综述：自噬性程序性细胞死亡研究进展new! - 北京大学人类疾病基因中心

综述：自噬性程序性细胞死亡研究进展new! - 北京大学人类疾病基因中心 博士生资格考试综述(2005年10月24日) 自噬性程序性细胞死亡研究进展 陈丽娜 北京大学基础医学院免疫学系分子免疫实验室 北京大学人类疾病基因研究中心 前言 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在清除无用的、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。程序性细胞死亡调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡性程序性细胞死亡(Apoptosis)、自噬性程序性细胞死亡(Autophagy)和细胞坏 1死(Necrosis)三种类型。 凋亡性程序性细胞死亡也称为?型程序性细胞死亡。对细胞凋亡的形态学、参与分子及调控机制的研究由来已久。凋亡细胞的典型形态学特点表现为:细胞皱缩、体积缩小;部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬;磷脂酰丝氨酸外翻;细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。凋亡过程重要的参与分子有:凋亡促进分子半胱-天冬氨酸蛋白酶 2(Caspases)家族、Bax/Bak、细胞色素C等;凋亡抑制分子IAP、Bcl-2家族分子等。凋亡信号通过细胞膜受体途径(Fas/FasL、TNF/TNFR等)或线粒体途径传导，依次激活起始Caspases (Caspase-8或Caspase-9) 和下游信号转导通路的关键分子执行Caspase (Caspase-3), 3,4启动凋亡。另外，凋亡形式的程序性细胞死亡也可以Caspases非依赖的方式进行。 细胞坏死是细胞对外界损伤刺激的一种非程序性死亡方式，其形态学特点明显异于凋 亡，常伴随炎症的发生。 近年来，一种新的程序性细胞死亡方式-自噬性程序性细胞死亡吸引了越来越多细胞生物学家的注意。人们将Autophagy称为?型程序性细胞死亡，这种形式的细胞死亡表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解。自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。随着参与自噬性程序性细胞死亡途径的关键分子的鉴定成功，我们对其分子机制、生理功能和在病理过程中的作用有了进一步的了解。 1 2004年12月出版的《科学》杂志预测对自噬性程序性细胞死亡的研究会成为2005年科技领域的六大热点之一，且排在第一位。一份全新的国际性杂志《Autophagy》已在2005年4月份出版，有关自噬研究的第一次国际性会议也已于2005年4月在意大利召开。估计正如当年对细胞凋亡的研究一样，对自噬的关注很快会在生命科学领域形成一个新的研究热点。本综述将就哺乳动物细胞自噬(Autophagy)与自噬性程序性细胞死亡的形态学特点、关键分子加工机制、信号转导、与细胞凋亡的关系、在病理生理过程中的作用及其研究方法展开讨论。 一、Autophagy 的形态学特点及分类 Autophagy 是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式，在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与autophagy 的同源基因。相对于主要降解短半衰期 5,6蛋白质的泛素-蛋白酶体系统，细胞的自噬被认为是参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解。在形态学上，即将发生autophagy 的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡(Preautophagosome)。前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜结构形成的空泡，其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆，这种双层膜被称为自噬泡(Autophagosome)。自噬体双层膜的起源尚不清楚，有人认为其来源于粗面内质网，也有观点认为来源于晚期高尔基体及其膜囊泡体，也有可能是重新合成的。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分(如蛋白质分解为氨基酸，核酸分解为核苷酸)，并被细胞再利用，这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体(Autophagolysosome or Autolysosome)。尽管在进化过程中，底物运送到溶酶体的机制发生了变化，autophagy 本身却是一个进化保守的过程。与其他蛋白水解系统相似，溶酶体参与了细胞内组成成分的持续性转运和翻新(尤其是长半衰期蛋白质的分解和再利用)。在autophagy 过程中，除可溶性胞浆蛋白之外，像线粒体、过氧化物酶体等细胞器或细胞器的一部分，如高尔基体和内质网的某些部分都可被溶酶体所降解;最近，有研 7-10究发现，酵母细胞核的某些区域也可通过autophagy 途径被清除。 根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞autophagy 可分为三种主 11要方式 :大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy)。在大自噬形式的autophagy中，细胞浆中可溶性蛋白和变 2 性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构所包裹，即前面提到的自噬泡(Autophagosome)，并由自噬泡将其携带到溶酶体中降解加工;小自噬形式的autophagy与之不同，溶酶体膜自身变形，包裹吞噬细胞浆中的底物。在大自噬和小自噬两种形式的autophagy中，底物被其所包裹的膜性结构带至溶酶体后，均发生膜的迅速降解，进而释放出其中的底物，使溶酶体中水解酶对底物进行有效水解，保证了细胞对底物的再利用。分子伴侣介导的自噬首先由胞浆中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列 (如KFERQ-样模体) 并与之结合，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的受体Lamp2a (Lysosome-associated membrane protein 2a) 结合后，底物去折叠;溶酶体腔中的另外一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，进入溶酶体腔中的底物在水解酶作用下分解为其组成成 12分，被细胞再利用 。因此，自噬可被认为是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。哺乳动物细胞三种形式autophagy的比较参见图一和表一。 二、Autophagy发生过程的分子机制 目前至少已经鉴定出27种参与酵母autophagy的特异性基因，另外还有50多种相关基因。其命名从最初称为APG，AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬相关基因ATG AuTophaGy-related)。哺乳动物自噬相关基因也已由最初的Atg/Apg/Aut/Cvt，统一命名为( Atg。哺乳动物自噬基因的命名与酵母相似，但也有个别差异，如酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母的ATG6在哺乳动物则称为Beclin 1(表二)。随着研究的深入，许多酵母中autophagy相关基因的同源物均已在哺乳动物中找到，并分离鉴定成功，这说明autophagy是一个进化保守的过程，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似。 1. 参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统及其作用 1.1. 参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统 在哺乳动物autophagy的自噬泡形成过程中，由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10, Atg12 和LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工 13修饰过程:Atg12-结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用(图二)。Atg12-结合过程与前自噬泡(Preautophagosome)的形成相关，而LC3修饰过程对自噬泡(Autophagosome)的形成必不可少。 Atg12首先由E1样酶Atg7活化，之后转运至E2样酶Atg10，最后与Atg5结合，形成 3 自噬体前体(Autophagosomal precursor)。LC3前体(ProLC3)形成后，首先加工成胞浆可溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样，LC3-I也被Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3-II即被溶酶体中的水解酶降解。LC3是酵母autophagy 相关基因ATG8的类似物。哺乳动物细胞内源性Atg5和Atg12主要以结合形式存在;而胞浆可溶性LC3-I和膜结合型LC3-II的比例在不同组织和细胞类型变化很大。哺乳动物细胞autophagy 过程中两条泛素样加工修饰过程可以互相调节，互相影响。 Atg5 基因缺陷的鼠胚胎干细胞缺乏Atg12-Atg5复合物，其LC3-I到LC3-II的修饰同 14时受到影响 。在哺乳动物细胞HEK293中，Atg3除作用于其底物LC3, GATE-16 (Golgi-associated ATPase enhancer of 16 kDa, 分子量为16kDa的高尔基体相关ATP酶增强子) 和GABARAP(γ-amminobutyric acid receptor associated protein, γ-氨基丁酸受体相关蛋 15,16白)外，还与Atg12和Atg12-Atg5复合物相互作用 。虽然HEK293细胞中单独超表达游离的Atg12促进了LC3-I到LC3-II的修饰，过多Atg12-Atg5复合物的存在却可抑制上述 15修饰过程 。在Atg7存在的情况下，HEK293细胞超表达哺乳动物Atg3可促进Atg12-Atg5 16复合物的形成。这些研究结果提示Atg3与Atg12和Atg12-Atg5复合物的相互作用在Atg12结合和LC3修饰两条泛素化修饰过程中起重要作用。哺乳动物Atg10除结合Atg12外，还 17与LC3相互作用。Atg10与Atg12形成E2样底物中间物，但不与LC3结合。在Atg7存 17在下，超表达Atg10还可促进LC3-I到LC3-II的修饰 。酵母和哺乳动物的Atg7以同源二 18,19聚体形式存在 。这些结果说明Atg12-结合和LC3-修饰两条泛素样修饰过程相互偶联，Atg10和Atg3两种E2样酶在调控autophagy上述两条泛素样修饰过程中发挥重要作用。 1.2. 泛素化修饰在自噬泡形成过程中的作用 哺乳动物细胞autophagy自噬泡的形成过程与Atg12-结合和LC3修饰两条泛素样修饰 20过程息息相关。如图三所示:在自噬泡形成的早期阶段(Preautophagosome)，由Atg12-Atg5-Atg16L形成的复合物即与其外膜结合，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构;另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3向自噬泡的募集。Atg5复合物在膜上的定位决定膜的弯曲方向，膜向着背对Atg5复合物的方向延伸。当双层膜结构的自噬泡即将形成环状闭合结构或刚刚闭合时，Atg5复合物便从膜上脱离下来，只留下膜结合形式的LC3-II定位于自噬泡膜上。因此，LC3-II含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。当哺乳动物细胞发生 4 autophagy时，细胞内LC3的含量及LC3-I向LC3-II的转化均明显增加。因此，通过检测细胞内LC3-II的含量变化，可以方便地判断细胞状态，判断其autophagy是被诱导还是被抑制。 Atg5复合物对自噬泡的形成至关重要，有报道称破坏小鼠胚胎干细胞Atg5基因导致 14自噬泡形成缺陷 ;基因突变的Atg5丧失了与Atg12结合的能力，同时也导致自噬泡延伸障碍。Atg5-Atg12-Atg16L复合物为同源四聚体组成的大蛋白复合物，分子量约为800kDa。 正常哺乳动物细胞中绝大多数Atg5、Atg12和Atg16L以复合物形式存在，说明Atg5-Atg12-Atg16L复合物的存在并不会导致自噬泡的形成和活化。哺乳动物绝大多数Atg5-Atg12-Atg16L复合物存在于胞浆中，在autophagy自噬泡膜的延伸过程中，一部分Atg5-Atg12-Atg16L复合物定位于膜表面，自噬体的双层膜结构形成后，此复合物便从膜上解离下来。因此，Atg5-Atg12-Atg16L复合物的存在是autophagy过程中膜的延伸所必需的。同样，哺乳动物中酵母Atg8的同源物LC3也要首先经历泛素样翻译后修饰过程，然后定位于autophagy自噬泡膜表面。哺乳动物LC3合成之后，在Atg4同源物的催化下，其C末端5个氨基酸残基被切割下来，暴露出C端的甘氨酸残基。这种经过加工的LC3称为LC3-I，定位于胞浆中。之后，LC3-I在哺乳动物E1泛素样酶Atg7和E2泛素样酶Atg3的催化下，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，称为LC3-II。电泳过程中，LC3-II的迁移速率要快于LC3-I。因此，在LC3的免疫印记中，通常出现两条带:LC3-I的表观分子量为18kD，LC3-II的表观分子量为16kD。LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬泡的数量呈正相 21-/-关 。LC3-II的形成依赖于Atg12-Atg5复合物:在Atg5的胚胎干细胞或表达结合缺陷型 K130R14Atg5基因(Atg5)突变株的胚胎干细胞中，LC3-II是检测不到的 。 2. ?型磷脂酰肌醇3磷酸激酶 (Class? PI3K) 自噬体的形成也依赖于?型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class? PI3K)的作用。Class? PI3K可磷酸化磷脂酰肌醇(PtdIns)，生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)。PtdIns3P募集胞浆中含,FYVE,或,PX,基序的蛋白质，用于自噬体膜的形成。Class? PI3K 还可与Beclin 1 22形成复合物参与自噬体的形成 (图四)。PI3K抑制剂(3,MA, Wortmannin)可干扰或阻断自噬体形成。 3.其它 Sec基因(Sec12、Sec16、Sec23/24)在Saccharomyces cerevisiae中参与了自噬体膜的形成。另外，中间丝、微管等细胞骨架成分也参与了自噬体形成晚期步骤的完成。 5 表一:哺乳动物细胞三种主要形式autophagy 的比较 特点 大自噬 小自噬 分子伴侣介导的自噬 活化方式 压力与应激 组成性 压力与应激 物种 哺乳动物 是 是 是 非哺乳动物 是 是 , 机制 内吞 是 是 否 膜来源 非溶酶体 溶酶体 / 受体介导 否 否 是 参与成分 ATP 是 是 是 GTP和GTPases 是 是 否 细胞骨架 是 否 , 分子伴侣 , , 是 囊泡酸性pH 是 是 否 膜电位 , 是 是 PI3激酶 是 , 否 底物 细胞器 各种类型 各种类型 无 可溶性胞浆蛋白 各种类型 各种类型 KFERQ-标签 靶信号 泛素样,葡萄糖去除, , KFERQ样模体 蛋白去折叠 否 否 是 选择性 某些形式 某些形式 总是 6 表二:哺乳动物自噬相关基因 Gene Designation Yeast Human Mouse Comment ATG1 ULK1 Unc-51-like kinase interacts with GATE-16 and GABARAP ATG3 hATG3/hAPG3 mATG3/mAPG3 an E2-like enzyme for LC3,GABARAP, and GATE-16 ATG4 hATG4A/HsATG4A/ Cysteine protease for GATE-16 HsAPG4A/autophagin-2 hATG4B/HsATG4B/ Cysteine protease for LC3, GABARAP, hAPG4B/autophagin-1 and GATE-16; Delipidating enzyme for LC3-? and GABARAP hAtg4C/HsAUTL1/ Cysteine protease autophagin-3 hATG4D/autophagin-4 ATG5 hATG5/hAPG5 target protein of Atg12 ATG6 beclin 1 beclin 1 related to tumorigenesis ATG7 hATG7/HsGSA7/ mATG7/mAPG7 an E1-like enzyme for Atg12 and Atg8 hAPG7 homologues ATG8 LC3 modifier for autophagosomes GABARAP modifier GATE-16 modifier ATG8L/APG8L unknown ATG10 mATG10/mAPG10 an E2-like enzyme for Atg12 ATG12 hATG12/hAPG12 mATG12/mAPG12 modifier for autophagosome ATG16 ATG16L/APG16L interacts with Atg5 7 8 三、自噬过程的信号调控 9 参与自噬过程的信号转导分子非常复杂，目前尚未完全被我们所了解。 1. mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)信号途径 TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬 gatekeeper)”作用。 的发生，是自噬的负调控分子，并发挥 “门卫( 哺乳动物细胞中的核糖体蛋白质S6(p70S6)抑制自噬的发生，它位于TOR信号途径下 23游，其活性受mTOR调节。纳巴霉素(Rapamycin)通过抑制mTOR的活性，发挥抑制p70S6活性、诱导自噬发生的作用。 TOR激酶抑制自噬的信号通路目前尚未完全明了。在酵母细胞，TOR激酶可能通过抑 24制ATG1激酶的活性来抑制自噬的发生。 2.Class?PI3K/PKB途径 Class?PI3K是自噬的负调节分子，它可磷酸化PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2，生成PtdIns(3，4)P2和PtdIns(3，4，5)P3，然后结合Akt/PKB和它的活化分子PDK1, 抑制自噬的发生。 结节性硬化复合物1(TSC1)和TSC2蛋白位于Class?PI3K/PKB途径的下游，可通过抑制小G蛋白Rheb，抑制TOR激酶的活性，对自噬发挥正向调节作用。 PTEN磷酸酶也是自噬的正向调节分子，它使PtdIns(3，4，5)P3去磷酸化，从而解除Class?PI3K/PKB途径对自噬的抑制。 25,26上述两条自噬过程的信号调控途径示意图见图五。 3.G,i3蛋白和氨基酸 GTP结合的G蛋白亚基G,i3是自噬的抑制因子，而GDP结合的G,i3蛋白则是自噬的活化因子。GAIP(G Alpha Interacting Protein)作为RGS (Regulators of G-protein Signaling) 家族成员之一，通过G,i3蛋白加速GTP的水解，促进自噬的发生。 AGS3(Activator of G-protein Signaling 3)也能正向调控自噬效应。 氨基酸作为自噬过程蛋白降解物的终产物，可负性反馈调节自噬。外源性氨基酸的去除，可以阻断TOR信号途径，而自噬产生的内源性氨基酸可补足氨基酸缺陷，恢复TOR信号转导。 4.其他 激素在自噬的调控中也起重要作用。胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素则促进自噬。酪氨酸激酶受体、PKA、casein激酶?、MAP激酶、calcium 也存在于自噬过程错综复杂的 10 调控网络中，但其机制还不甚清楚。 四、Autophagy与细胞凋亡的关系 尽管最初认为Autophagy 与凋亡两种程序性细胞死亡方式在形态、生化指标、参与分子和机理方面均存在不同，近年来越来越多的研究提示二者在某些情况下可以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发Autophagy或凋亡;参与Autophagy 和凋亡的分子也可能存在交叉，这些分子在Autophagy与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥正向或负向作用。随着研究的深入，Autophagy与凋亡之间的相互关系似乎变得越来越复杂了。 最近有报道称Beclin 1可通过增强Caspase-9的活性加强化疗药物CDDP诱导的人胃癌细胞MKN28的凋亡，说明作为Autophagy重要调控基因的Beclin 1也可参与细胞凋亡的 27调控。营养剥夺诱导的细胞Autophagy在Atg基因(Atg5, Atg6/Beclin 1, Atg10, Atg12)干扰RNA或Autophagy特异抑制剂剂(如3-MA)存在的情况下，细胞发生凋亡形式的程序 28性细胞死亡。 广谱Caspase抑制剂zVAD 通过抑制Caspase-8活性，发挥诱导自噬性程序性细胞死 29亡的作用，并且这种程序性细胞死亡需要ATG7和Beclin 1基因的参与。 应用RNA干扰或同源重组技术将LAMP-2基因敲除，细胞在营养剥夺情况下，首先发生Autophagy，继而发生凋亡，同时伴随细胞凋亡的典型特点，如线粒体跨膜电位的丧失、 30Caspase的活化和染色质的凝集。另外的研究也证明LAMP-2基因缺陷的小鼠死亡率增加， 31幸存的小鼠出现多组织广泛的胞浆空泡。凋亡刺激信号神经生长因子(NGF)去除或将胞嘧啶阿拉伯糖苷加入含NGF的交感神经的神经元，细胞在出现以DNA片断化为主的凋亡 32特点前，首先出现大量的自噬泡 。最近，Pyo JO 等人的研究发现由IFN-γ或Atg5超表达诱导的Hela细胞死亡之前，首先发生以大量胞浆空泡出现为主的Autophagy的形态学特点。 K130R由IFN-γ诱导的胞浆空泡的出现和细胞死亡可被3-MA或Atg5超表达所抑制，而广谱胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk只能抑制细胞死亡，却不能抑制胞浆空泡的出现。这说明以胞浆空泡出现为主的Autophagy可继发Caspase依赖的细胞死亡。进一步的研究证明Atg5通过和FADD (Fas-associated protein with death domain) 的相互作用发挥促进Autophagy性程序 33性细胞死亡的作用, 而FADD是细胞膜受体Fas/FasL途径凋亡的重要参与分子。另外， 11 Bcl-2家族蛋白不仅参与凋亡形式的程序性细胞死亡，还参与了对Autophagy形式细胞死亡 34,35的调控。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配基(TRAIL, TNF-related apoptosis inducing ligand)在人乳腺上皮细胞MCF-10A组织形成过程中，诱导Autophagy形式的细胞死亡以 36形成中空的腔状结构，此过程同时伴随发生Caspase依赖的细胞凋亡事件。 五、Autophagy在病理生理过程中的作用 自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。最近的研究提示自噬也参与了天然免疫应答和适应性免疫应答。 在讨论自噬与疾病的关系之前，我们首先需要明确的一个基本观点是:自噬对疾病的发生起促进作用还是抑制作用,当环境中的营养物质缺乏时，细胞通过自噬作用对胞内大分 37子物质进行降解，提供维持细胞存活所需的最低能量;某些毒素和病原体通过自噬途径被 38,39包裹、降解清除 。变性的胞浆成分，如因错误折叠而形成的凝聚蛋白或受损的细胞器也 7, 40可通过自噬得到清除，从而使细胞免于受到进一步损伤 。因此，在某些疾病的早期阶段，激活自噬起到了阻止疾病进展的作用。 然而，另有报道称自噬还可参与?型程序性细胞死亡，即非凋亡形式的程序性细胞死亡。在自噬形式的程序性细胞死亡中，中间丝与微丝重新分布，但并不降解，激动蛋白仍然保持聚合状态，因此细胞骨架系统保持完好;与之相反，在凋亡形式的程序性细胞死亡中， 41很早就出现激动蛋白的解聚和中间丝的降解，细胞骨架系统遭到破坏 。综合最近的研究结果提示，Autophagy对细胞的作用具有两面性，可以说是一把双刃剑:既可以作为细胞生长的“朋友”，也可能成为“敌人”，这取决于疾病进展的不同阶段、细胞周围环境的变化和 42-46治疗干预措施的不同。 1.Autophagy与恶性肿瘤 当细胞发生恶性转化时，内环境的稳态遭到破坏，其合成代谢速率明显大于分解代谢速率。随着肿瘤进展阶段的不同，Autophagy所扮演的角色发生了很大变化。在癌症发生早 42,47期，抑制Autophagy导致癌前细胞的持续生长，此时Autophagy发挥的是肿瘤抑制作用。当肿瘤细胞持续分裂增值，癌症呈进展阶段时，癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧，这在处于实体肿瘤内部血供不良的癌细胞中尤其明显，此时Autophagy发挥的是促进肿瘤细 12 4849胞生长存活的作用 。此外，Autophagy还可保护某些肿瘤细胞免受放疗损伤 。据推测这种保护作用的机制可能是通过Autophagy清除受损的大分子或线粒体等细胞器，从而保护肿 50瘤细胞免于发生凋亡性程序性细胞死亡，维持恶性细胞的持续增殖。 Beclin 1 是酵母ATG6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物，在自噬泡形成过程中起重要作用。在人乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到高频率的Beclin 1单等位基因缺失。在人乳腺癌细胞系MCF-7中，Beclin 1蛋白表达下降，几乎检测不到。稳定转染Beclin 1促进了 51细胞的自噬活性，降低了其成瘤能力，这些均提示自噬活性与抑制细胞增殖有关。某些抗肿瘤治疗药物有可能通过Autophagy机制发挥作用，如被广泛用于乳腺癌治疗的药物它莫西 52芬可能通过激活细胞自噬，由神经酰胺介导上调Beclin 1表达发挥作用。某些肿瘤细胞由于存在凋亡通路特异基因的突变，不能发生凋亡形式的程序性细胞死亡，却仍可通过 49Autophagy途径得到清除。 2.Autophagy与肌病 关于肌病患者出现肌细胞胞浆空泡的报道很多，最近某些研究把其归因于自噬功能的 53改变。LAMP-2缺陷小鼠出现多组织广泛的自噬性空泡，其中包括骨骼肌和心肌。心肌超 31微结构的异常使其收缩功能严重受损 。 人LAMP-2 缺陷导致的Danon氏病也与横纹肌 54自噬泡的聚集有关。最近利用光镜和电镜的组织学研究方法证明Danon氏病和相关肌病 55的典型特征是胞浆中自噬溶酶体的大量聚集。电生理方法对某些肌病的研究同样证明了广 56泛自噬现象的存在。Pompe病又称?型糖元储积病，是由于溶酶体酸性alpha-葡糖酐酶缺乏引起心肌和骨骼肌糖元积聚导致的常染色体隐性遗传病。利用重组或转基因酸性alpha-葡糖酐酶进行的治疗性实验中，二者均可有效清除心肌和?型肌纤维中的糖元，但对?型肌 57纤维无效，其中自噬活性的增加是?型肌纤维对抗治疗的机理之一。 3.Autophagy与神经变性性疾病 自噬在神经变性性疾病的发生发展中起双重作用，它既可加速疾病的进展，在某些条 585960 件下又起保护作用 。在阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s)、亨廷顿氏病(Huntington’s) 61和帕金森氏病(Parkinson’s)中，溶酶体系统的形态学特征发生了显著变化，调控自噬的 62信号转导系统也同时发生改变。神经营养因子撤除的小脑葡氏神经元死于自噬性程序性细 63胞死亡 。在神经变性性疾病中起重要作用的神经递质多巴胺也可引起自噬性程序性细胞 64,65死亡 。最近，有报道称自噬在神经变性性疾病中还可起保护性作用。在神经变性性疾病 13 的早期阶段，激活自噬加速变性蛋白的清除阻止了疾病的进一步发展。例如亨廷顿氏病中， 66通过自噬途径对突变蛋白小片段的降解就阻止了它们的进一步聚集。激活自噬可加速细胞 67,68内蛋白聚合物的清除，而这种蛋白聚合物的存在是神经变性性疾病的典型特点之一。 神经变性性疾病受累神经元两个最主要的特征是:胞浆中蛋白聚集物的存在和大的蛋 14 白裂解体系活性的改变。尽管不同神经变性性疾病突变蛋白的种类不同，但蛋白聚集物形成的过程却极为相似。首先，受损蛋白错误折叠、构象改变，暴露出那些在正常情况下隐藏于蛋白内部的疏水性残基;然后，细胞活化分子伴侣系统和胞浆蛋白酶体系，促进这些错误折叠蛋白的再折叠或清除。最初，分子伴侣和蛋白酶可以逆转或在一定程度上延缓蛋白聚集物的形成;然而，随着受损蛋白的不断增多，当上述机制不足以完全清除时，这些分子伴侣和 69蛋白酶则被蛋白聚集物捕获，成为其中的一部分。尽管蛋白聚集可能是细胞对抗疏水残基暴露的保护机制，这同时使聚集的蛋白更加不易被蛋白酶降解，因此自噬成为降解这些变性 6940,70蛋白的唯一机制。激活自噬加速新合成的蛋白聚集物清除已经得到实验证实。然而，随着疾病的进展，蛋白聚集物越来越多，它们对溶酶体蛋白酶降解的敏感性下降，自噬的持续性激活导致细胞最终发生自噬性程序性细胞死亡。 4.Autophagy与病原体感染 细胞自噬机制的激活在清除病原体感染中也起重要作用。在对C. neoformans感染的小 71鼠巨噬细胞转录特点的研究中发现，与自噬相关的基因被诱导表达。巨噬细胞利用 72Autophagy机制对抗Legionella pneumophila感染。巨噬细胞以胆固醇依赖方式激活自噬， 7374,75清除胞内病原菌L. pneumophila的感染。Autophagy在植物免疫反应中的作用也有报道。 激活自噬不一定对病原体感染的细胞均起保护作用。例如激活Coxiella感染的中国仓 76鼠卵巢细胞的自噬机制，会为细菌最初的存活和扩增提供有利条件。脊髓灰质炎病毒和鼻病毒利用自噬机制促进病毒的复制和扩增，据推测其机制可能是自噬为病毒RNA复合物提 77供了膜性结构的包裹，帮助病毒颗粒以非裂解方式从受感染的细胞中释放出来。宿主自噬机制在沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)感染所致的沙眼、肺炎和动脉硬化等疾病的发 78病机制中起重要作用。冠状病毒复制依赖细胞自噬过程中双层膜囊泡的形成，并不被3-MA 7979所阻断;Autophagy基因Atg5敲除的胚胎干细胞中，冠状病毒复制缺陷。 5.Autophagy与衰老 自噬的激活在延缓由衰老造成的线粒体DNA体细胞突变的累积方面发挥关键性作用80。心肌细胞、骨骼肌纤维和其他长寿命的有丝分裂后细胞表现出明显的年龄相关的线粒体 81和溶酶体改变，自噬泡降解变性线粒体的能力下降。线粒体-溶酶体轴理论在衰老中的作 8283用已经得到实验验证。Keller JN等人的综述详细探讨了Autophagy与脑衰老的关系;最近又有研究指出:周期性终生服用抗脂解药物抑制胰岛素的分泌与轻度节食共同发挥抗衰老作用，推测其机理可能为短暂的血浆低胰岛素水平刺激了机体的抗衰老细胞修复机制，这种 84机制就是细胞的自噬。细胞自噬活性随年龄增加而下降，这种下降可能与年龄相关的消化 15 85吸收后氨基酸水平的增加和/或基础水平胰岛素受体信号传导途径的增加有关。与之相反，自噬溶酶体在衰老淋巴细胞中的聚集可加速细胞的病理变化，导致活化诱导的淋巴细胞凋亡 86或坏死。 六、Autophagy的监测与研究方法 1(形态学方法 1.1. 电子显微镜 迄今为止，电子显微镜是研究autophagy的唯一可信赖方法，细胞的自噬现象最初也 87是通过电子显微镜发现的。在电子显微镜下，自噬体(Autophagosome)由包裹未吞噬降解的胞浆物质、细胞器的双层膜结构组成;而自噬溶酶体(Autolysosome)由单层膜结构组成，其中包裹着处于不同降解阶段的胞浆成分。由于有时很难严格区分自噬体和自噬溶酶体，二者经常统称为“自噬泡” 。通过电镜可对细胞的自噬活性进行定量。自噬泡占胞浆总面积或体积的比例是目前通过电镜对细胞自噬活性进行定量的唯一方法。尽管最近计算机软件的进展允许我们进行快速定量，在应用这种形态学的评价方法时，我们仍需对采集于不同细胞的大量照片进行综合观察和考虑。在对酵母细胞自噬的研究中，利用囊泡蛋白酶缺陷细胞系或用蛋白酶抑制剂PMSF处理抑制自噬体的降解，仅通过光学显微镜就可观察到囊泡中未 88降解的自噬体。由于哺乳动物的溶酶体很小，应用光学显微镜观察自噬泡的方法是不行的。 1.2. Monodansylcadaverine (MDC) 染色 89Monodansylcadaverine (MDC) 是一种荧光染料，被用作自噬泡的示踪剂 。亚细胞成分表明MDC阳性结构中含有溶酶体酶，但不含早期/晚期内体标记物，这提示MDC可作为细胞自噬泡的标记物。然而，大多数MDC信号并不与GFP-LC3信号共定位，由于后者主要定位于自噬体，这说明MDC并不是自噬体的标记物。MDC阳性信号主要聚集于核周区域，而自噬体却均匀分布于胞浆内。这些MDC阳性的点状结构可与晚期内体及溶酶体 90标记物共定位。尽管在氨基酸饥饿情况下，MDC染色信号明显增加，这些信号并不能与溶酶体标记物相互区分。而且，只有当溶酶体物为酸性时，才可获得MDC阳性染色信号;对溶酶体内容物的中和可导致MDC染色立即消失或细胞溶酶体对MDC摄取的缺乏。然而，自噬体通常情况下并不一定是酸性的。某些MDC阳性的点状结构也可显示弱的GFP-LC3信号，这些结构可能代表自噬溶酶体。当自噬体与溶酶体融合时，其外膜上的LC3 16 21-/-逐渐脱离下来，而内膜上的LC3被溶酶体内的水解酶降解 。在Atg5小鼠胚胎干细胞中， 14细胞的自噬活性缺陷，不能产生自噬泡，然而仍可见大量的MDC阳性点状结构出现 。因此，尽管某些MDC阳性点状结构的确代表自噬溶酶体，某些情况下MDC阳性点状结构的数量还与细胞的自噬活性相关，MDC并不是自噬泡的特异标志物。利用MDC染色作为细胞自噬活性的指标应该结合其他实验证据。 2. Autophagy的特异标志物 2.1. GFP-LC3定位 LC3是哺乳动物细胞中酵母ATG8(Aut7/Apg8) 基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标记物。通过构建LC3与绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物的融合蛋白，借助于荧光显微镜，我们可以很方便的观察到LC3在细胞中的定位。与 21自噬体相比，自噬溶酶体表面的LC3要少得多，因此，其荧光信号也要少得多或消失。如果自噬体的直径大于1μm,在荧光显微镜下可见其环状结构;相比之下，Hela细胞自噬体的直径要小一些，荧光显微镜下表现为点状。自噬体的形状取决于细胞类型。有证据表明，GFP-LC3的超表达并不影响细胞内源性autophagy活性 (Mizushima et al, 2004)。通过建立GFP-LC3转基因小鼠，其体内autophagy的活性可通过制作冰冻切片并在荧光显微镜下观察直接检测。实验结果表明，在营养缺乏情况下，几乎所有组织都可观察到细胞的自噬，某些 91组织也可自发发生自噬现象 。由于大多数GFP-LC3代表的是细胞中游离囊泡和自噬泡，而不是自噬溶酶体，因此严格来讲，GFP-LC3点状结构的出现并不一定代表细胞的自噬性降解活性。在某些情况下，我们需要同时监测溶酶体的数量和定位。GFP-LC3点状结构的数量还与不同组织细胞中自噬体的半衰期有关。最近，有报道以MDC、LC3、CD63等为指 92标结合荧光显微镜方法在活细胞中动态研究了自噬过程。 2.2. LC3-I到LC3-II的转化 如上文所述，细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC3-I，后者经泛素样加工修饰过程，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，称为LC3-II。LC3-II含量的多少在某种程度上反映了细胞的自噬活性。在免疫印记试验中，LC3-II较LC3-I更加敏感一 93些 。因此，在营养丰富情况下，有时LC3-II的信号比LC3-I还要强一些。通过免疫印记方法对哺乳动物细胞的autophagy活性进行定量检测非常方便。 2.3. Beclin 1 的表达 哺乳动物Beclin 1 是酵母Apg6/Vps30基因的同源物，双杂交筛选试验证明Beclin 1 94是Bcl-2的一个相互作用蛋白。人乳腺癌细胞MCF-7的Beclin 1 表达减少或消失，超表 17 达Beclin 1可加强血清和氨基酸撤除诱导的Autophagy，说明Beclin 1是Autophagy重要的 51正调节因子。Zhenyu Yue等人应用Beclin 1基因敲除小鼠的胚胎干细胞研究指出: Beclin -/-+/-1 小鼠死于胚胎早期，Beclin 1 小鼠虽然表型正常，但其自发性肿瘤发生的频率却很高，说明Beclin 1 是一个重要的肿瘤抑制基因，其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一。 -/-近一步的研究指出，Beclin 1 小鼠Autophagy缺陷，细胞凋亡(Apoptosis)正常，说明Beclin 951 是Autophagy的调控基因。因此，通过免疫印记检测Beclin 1 的表达水平，结合其他生化指标，可对细胞的Autophagy活性进行动态监测和判断。 3. 特异抑制剂 3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻 96断Autophagy中自噬泡与溶酶体的融合，被广泛用作Autophagy的抑制剂 。另外，渥曼 97青霉素(Wortmannin)、LY294002 和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)也可用作Autophagy的抑制剂。 展望 目前分子生物学家和细胞生物学家对自噬及自噬性程序性细胞死亡的认识还处于初级阶段，关于自噬现象的参与分子、信号转导过程、病理生理学意义的研究有待进一步深入。随着一个个谜团的解开，自噬的发生发展过程可受到精细调控，利用自噬机制发展的临床治疗方法可更好的为人类服务。 参考文献 18 1. Mary C, Abraham and Shai Shaham. (2004) Death without caspases, caspases without death. TRENDs Cell Biol 14(4):184-193. 2. Quinn L, Deveraux and John C Reed. 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