浅论阿米卡星对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤作用

浅论阿米卡星对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤作用 浅论阿米卡星对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤作用 作者: 刘双月,王爱梅,许涛,牟华【摘要】 目的 研究阿米卡星(amikacin，AMK)在不同给药时间内对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤作用，探讨AMK的耳毒性。方法 豚鼠随机分为对照组、AMK 3 d组、AMK 7 d组和AMK 11 d组。采用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色方法，并结合听脑干反应(auditory brainstem response，ABR)测试，观察用药前后耳蜗毛细胞形态及听功能的改变。结果 AMK首先损伤耳蜗底回的外毛细胞,并且随着给药时间延长，损伤逐渐向顶回发展，外毛细胞缺失明显增多，而AMK对内毛细胞的损伤要轻于外毛细胞。听功能改变与形态学变化基本一致。结论 AMK可损伤豚鼠耳蜗毛细胞，导致听功能下降。 【关键词】 阿米卡星;豚鼠;耳蜗;听脑干反应 Impairment Effect of Amikacin on Cochlear Hair Cells in Guinea PigLIU Shuangyue, WANG Aimei, XU Tao, MU Hua(Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract:Objective To investigate the impairment effect of amikacin (AMK) on cochlear hair cells in guinea pig at different injection time, and to explore ototoxicity of AMK. Methods Guinea pigs were randomly assigned to four groups: control group, AMK 3-day group, 7-day group and 11-day group. Tetramethylrhodamine isothiocyanate-labeled phalloidine staining and auditory (ABR) measurement were used to evaluate the changes of hair cells brainstem response morphology and auditory function before and after the drug treatment. Results Outer hair cells (OHCs) in the basal turns were first impaired by AMK, and the impairment of OHCs developed to the apical turns with time prolonging, and the loss of OHCs was increased significantly. The injury of inner hair cells (IHCs) induced by AMK was lighter than OHCs. Change of auditory function was basically consistent with that of morphology. Conclusions AMK can damage the cochlear hair cells, leading to decline in auditory function. Key words:amikacin; guinea pig; cochlea; auditory brainstem response 氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)具有强大的抗革兰氏阴性杆菌的作用, 加之价格低廉, 是临床控制感染的常用抗生素[1]。但是AmAn具有严重的耳毒性，可导致耳蜗毛细胞、前庭毛细胞及螺旋神经节细胞的损伤[2-3]。阿米卡星(amikacin, AMK)为半合成的AmAn，亦可对耳蜗毛细胞造成不可逆性的损伤，然而AMK在不同给药时间内对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤特点及其与听功能变化的关系，目前尚不清楚。据此，本研究应用异硫氰酸四甲基罗丹明 (Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)标记的鬼笔环肽荧光染色方法，并结合听脑干反应(auditory brainstem response，ABR)测试，观察用药前后豚鼠耳蜗毛细胞形态及听功能的改变，以探讨AMK的耳毒性。 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康白毛红目豚鼠47 只，体重250,300 g，雌雄不限，耳廓反射灵敏，无中耳炎，由辽宁医学院实验动物中心提供。实验期间所有豚鼠均在安静状态下饲养并给予常规饮食。 1.2 主要试剂和仪器 阿米卡星注射液(0.1 g/mL，批号090327)由苏州第六制药厂生产，TRITC-鬼笔环肽购自美国Sigma公司，Smart EP OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统由美国智听公司生产，ZEISS A1荧光显微镜由德国Zeiss公司生产。 1.3 动物分组与耳毒模型建立 将动物随机分成4 组，即对照组10 只，AMK 3 d组11 只，AMK 7 d组12 只，AMK 11 d组13 只。以上4 组中，AMK 3 d组、7 d组和11 d组每天肌肉注射AMK 400 mg/kg，分别连续给药3 d、7 d和11 d;对照组则每日肌肉注射等量生理盐水。用药期间监测动物体重以调整药量。 1.4 ABR测试 各组动物于用药前及停药后24小时内分别测试ABR。操作在隔音屏蔽室内进行。豚鼠用1 %戊巴比妥钠40 mg/ kg 经腹腔麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下，屏蔽耳机距测试豚鼠外耳道口0.5 cm。应用Smart EP OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统给予短纯音(tone burst)刺激, 选取 4、 12、24 kHz 3个频率分别进行测试并记录ABR阈值(听阈)。重复率39.10次/s，带通滤波100,1 500 Hz，叠加1 024 次，扫描时程16.0 ms。声刺激强度从95 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，听阈判定以刚出现ABR ?波为准并至少重复两次。同一 刺激频率下给药前后的听阈差值记为ABR阈移。 1.5 耳蜗铺片TRITC-鬼笔环肽荧光染色 各组豚鼠于最后一次ABR测试结束后，快速断头，取出听泡。解剖显微镜下去除镫骨，打开前庭窗和蜗窗，用含有4%多聚甲醛的0.1 M PBS(pH 7.4)灌流3 次，并置于该溶液中4 ?下固定24 h。然后将标本置于8 % EDTA中脱钙2,3 d。PBS漂洗2 次后，于解剖显微镜下分离全耳蜗基底膜。将基底膜置于0.25% Triton X-100溶液中浸泡50 min，然后进行TRITC-鬼笔环肽染色45 min。PBS漂洗后分回铺片，以荧光封固剂封片。荧光显微镜下观察各回毛细胞损伤情况。 1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件包对实验数据进行统计学分析，数据以?s示。各组之间ABR阈移的比较采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 TRITC-鬼笔环肽荧光染色 荧光显微镜下观察，可见TRITC标记的鬼笔环肽染色呈现红色荧光，主要定位在外毛细胞(outer hair cell, OHC)和内毛细胞(inner hair cell, IHC)的静纤毛、表皮板。此外，Deiter细胞等亦有丝状F-肌动蛋白(F-actin)的表达。对照组耳蜗毛细胞形态结构完好，三排OHC的纤毛呈V 形排列整齐，一排IHC的纤毛呈一形排列，耳蜗各回OHC 和IHC均无缺失(图1 A)。AMK 3 d组耳蜗底回OHC偶有缺失，而其它回OHC以及各回IHC均无损伤(图1B)。AMK 7 d组耳蜗底回OHC的缺失有所增多，并向上发展到第二回;IHC基本正常(图1 C)。AMK 11 d组耳蜗底回OHC出现大量缺失并向上延伸到顶回，缺失区域被Deiter细胞取代形成网状瘢痕;IHC出现散在损伤(图1 D)。 2.2 ABR测试 连续给药后，在各刺激频率下，AMK 3 d组豚鼠的ABR阈移与对照组比较均无显着性差异(P0.05);AMK 7 d和11 d组豚鼠的ABR阈移与对照组比较均有显着性差异 (P0.01)，并且随着AMK给药时间的延长，ABR阈移亦明显增大(P0.01)(图2)。注: ?与对照组比较P0.01，*与AMK 3 d组比较P0.01，?与AMK 7 d组比较P0.01 3 讨 论 F-actin是一种耳蜗毛细胞骨架蛋白，具有收缩及固定静纤毛、使OHC运动、保持毛细胞形状以及支持和传导等多种作用。TRITC标记的鬼笔环肽是一种特殊的F-actin标记物，因此可以用于识别耳蜗毛细胞，判断其形态变化。我们采用耳蜗基底膜铺片，观察到经TRITC标记的鬼笔环肽染色呈现红色荧光，主要定位在OHC和IHC的静纤毛、表皮板，并且在Deiters等支持细胞也有F-actin的表达。这与以往学者的观察结果相一致。 在体和离体实验表明，AmAn引起的耳蜗毛细胞损害总是从耳蜗底回开始并逐渐向顶回发展，并且OHC的损伤要先于IHC 。本实验观察到，AMK首先损伤耳蜗底回的OHC，并且随着给药时间延长，OHC损伤从底回向顶回延伸，OHC缺失数量逐渐增多，而IHC的损伤要远轻于OHC，符合AmAn耳毒性的损伤规律。丁大连等125-131将bodipy标记的庆大霉素投放到耳蜗器官培养系统，观察到OHC摄取庆大霉素的能力强于IHC，底回OHC摄取庆大霉素的能力强于顶回OHC。因此，豚鼠耳蜗顶回和底回对AMK的敏感性不同，可能与耳蜗顶回和底回OHC对AMK的摄取能力不同有关。 d 巴云鹏等报道，豚鼠连续注射AMK 3 d之内，听力损伤不明显，而连续用药6后，与用药前相比ABR阈值则有显着的变化。我们观察到的结果与巴云鹏等的研究结果基本一致。本实验连续注射AMK 3 d后，ABR阈移较对照组无明显变化(P0.05);而连续注射AMK 7 d后，ABR阈移明显增大，并且在连续注射11 d后，ABR阈移达到最大，与形态学损伤相平行;并且随着给药时间的延长，AMK的耳毒性效应亦逐渐增强，呈现明显的时效关系。此外，本实验还观察到，虽然AMK 3 d组豚鼠ABR阈移与对照组比较无显着性差异，但是耳蜗底回已开始有OHC缺失，表明AMK引起耳蜗形态方面的损伤要早于听功能的改变，同时也进一步证实了AmAn可在内耳蓄积，而最后的听力损伤是这种蓄积的结果125-131。 目前认为，AmAn可以与金属铁形成AmAn-铁复合物，其具有氧化还原活性，可催化体内自由基的大量产生。过多的自由基将打破其在体内的平衡，通过激活调节细胞死亡的信号转导途径及其相关基因，使构成生物膜的脂质或蛋白质、核酸等生命大分子发生过氧化，从而引起耳蜗毛细胞损伤及死亡，最终导致听力丧失。为此，人们尝试应用依布硒啉、甲磺酸去铁胺(deferoxamine mesylate，DFO)等抗氧化剂来防护AMK的耳毒性并取得了较好效果213-217,157-161，表明AMK的耳毒性亦与其促进自由基的过量生成有关。至于AMK的耳毒性损伤中，自由基通过激活哪些信号转导途径继而引起耳蜗毛细胞的死亡，尚需进一步深入研究。【参考文献】 [1] 龙敏, 陈蓉，王颖. 氨基糖苷类抗生素耳毒性的药物防治方法研究进展[J]. 中国药房, 2017, 16 (16): 1264-1265. 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