案化疗的肺腺癌患者无进展生存期 为月,无进展生存期为.?.月,歹除接受化疗外还给予易瑞沙维 持治疗的肺腺癌患者无进展生存期为卜月,无进展生存期为.?.月。 三组病例无进展生存期两两比较,基因为野生型的肺腺癌患者与基因 为突变型接受化疗及易瑞沙治疗的肺腺癌患者之间的无进展生存期比较 .,有显著性差异,而基因为野生型的肺腺癌患者 .. 与基因为突变型接受化疗的肺腺癌患者之间的无进展生存期比较、基 因为突变型接受化疗的肺腺癌患者与基因为突变型接受化疗及易瑞沙治疗 的肺腺癌患者之间的无进展生存期比较都是有差异但无显著性差异:. .;例基因为野生型的肺腺癌患者总生存期为 .,贮. 一月,总生存期为.?.月,例单纯接受含铂类化疗方案化疗的肺腺 癌患者总生存期为月,总生存期为.?.月,例除接受化疗外还 给予易瑞沙维持治疗的肺腺癌患者总生存期均超过月,总生存期为 .?.月。三组病例间总生存期两两比较,基因为野生型的肺腺癌 患者与基因为突变型接受化疗及易瑞沙治疗的肺腺癌患者之间的总生存期 :.,有显著性差异,而基因为野生型的肺腺癌 比较.. 患者与基因为突变型接受化疗的肺腺癌患者之间的总生存期比较、基 因为突变型接受化疗的患者与基因为突变型接受化疗及易瑞沙治疗的患者 .,. 之间的总生存期比较都是有差异但无显著性差异贮. .;表第三章结果 表各组肺腺癌患者的生存期 类型 例数 月 月 野生型?? 突变化疗?? 突变靶向?. ? ,? 口??? 项士学住论文 门门 艘删驰骶秘?嚣磐第四章讨论 第四章讨论 肺癌在全世界男、女性中发病率均较高且都是最常见的癌症致死病因。根 据大量资料显示,每年因肺癌及其并发症死亡的患者人数超过了前列腺癌、乳 腺癌、结直肠癌死亡的总人数。非小细胞肺癌 , 患者约占所有肺癌患者总数的%,按其病理组织学进一步可划分为鳞 癌、腺癌、大细胞癌等。临床研究中最常见的组织学类型分别为:腺癌、鳞癌、 大细胞癌。目前肺癌早期诊断尚有困难,%一%的肺癌患者在确诊时多为已出 现局部侵犯或远处转移的晚期患者,只能接受化疗,而且多数早期的患者在术 后接受一线化疗后也很快会出现疾病进展,出现复发或转移,需要再次接受治 疗。因此,大多数非小细胞肺癌患者都将接受化疗,全身化疗是目前大多数肺 癌患者的主要治疗手段。近年以来,一些新型抗肿瘤药物如紫杉烷类紫杉醇、 多烯紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂托泊替康、依立替康、长春瑞宾诺维本及 吉西他滨健择的应用使晚期非小细胞肺癌患者的预后有了较大的改善,与铂 类药物的二药联合方案已经成为晚期非小细胞肺癌一线标准化疗方案。大量临 床研究均证实这些新药与铂类药物联合应用于一线化疗的效果相似,中位生存 期一般只有?个月,一年生存率仅%%;二药联合方案用于二线化疗 的效果也不尽如人意,有效率更是低于%‘州。因此