枯草芽孢杆菌的研究与应用

枯草芽孢杆菌的研究与应用 第4O卷第9期 2009年9月 东北农业大学 JournalofNortheastAgricuhuralUniversity 4O(9):111,114 Sep.2009 枯草芽孢杆菌的研究与应用 李明,双宝,李海涛,王晴,高继国 (东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030) 摘要:枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌,能形成芽孢,是一些重要工业酶制剂的生产菌.由于其具有非致病 性,分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础,所以应用十分广泛.文章通过总结归纳其在医药,农业和其他研究 领域的应用现状,分析其应用中存在的问和产生问题的原因,希望能够为从事此领域研究的人员提供参考. 关键词:枯草杆菌;应用;达系统;细胞质融合 中图分类号:$563.2文献标识码:A文章编号:1005—9369(2009)09一O11l-04 ProgressandapplicationofBacillussubtilisindifferentfields/uMing, SHUANGBao,LIHaitao,WANGQing,GAOJiguo(CollegeofLifeSciences,NortheastAgr icultural University,Harbin150030,China) Abstract:BacillussubtilisiSoneofsomejndustriaIproductionenzymebacteria.andaGram — positivebacteria,whichcarlfOrmspores.Becauseithasthebasisofnon—pathogeniccharacteristic,the abilitytosecretetheproteinandagoodbasisforfermentation,ithasawiderangeofapplication. This papersummarizedthestatusofitsapplicationinthefieldsofmedicine,agricultureandotherre searches, theanalysistheproblemsandthereasonsofproblemswithinitsapplicationwouldliketoprovi dea referencetothepeoplewhoarestudyingonthisarea Keywords:Bacillussubtile;application;expressionsystem;cytoplasmintegration 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类好氧型, 内生抗逆孢子的杆状细菌,广泛存在于土壤,湖 泊,海洋和动植物的体表,自身没有致病性,只具 有单层细胞外膜,能直接将许多蛋白分泌到培养基 中.在营养缺乏的条件下,枯草芽孢杆菌停止生 长,同时加快代谢作用,产生多种大分子的水解酶 和抗生素,并诱导自身的能动性和趋化性,从而恢 复生长.在极端的条件下,还可以诱导产生抗逆性 很强的内源孢子IlI.正是由于枯草芽孢杆菌无致病 性,并可以分泌多种酶和抗生素,而且还具有良好 的发酵基础,所以用途十分广泛.本文对枯草芽孢 杆菌在医药,农业,科研方面的应用现状以及面临 的一些问题及其产生原因进行了阐述. l枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶,其中能够应 用到医药领域的酶主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶和 脂肪酶两种.丝氨酸纤溶性蛋白酶,即纳豆激酶. 此外,我国的豆豉纤溶酶和韩国的大豆发酵食品 中分离的纤溶酶也都是枯草芽孢杆菌分泌的丝氨 酸纤溶性蛋白酶的一种,只是发酵用的菌株有些 细微差别. 1.1纳豆激酶的发现及应用 1987年,日本学者经过对上百种食物的筛选, 首次发现日本传统的大豆发酵食品一纳豆中含有溶 解血纤维蛋白的成分,并将其命名为纳豆激酶 收稿日期:2008—12—12 作者简介:李明(1983一),男.河北人,硕士研究生,研究方向为生物化工分离纯化. 通讯作者:高继国,教授,硕士生导师,研究方向为生物大分子的分离纯 化.E-mail:ga0jigu01964@h0tmail.oonl ? 112?东北农业大学第40卷 (Nattokinase,NK).通过狗的模型试验及健康人群 的体内研究,证明其除了具有显着的溶栓作用外, 还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活 剂的能力,从而间接地表现其溶栓活性.与传统的 溶栓剂相比,NK具有不易引起出血,无抗原性, 半衰期长,安全无毒且成本低廉和能口服吸收溶栓 等优点,因而具有广阔的开发前景,可能成为新一 代的溶栓药物[2-31. 1992年,Nakamura等首次克隆了纳豆激酶基 因并测定了全基因序列,使得利用基因技术 提高纳豆激酶活性及产量成为可能I4J.近年来,我 国掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮,纳豆激酶 的药用价值日益突出,通过利用基因工程菌生产 纳豆激酶,致使对纳豆激酶基因的克隆,表达, 纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了 很大进展.在我国传统大豆发酵食品豆豉中发现 了类似纳豆激酶的高活力的纤溶酶,将其产生菌 株鉴定为枯草芽孢杆菌,并将豆豉纤溶酶基因克 隆到了毕赤酵母中【51.与此同时,韩国也在其传统 大豆发酵食品中发现了类似的纤溶酶.近期,陈 哗等通过枯草芽孢杆菌培养,利用(NH)2S0沉 淀,SephadexG100柱层析对该酶发酵液进行分离 纯化,已经分离纯化出了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisZY21)溶栓酶[61. 以上研究证明,日本,中国及韩国先后发现的 这3种纤溶酶应该均由枯草杆菌分泌的,只是菌株 不同而已. 1.2脂肪酶 脂肪酶是一类能在油水界面上水解甘油三酯酯 键的酶的总称,广泛应用于食品,生物医药,化 工,化妆品以及生物柴油等传统与现代工业f. 目前,褶皱假丝酵母(Candidarugosa),霉菌属等 是脂肪酶工业生产的主要菌种,来源于枯草芽孢杆 菌168的脂肪酶以其广泛的底物作用范围,较小的 分子质量以及较高的等电点等优良酶学特性而日益 受到人们的关注[91. 脂肪代谢最基本的酶是脂肪酶,其缺乏将会 引起健康问题.通过脂肪酶的外部调节可达到助 消化的目的.微生物脂肪酶被用来从动物和植物 中获得多不饱和脂肪酸,而多不饱和脂肪酸作为 生物药物和营养成分起着越来越重要的作用;游 离的多不饱和脂肪酸及其单双甘酯又是用来生产 各种药物(抗胆固醇,抗炎药)的原料.马吉胜从 原始的枯草杆菌质粒pBD64出发,通过设计两段 DNA片段,引入了多个酶切位点和一个强启动子 序列,构建了一个枯草杆菌脂肪酶高表达质粒 pBSR2,并进一步研究了这种酶的分子质量,酶 活力,最适反应温度,最适反应pH,反应动力学 等基本酶学性质『lol. 2枯草芽孢杆菌在农业中的应用 由于枯草芽孢杆菌能够分泌大量的抗生素,能 够杀灭一些动植物中常见的病源菌,而且其分泌大 量酶对牲畜有益,所以枯草芽孢杆菌常用于农业 中. 2.1枯草芽孢杆菌在饲料中的应用 纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussublitisnatto)是枯 草芽孢杆菌的一个亚种ll11,是我国农业部公布 的12种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂 之一l. 犊牛消化酶系统发育不健全,出生后蛋白酶系 尚未建立完全,胃蛋白酶产生较晚,对固体物质和 非乳物质的消化能力弱;免疫系统功能不完善,胃 及肠对细菌的抵抗力很弱,抗疾病的能力较差,外 界环境不良时,易被大肠杆菌,沙门氏杆菌等病原 菌侵袭,从而引起犊牛胃肠疾病,严重时甚至造成 死亡.作为可直接饲用微生物,纳豆芽孢杆菌能在 肠道内生长,分泌各种酶和维生素,促进小肠黏膜 细胞的增殖,促进胃肠道各种消化酶活性,并具有 抑制肠道内有害菌的作用.犊牛直接饲喂纳豆枯草 芽孢杆菌对增强犊牛机体免疫和促进胃肠发育具有 良好的效果『13】. 2.2枯草芽孢杆菌在生物农药中的应用 2.2.1枯草芽孢杆菌在动物养殖中的作用 枯草芽孢杆菌在水中大量繁殖时分泌的胞外酶 可分解,吸收水及底泥中的蛋白质,淀粉,脂肪 等有机物,有降低水体富营养化和清除底泥的作 用.在作用过程中,有机营养一部分转化为细胞 物质,大部分转化为细菌活动的能量.在其转化 过程中,氨气,氮气就从水中逸散到大气.用这 种方法,水中氨氮和硝基氮可除去80%,90%.另 一 部分有机营养转化为优势的有益菌体.此法广 泛应用于河蟹育苗,虾类养殖以及河触,黄鳝, 甲鱼养殖『l4】. 第9期李明等:枯草芽孢杆菌的研究与应用?113? 2.2.2枯草芽孢杆菌在农作物病虫防治中的作用 随着人们环保意识的加强,生物防治因其对 环境,生态和人类健康安全的优点,受到各国政 府的广泛重视,并发挥着越来越重要的作用.应 用枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究具有悠久的 历史,目前全世界收集保存了几百株野生型枯草 芽孢杆菌菌株,研究证实该种革兰氏阳性细菌能 够产生40多种具有不同结构的抗菌物质,其中很 多具有优良性状的菌株已经应用于生产实践,例 如,美国的GBO3,MBI600,QST713和B.subtilis var.amyloliquefaciensFZB24,澳大利亚开发的 ubtilisA213,日本东京技术研究所的subtilisRB, 14,中国开发的B916,B908,B3,B903,XM16 等Il51.王益民将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌进 行细胞融合获得了具有抑菌杀虫作用的融合子 CF103~,田间试验结果显示,CF103能兼治水稻 纹枯病和稻纵卷叶螟,对照区病情指数为49.8%, 虫害率为41.5%,而防治区分别为0%,36.9%和 1.7%,12.1%.陈中义等构建了含有CrylAc基因的两 个穿梭表达质粒载体旧,导人生防枯草芽孢杆菌 B916,获得了兼有杀虫防病效果的基因工程菌 Bs2014和Bs2249,同时还将CrylAb,CrylAC, Cryl2Aa等杀虫基因导入B916并获得了一系列单价 和双价杀虫防病工程菌[181. 3枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的 应用 枯草芽孢杆菌除主要用于其自身酶系和抗生 素外,也用于作为表达系统和细胞质融合的研究. 3.1枯草芽孢杆菌表达系统的研究 自1958年Spizizen发现枯草杆菌168菌株能 摄取外源基因以后ll91,随着DNA重组技术的建立, 特别是金黄色葡萄球菌(StophyloCOCCltSaureus)带抗 性标志的质粒可作为其载体的发现,枯草杆菌基 因工程研究迅速发展. 芽孢杆菌作为原核表达系统与大肠杆菌表达 系统有很大的区别,芽孢杆菌不能识别大肠杆菌 的启动子,因此构建表达外源基因的枯草杆菌表 达系统是研究者关注的问题.目前尚无商品化的 枯草芽孢杆菌专用表达载体,为构建枯草芽孢杆 菌的表达载体,获得枯草芽孢杆菌能够识别的启 动子序列是首要条件. 陈晓月等根据GenBank中枯草芽孢杆菌的P43 启动子基因序列,设计合成了一对引物,用PCR 方法钓取枯草芽孢杆菌AS.1655菌株的P43启动子 基因,PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后,连接到 pMD18T—simple载体上,进行序列测定.测序结果 表明,枯草芽孢杆菌AS.1655菌株的启动子全长 427bp,由两个叠加的启动元件组成,分别为 和卯RNA聚合酶识别的位点,与GenBank中的 其他序列比较发现核苷酸的同源性为99.5%,说明 枯草杆菌启动子的基因序列高度保守_圳. 陈中义等分别以枯草芽孢杆菌一大肠杆菌穿梭 质粒pHB201和pRP22为载体,通过感受态转化方 法,将BtHD21杀虫蛋白基因CrylAC导人了水稻 纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916~". 3.2枯草芽孢杆菌细胞质融合方面的研究 早在1981年,复旦大学的江行娟等就发现, 在PEG存在下,枯草杆菌BD366(pUB110)菌株和 G1菌株的原生质体以10,10的融合率发生融合. 高温能使质粒pUB110消除,质粒消除后融合子的 菌落形态转变成为亲本Gl的形态特征.他们认为 双亲细胞融合后没有发生遗传重组,而是在分裂过 程中发生分离,于是质粒pUB110可能出现在G1 细胞中,他们的试验为通过细胞融合的质粒转移和 由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初 步证据I221. 上世纪90年代,唐文华等和刘伊强等将枯草 芽孢杆菌与Bt通过细胞融合获得了具有抑菌杀虫 作用的融合子,从而使得该菌既有抗虫性又有抗药 性,成为一种极有前景的农药制剂例. 4枯草芽孢杆菌应用中存在的问题 枯草芽孢杆菌的产业化应用尚不成熟.首先是 在医药方面,我们尽管已经证明了枯草纤溶酶具有 良好的溶血栓效果,但是在国内相应的商品化的药 品却不多见.而且枯草脂肪酶用于制作相应的药物 还不成熟,有待进一步研究.其次,在农业方面一 些相应的生物农药和饲料也没有得到大范围的应 用.这主要是由于科技的不均衡性和理论转化为实 际的考察期较长造成的. 枯草芽孢杆菌自身有需要克服的问题.枯草芽 孢杆菌虽然可以直接作用于农业来抗一些植物病虫 害,然而,天然野生型微生物菌剂存在天生的不 ? l14?东北农业大学第40卷 足,如产品持效期短,见效慢,作用对象比较单 一 ,易受自然环境影响,竞争存活能力有限等[251. 尽管枯草芽孢杆菌已经作为表达系统并在试 验中应用,但是其自身具有的多酶体系使得转入 它的外源质粒不太稳定,从而使其作为表达系统 有一定的困难. 5展望 尽管枯草芽孢杆菌在应用中存在一些问题, 但是人们也在不断地研究克服其缺点的方法,例 如陈乃用早在1993年就详细地分析了枯草芽孢杆 菌的质粒稳定性问题,并提出了一些相应的解决 措施[261,可以说枯草芽孢杆菌成为像大肠杆菌那样 成熟的表达系统只是时间问题.同时枯草芽孢杆 菌中的其他酶,如淀粉酶和蛋白酶也逐渐成为了 人们关注的热点.这些都将会为枯草芽孢杆菌的 应用开拓新的领域.随着科学技术的不断进步, 那些限制枯草芽孢杆菌应用的问题将逐一被解决, 而枯草芽孢杆菌也必将迎来一个更宽广的应用空 间. 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