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小鼠子宫内膜BrdU、Musashi-1和P63的表达及其意义

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小鼠子宫内膜BrdU、Musashi-1和P63的表达及其意义小鼠子宫内膜BrdU、Musashi-1和P63的表达及其意义 暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63 的表达及其意义 中文摘要 目的 通过标记滞留细胞技术检测昆明小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布情况; 观察 Musashi-1和 P63在不同周龄小鼠子宫内膜的表达,初步探讨 Musashi-1和 P63 在小鼠子宫内膜的生长、发育过程中的作用,为子宫内膜干细胞标记物的筛选提供 依据;通过免疫组化双重标记方...
小鼠子宫内膜BrdU、Musashi-1和P63的表达及其意义
小鼠子宫内膜BrdU、Musashi-1和P63的达及其意义 暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63 的表达及其意义 中文摘要 目的 通过标记滞留细胞技术检测昆明小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布情况; 观察 Musashi-1和 P63在不同周龄小鼠子宫内膜的表达,初步探讨 Musashi-1和 P63 在小鼠子宫内膜的生长、发育过程中的作用,为子宫内膜干细胞标记物的筛选提供 依据;通过免疫组化双重标记方法分别检测 Musashi-1和 P63与 BrdU的共表达情况, 探求 Musashi-1和 P63作为子宫内膜干细胞特异性标记物的可能性。 方法 取出生 3天雌性乳鼠皮下注射 BrdU。分别在 1w、2w、3w、4w、6w、8w和 10w 处死小鼠取其子宫。采用免疫组化 SP 法分别检测 BrdU 、Musashi-1 和 P63 在 各周龄小鼠子宫内膜的表达情况;同时采用免疫组织化学双重标记(SP-SAP法)进 行 P63/ BrdU和 Musashi-1/BrdU 双重染色,观察 Musashi-1和 P63的表达与标记滞 留细胞重叠的情况。显微镜下观察各指标阳性细胞的分布情况并在高倍镜下分别计 算各指标的上皮和基质中的阳性细胞百分率。 结果 1. BrdU在小鼠子宫内膜的表达:注射 BrdU后 1w,子宫内膜上皮和基质中绝 大部分细胞被 BrdU 标记。第 3w 时 BrdU 阳性细胞主要分布在基质,表面上皮及腺 上皮中也有较多 BrdU 阳性细胞。第 6w 时,BrdU 阳性细胞已大幅度减少,阳性细 胞仍以基质居多,表面上皮中仅见零星 BrdU 阳性细胞。至第 8w,上皮中几乎未见 BrdU阳性细胞,仅在基质中存在极少量的 BrdU阳性细胞。第 10w的子宫内膜上皮 及基质中均未发现 BrdU阳性细胞。统计学分析表明,上皮和基质的 BrdU的阳性细 胞百分率具有显著性差异(P0.05)。 2. P63在小鼠子宫内膜的表达:出生后 1w,P63 阳性细胞广泛分布于小鼠子宫内膜 的表面上皮和基质。随着小鼠周龄的增加,腺体逐渐形成、发育,P63 开始在腺体 细胞上表达。3w时在腺体及其周围可见较多阳性细胞,表面上皮阳性细胞较少。之 后,阳性细胞数量随小鼠子宫内膜的发育不断下降。 第 4w时阳性细胞明显减少, 主要表达于基质,腺体周围较多,上皮表达较少。第 6w 时阳性细胞进一步减少, 但集中分布在腺上皮周围的趋势明显。第 8w 时可见少量阳性细胞分布于基质,大 I暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 多位于腺体周围,上皮中未见阳性细胞。至第 10w时仅在基质中看到零星 P63 阳性 细胞,上皮中未见。 3.Musashi-1在小鼠子宫内膜的表达:出生后 1w的子宫内膜组织可见 Musashi-1阳 性细胞在上皮和基质中广泛分布。随着小鼠周龄的增加,Musashi-1在子宫内膜的表 达逐渐减少。在第 4w 时,子宫内膜基质中仍有较多的 Musashi-1阳性细胞,主要集 中分布于基质靠近肌层处,上皮也有少量阳性细胞表达。第 6w时 Musashi-1 阳性细 胞的分布以基质中为多,常呈片带状集中分布。腺上皮中亦有少量阳性细胞 分布, 且主要表达于腺上皮基底部。第 8w时 Musashi-1 表达进一步减少,基质中可见散在 的阳性细胞,以基质与肌层交接处居多,腺上皮中也可见少量阳性细胞。第 10w时, 阳性细胞表达降低,仅在基质发现少量阳性细胞,且表达以基质与肌层交接处居多。 4. 免疫组织化学双重染色结果:第 8w 的小鼠子宫内膜中,检测到零星存在的 P63/ BrdU双阳性细胞,分布于基质,以内膜与肌层连接处居多;表面上皮及腺体中均未 发现 P63/ BrdU双阳性细胞。Musashi-1/ BrdU双阳性细胞呈零星分布,主要分布于 基质血管周围;上皮未见 Musashi-1/ BrdU双阳性细胞。 结论1.小鼠子宫内膜标记滞留细胞(LRCs)主要位于基质血管周围及内膜与肌层交界处, 这些细胞的分布与推测的子宫内膜干细胞的分布部位相符,这些细胞(或其中一 部分)为子宫内膜干细胞。 2.早期小鼠子宫内膜组织中 P63、Musashi-1阳性细胞数量较多,随着子宫内膜的逐 渐发育成熟,P63、Musashi-1 的表达逐渐减少,提示二者参与子宫内膜的增 殖及 分化过程。 3. P63/BrdU和 Musashi-1/BrdU免疫组化双重标记显示 P63及 Musashi-1 表达与 BrdU 有部分重叠,进一步提示 P63 和 Musashi-1 作为干细胞的标记物的可能 性。 关键词 子宫内膜;干细胞;BrdU;P63;Musashi-1;免疫组织化学;标记滞留细 胞 II暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达 及其意义 Abstract Objective: The endometrium, lining of the uterus, is a highly active organ that is periodically remodeled during the lifespan. Many literatures have demonstrated that the presence of an adult stem cell ASC population in this tissue because of its cyclic regenerative capacity. In this study, we aim at 1 identifying and localizing the putative ASC population in the murine uterus using the 5-bromo-2-deoxyuridine BrdU labeling method to detect label-retaining cells LRCs that carry on cell cycle slowly, 2 analyzing their relation to endometrial growth and differentiation with immunohistochemistry via some well-known un-differentiation markers such as P63 and Musashi-1’s expression in mice endometrium, 3 then ascertaining whether P63 or Musashi-1 could be used as specificendometrial stem cell marker using double immunohistochemistry of P63/ BrdU and Musashi-1/BrdU Methods: 3-day-old Kunming white mice had been subcutaneously injected with BrdU twice daily for 3 consecutive days. Mice were then allowed to grow without further labeling. Thereafter, five mice were sacrificed to harvest their uteri at week 1, 2, 3, 4, 6,8 and 10. Immunohistobiochemistry was then used to analyze BrdU and stem cell marker P63 and ’ Musashi-1 expression in the mice endometrium. And then select some P63 or Musashi-1 positive samples for double-immunohistochemical staining of P63/BrdU or Musashi-1/ BrdU. Enumeration of BrdU, musashi-1 and P63-labeled cells was performed in a high power microscope. Eventually, the results were statistically analyzed by SPSS statistical softwareResult: 1. BrdU?labeling cells in the mouse uterine endometrium : at postnatal 1st week, the majority of epithelial and stromal cells were stained for BrdU when glandular development commences. Nuclear staining was apparent in III暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表 达及其意义 the stroma and luminal epithelium. The percentage of BrdU-positive cells began to decrease gradually thereafter. At postnatal 3rd week, there were still many BrdU-positive cells in stroma, mainly located near stroma glands, meanwhile, there was also a small amount of BrdU-positive cells in luminal epithelium and glandular epithelium. After the 6th week, only scattered BrdU-positive cells were observed in the surface of epithelium. After the 8th week, almost no BrdU-positive cells were found in endometrial epithelium, but a few of stromal cells showed BrdU-positive in this phase, and most of them located at the interface of stromal and myometrial junction .Statistical analysis showed that BrdU-positive cell number in epithelium was significantly different(P0.05)from in stroma2.The expression of P63 in the mouse uterine endometrium: P63 was widely expressed in endometrial surface epithelium and stroma at the postnatal 1st week. With the growth and development of the endometrial glands, P63 positive cells were discovered in the glandular epithelium. At postnatal 3rd week, some P63 positive cells were seen in the basal parts of endometrial stroma, and a small amount of P63-positive cells also occurred in the epithelium. At postnatal 8th week, P63-positive cells were mainly found adjacent to the stromal glands.At postnatal 10th week, only a few P63-positive cells were found a in the basal parts of the stroma3.The expression of Musashi-1 in the mouse uterine endometrium: At postnatal 1st week, a lot of Musashi-1-Positive cells were observed in endometrial epithelium and stroma. Thereafter, the number of Musashi-1-Positive cells decreased gradually. During postnatal 6-week phase, the Musashi-1-Positive cells mainly located in the stroma, while a few of positive cells also occurred in the glandular epitheliumAfter 10th week, the expression of Musashi-1-positive cells was only occasional, and these Musashi-1-Positive cells mainly located adjacent to endometrial-myometrial junction , nevertheless epithelial Musashi-1-positive cells were not detectedIV暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63 的表达及其意义 4.The result of immunohistochemical double staining: very few P63/BrdU double positive cells were detected in mice endometrium after 8 weeks phase, which mainly located at the endometrial-myometrial junction and underneath the luminal epithelium; Musashi-1/BrdU double positive cells were discoved in subepithelial basement. At the 8th week, occasional Musashi-1/ BrdU double positive cells were found around perivascular stroma and adjacent to the endometrial-myometrial junctionConclusion: 1. Using the LRC technique we demonstrated the presence of adult endometrial stem cells in mouse uteri. These cells appear likely to be located mainly at the stroma around the blood vessel and in the interface of endometrial -myometrial junction 2. Along with the growth and maturity of the endometrium, P63 and Musashi-1-positive cells decreased gradually in mouse endometrium, suggesting that P63 and Musashi-1 participate in the normal endometrial proliferation, and P63 and Musashi-1 are inevitable in the growth and maturation of mouse uterine endometrium, as well as their cyclical regeneration and differentiation3. By means of double staining of P63/BrdU and Musashi-1/BrdU we affirmed that P63 and Musashi-1 might play a essential role in the development of endometrium, and the both could be used as assistant endometrial stem cell markersKey words: endometrium;label-retaining cells; BrdU;stem cells; Musashi-1;P63;immunohistochemistryV暨南大学硕士学位论文 小鼠子 宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 目 录中文摘 要………………………………………………………………………………? 英文摘 要………………………………………………………………………………? 目 录……………………………………………………………………………………… ? 前 言……………………………………………………………………………………… ………(1) 材料与方 法……………………………………………………………………………………(6) 结 果……………………………………………………………………………………… ……… 12) 讨 论………………………………………………………………………………………………17 结 论……………………………………………………………………………………24 参考文 献 …………………………………………………………………………………25 英文缩略词 表 ………………………………………………………………………31 附 图 …………………………………………………………………………………………32 研究生期间发表论 文………………………………………………………………36 致 谢 ……………………………………………………………………………………………37 VI暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 1前 言 人体的子宫内膜是一个增殖活跃、周期性发生重构的器官,在妇女生育期内, 子宫内膜经历大约400多次的周期性更新。由功能层和基底层组成的人体子宫内膜, 受体内雌激素和孕激素的作用,功能层周期性地坏死脱落, 形成月经;之后,由内 膜基底层细胞进行增殖和分化,从而再生内膜的功能层。生育后及子宫大部切除术 后,子宫内膜出现明显再生。另外,在人体月经周期内,子宫内膜基底层和功能层 的增殖动力学特性存在显著差异。多年以前,Prianishnikov 等学者就提出,人体子 宫内膜功能层的再生是由子宫内膜干细胞介导,而这些干细胞可能就存在于子宫内 [1] 膜基底层 。 干细胞是一群功能上具有自我更新和多向分化能力的细胞。干细胞与体内其它 细胞相比具有以下特性:体内干细胞数量极少且数目相对恒定,分布在体内特定的 部位;能够分化成相同胚层来源的不同组织学类型的细胞;具有可塑性,在特定条 件下, 可被诱导分化为在不同胚层来源的细胞类型;处于未分化或着低分化状态, [2] 缺乏分化标记 。干细胞按发育阶段的不同,可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚 胎干细胞(embryonic stem cells,ESC )是全能干细胞,即具备向各细胞系分化的潜 S 能,理论上可以生成各种组织器官。成体干细胞(adult stem cells ASCs) 存在于成 体组织中,具有自我更新和分化为成熟细胞的能力;数量极少,但寿命较长,目前 认为在整个生命期都有成体干细胞的存在。当器官组织发生损伤或脱落时,成体干 细胞可以进行分裂增殖、分化,以弥补或修复损伤组织。同时,成体干细胞移植也 为许多组织缺损性疾病的治疗带来了曙光。但是,由于干细胞的自我更新能力可以 导致基因突变的积累,目前认为许多肿瘤及增生性疾病如子宫内膜癌、子宫内膜异 [3] 位增生症的发病可能就是由于干细胞基因突变累积引起的 。 今年来,由于干细胞研究技术和手段的发明和创新,人们已在许多成体组织中 证实了干细胞的存在。但目前子宫内膜干细胞的研究相对较少,且进行的研究主要 集中在子宫内膜干细胞生物学特征等方面。Gargett等学者通过体外培养的方法证实 了人体子宫内膜干细胞的存在。他们的实验发现,子宫内膜的上皮和基质中均有极 少量细胞具有克隆形成能力,且分别形成大小两种不同克隆。其中,上皮细胞克隆 形成率为 0.22%,其中0.09%为大克隆;基质细胞克隆形成率为 1.25%,其中0.02% 1暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 为大克隆,由于大克隆形成细胞相对小克隆形成细胞具有更强的增殖活力,提示大 [4,5] 克隆形成细胞为子宫内膜干细胞 。Kato等学者通过荧光激活细胞分选法 (fluorescence -activated cell sorting,FACS)从子宫内膜悬液中分离得到两种侧群细 胞 side- population cells,SPC ,在特定条件下培养,可向上皮和基质两种细胞类 S [6] 型分化,而侧群细胞是目前较为认可的一种成体干细胞活性标记 。Masuda 等学者 通过将人体子宫内膜细胞接种到接受过免疫抑制诱导的小鼠肾包膜下,观察到完整 [7,8] 子宫内膜的形成,说明子宫内膜中个别细胞具备重建内膜组织的能力 。Chan等学 者利用标记滞留技术,初步对小鼠子宫内膜干细胞的定位、分布特征等进行了研究 [9] 。以上研究为子宫内膜干细胞的存在提供了证据,并提示人体子宫内膜膜可能存 在上皮和基质两种干细胞。 近年来,由于干细胞研究技术和手段的发明和创新,人们已在许多成体组织中 证实了干细胞的存在。但目前干细胞的研究手段主要是根据干细胞的功能特征和生 长动力学特性对之进行鉴定、分离;由于干细胞缺乏形态学特征,很难在组织中对 其进行鉴别和分离。标记滞留细胞label-retaining cells,LRCs技术是目前较为认可 的在组织中鉴定干细胞的技术。它利用干细胞的慢细胞周期的特点,用特殊 的标记 物对干细胞进行标记。经过一段时间后,仍有标记物滞留的细胞可能为干细胞。此 外通过特异性的细胞表面标记物对干细胞进行鉴定分离也是当前的研究热点。目前 [10] [11] [12] [13] 研究较多的干细胞细胞标记物有Musashi-1 、P63 、CD133 、Oct-4 及乙醛 [14] 脱氢酶 (aldehyde dehydro genase,ALDH1)等。但这些标记物在多种组织中均有 表达,属通用标记物,因此筛选子宫内膜特异性干细胞标记物具有重要意义。 1.1 标记滞留细胞技术检测子宫内膜干细胞 由于缺乏特异性的干细胞标记物,原位对干细胞进行定性和定位很困难。克隆 形成技术虽然可以在体外证实干细胞的存在,但是也无法对干细胞进行准确定位。 标记滞留细胞技术则可以在动物体内鉴定干细胞的存在,并且能够定位成体干细胞。 LRCs技术的原理是利用BrdU溴脱氧尿嘧啶核苷作为标记物,由于其与胸腺嘧啶核 的结构相似性,在DNA合成期BrdU可以参入到细胞DNA中,从而对新生成的 细胞进 行标记。由于成体干细胞具有慢细胞周期、半保留复制的特性,存在于成体干细胞 中的BrdU相对可以保留更长的时间。通过利用特异性的抗BrdU抗体,通过免疫组织 2暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 化学方法检测到的BrdU滞留细胞可能为成体干细胞。目前LRCs技术已在皮肤干细胞 [15] [16,17] [18] 、神经干细胞 及肠干细胞 等多种组织干细胞研究中得到广泛应用。 Chan 等首次通过LRCs技术,在C57BL/6J 小鼠子宫内膜中显示了可能存在的成 [9] 体干细胞 。他们的实验在第10w时在基质检测到Brdu标记细胞,阳性率为8.8% , 主要分布于血管周围、表面上皮下方和内膜与肌层连接处。他们认为这些LRC可能 就是子宫内膜干细胞。国内有学者使用相同方法在昆明小鼠子宫内膜基质及上皮中 均检测到标记滞留细胞的存在,其中,上皮的标记滞留细胞主要分布在腺上皮凹陷 [19] 的底部,零星分布,基质中标记滞留细胞的分布与Chan 等的实验结果大致相同 。 1.2 P63的功能及意义 近来的研究进展表明,干细胞的自我更新有赖于一种调节分子的存在,此种调 节分子与组织发生有关,且不同组织来源的干细胞的调节分子可能不同。近来,有 关上皮干细胞的调节分子的研究取得了较大进展,其中P63蛋白与上皮组织发生和上 皮来源肿瘤的关系受到广泛关注。 p63是p53家族成员,是一种核转录因子,为乳腺、皮肤、前列腺等组织的上皮 发生及保持所必须,p63缺失可导致这些组织的上皮发育障碍;而未发生p63缺失的 [20] 上述组织的干细胞中P63高表达,提示p63与干细胞数目的维持有关 。也有学者的 [21] 研究证实P63在上皮性干细胞中高表达,与干细胞的定向分化有关 。p63基因定位 于染色体3q27,编码两类产物,分别为TAp63和 ΔNp63,TAp63可转录激活 p53靶基 因, ΔNp63的功能则主要表现为抑制p53及TAp63的转录激活,因此与肿瘤发生有一 [22] 定关系 。 2004年, Zhou等采用细胞流式分选技术分选出胎儿皮肤表皮干细胞, 同 时发现P63 蛋白在所分选出的表皮干细胞中高表达,因而提出P63 蛋白可以作为皮 [23] 肤表皮干细胞标记物 。之后人们又发现:P63选择性表达于多种上皮组织或上皮 组织来源的基底细胞,如唾液腺、前列腺、宫颈、表皮等组织的基底部细胞;并且 发现基底层细胞在演变成成熟细胞时,P63的表达也开始减少甚至缺如,因此P63被 [24] 认为是上皮基底储备细胞的标记物 。Jerome 等学者的实验研究中发现,子宫内膜 的P63阳性细胞主要位于上皮基底或柱状细胞下方,且在组织修复或发生化生时表达 增强。他们的实验还发现:胎儿的子宫内膜及发生病理性增生的子宫内膜P63表达 [25] 均明显增强,故而推测P63与细胞的多向分化和高增殖潜能状态相关 。另 3暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 外,P63阳性细胞多定位于子宫内膜基底部和/或上皮一基质交界处,似乎表这些细 [26] 胞的分化状态与上皮和基质之间的相互作用有关 。 有学者在研究早孕小鼠子宫内膜Np63表达规律时发现,P63在小鼠发情前期的 [27] 子宫内膜的基质细胞中高表达,推测与基质细胞向蜕膜细胞的转化有关 。小鼠发 情前期的子宫内膜在生理特点上与增生期的人体子宫内膜相似,在雌激素作用下人 [28] 体内膜功能层由基底层增生修复,提示P63与子宫内膜基质的增生关系密切 。但 目前有关P63在正常小鼠子宫内膜的表达研究较少,其对正常子宫内膜的增殖、发育、 分化的影响,以及与子宫内膜干细胞的关系都值得探讨。 1.3 Musashi-1的功能与意义 Musashi-1 是Musashi家族的成员,属RNA结合蛋白。其结构保守,N端含有 2 个保守的RRDRNA Recognize Domain结构域。Musashi昀早发现于果蝇,为果蝇感 觉器官前体细胞的不对称分裂所必须,之后又在其它动物中发现了它的存在,如蛔 [29] 虫、小鼠、人体等 。在哺乳动物,Musashi-1能够在多个层面上决定细胞命运,包 括干细胞状态的维持、细胞的分化和肿瘤的发生等。Nakamura等的实验证明, Musashi-l在多能神经祖细胞中高表达,且与细胞的增殖状态有关,提示Musashi-l可 [30] 作为神经干细胞的标记物 。Nishimura 等 研究发现Musashi-1 阳性细胞的存在区 域与肠道中干细胞的分布部位一致,并且认为Musashi-1在结肠隐窝细胞的非对称分 [31] 裂过程中起重要作用 。Akasaka 等利用免疫组化双重标记的方法,发现Musashi-l 在胃窦部的增殖区中特异性高表达,认为Musashi-1可能是胃窦部干细胞的 表面标记 [32] 。目前,越来越多的研究证据支持Musashi-1可作为胃肠道干细胞的特异性标记物。 [33] [34] 另外,研究发现Musashi-1 还表达于人类的乳腺 、肝癌细胞系 等神经系统以外 组织的干细胞存在区域。目前认为Musashi-1生物作用的分子机制是作为一种翻译阻 [35] 抑蛋白,通过Delta/Notch信号通路,抑制干细胞的分化,促进其分裂增殖 。 目前有关Musashi-1 与子宫内膜的关系的研究较少。林芳芳等的研究表明,在胎 儿子宫内膜、子宫内膜增生症及子宫内膜癌组织中Musashi-1 呈现高表达,而在育龄 期子宫内膜Musashi-1的表达主要见于增生期子宫内膜,分泌期的子宫内膜Musashi-1 [36] 表达较少。提示Musashi-1 与子宫内膜的增殖密切相关 。Musashi-1 是否能成为子 宫内膜干细胞特异性标记物值得进一步探讨。 4暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达 及其意义 1.4本研究的意义 子宫内膜干细胞特异性标记物的确立,有利于子宫内膜干细胞的鉴定和分离, 有助于对子宫内膜干细胞的生物学特性、起源等的进一步了解,同时可为子宫内膜 干细胞相关性疾病的治疗奠定理论基础。本课组已在胎儿子宫内膜组织及子宫内 膜癌组织中发现 P63 及 Musashi-1 的表达及其规律,结果提示 P63 及 Musashi-1 与子 宫内膜的正常与异常增殖密切相关,阳性细胞的分布与推测的子宫内膜干细胞存在 部位基本相符,但这些阳性细胞是否就是子宫内膜干细胞值得进一步证实。标记滞 留细胞是目前较为公认的鉴定干细胞技术,但由于 LRCs 是通过示踪剂对细胞进行 标记,不适合对人体的组织进行标记,因此本研究采用小鼠作为研究对象,将 LRCs 技术与 P63 和 Musashi-1 原位标记技术相结合,即 P63/BrdU、Musashi-1/BrdU 双重 标记,探讨 P63 和 Musashi-1作为子宫内膜干细胞标记物的可行性。5暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 2材料与方法 2.1 实验材料 (1)实验动物:8w龄昆明白小鼠(体重 30 ?4.0g,清洁级),购买于中山大学医学 院实验动物中心。室温下饲养,雌雄鼠按 3:1 同笼受孕。待其生产后,选择出生 后 3天的雌性乳鼠作为实验动物,母乳喂养。 (2)BrdU 溶液:称取 BrdU(sigma 公司)10.0mg 粉末,溶于 2ml 的生理盐水中, 配制成 5.0μg/ μl 的溶液,0.2μm的滤膜除菌,避光保存。 (3)标记方法:实验组每只乳鼠每次皮下注射 BrdU 溶液(按 50μg/g 体重),每天 8am, 5pm 各注射一次,连续注射 3天。对照组皮下注射同等剂量生理盐水。于注射 昀后一次 BrdU后 1w、 2w、 3w、 4w、 6w、 8w、 10w取子宫。中性甲醛固定(3-12h)。 常规石蜡切片制作,5μm切片用于 H&E染色及免疫组化染色。 2.2主要仪器设备 组织包埋机 湖北省医用电子仪器厂 组织切片机 Leica,型号 RM2126RT 光学显微镜 OPTEC,奥特光学,型号 BK5000LED 显微摄像系统 Leica MPS 60 型,Leica 仪器有限公司 微量可调加样器 福州迈新生物技术公司 低速自动平衡离心机:(LDZ5-2型,北京医学离心机厂) 电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂) 微波炉IEC-705 型,日本 National公司 隔水式电热恒温培养箱 PYX-DHS-400.400.500 型 恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 保湿盒(福州迈新生物技术公司) 电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司) 枪头、EPPENDORF 管(济南爱博生物公司)6P63/ BrdU Musashi-1/ BrdU P63 Musashi-1 BrdU H&E 暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及 其意义 2.3 实验流程 出生 3天雌鼠 BrdU 标记,标记后 1w、2w、3w、4w、 6w、8w和 10w取子宫 固定 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 免疫组化 免 免 疫 疫 染色 单 双 标 标 观察形态改变 定性观察 及半定量分析 SPSS 13.0 统计软件进行统计分析 7暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达 及其意义 2.4实验方法 2.4.1免疫组织化学染色主要试剂 (1)抗体:抗鼠 BrdU 单克隆抗体,l:100稀释,福州迈新生物技术公司; 鼠抗人 P63 单克隆抗体,即用型,福州迈新生物技术公司; 山羊抗人 Musashi-1多克隆抗体,l:1000稀释,R&D公司。 (2)免疫组织化学染色试剂盒: SP Streptavidin-peroxidase,SP试剂盒 ,福州迈新生物技术公司。 内含:内源性过氧化酶阻断剂?试剂 A、 动物非免疫血清羊 ?试剂 B、 生物素标记的羊抗鼠/兔 IgG 用于检测 P63或生物素标记的兔抗羊 IgG 用于检测 Musashi-1 ?试剂 C、 链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶?试剂 D。 DAB Diaminobenzidine tetrahydrochloride Kit酶底物显色试剂。 SAP Streptavidin--Alkalin ephosphatase试剂盒,。 内含:正常非免疫动物血清?试剂 A、 生物素标记的第二抗体?试剂 B、 链霉素抗生物素蛋白-碱性磷酸酶?试剂 C、 NBT显色系统?试剂 D。 (3)抗原修复液:0.0lM 的柠檬酸盐缓冲液按 l000ml D.W+2.1g 柠檬酸配置 而成, 再用 NaHCO 调节至 pH6.0。 3 (4)PBS 缓冲液:按 Na HPO .12H O( ll.74g+NaH PO4?2H O 1.12g+ 2 4 2 2 2 NaCl 36g+D.W 4000ml 配置而成,用 NaHCO 调节至 pH7.2。 3 (5)10%胎牛血清FBS:胎牛血清购买于福州迈新生物技术公司,用 PBS 按 1:10 稀释。 (6)抗体稀释液:购买于福州迈新生物技术公司。 2.4.2实验方法 标本经 10%中性甲醛固定 12小时,常规石蜡标本制作,5?m厚切片,分别进 行 HE染色和免疫组化染色。 2.4.2.1 H&E染色 8暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 HE染色用于观察子宫内膜的微观形态及其变化规律,步骤如下: 1组织切片脱蜡,梯度酒精水化:二甲苯?? 无水乙醇 95%乙醇 95%乙醇 85%乙醇脱水 70%乙醇脱水 自来水冲洗; 2苏木素浸染 15分钟,自来水冲洗 5分钟; 3盐酸酒精分色 20秒,中和碱返蓝 2分钟,自来水冲洗 5分钟; 4伊红浸染 10分钟,自来水冲洗 5分钟; 5 梯度酒精脱水、二甲苯透明,中性树胶封片。 2.4.2.2免疫组化 SP法 免疫组化 SP法分别用于 BrdU 、P63 和 Musashi-1 免疫组织化学单重标记,步骤如 下: 1 组织切片脱蜡,梯度酒精水化(二甲苯?? 无水乙醇 95%乙醇 95%乙醇 85%乙醇脱水 70%乙醇脱水 自来水冲洗),PBS 冲洗 3次, 每次 5分钟; 2 微波法抗原修复:切片置于柠檬酸盐缓冲液 0.01M, PH6.0中,中高档 25 分 钟,室温下自然冷却 40分钟,PBS冲洗 3次,每次 5分钟; 3 封闭内源性过氧化物酶:滴加内源性过氧化物酶封闭液SP试剂盒试剂 A,室温 下孵育 15分钟;PBS 冲洗 3次,每次 5分钟; 4 滴加正常山羊血清封闭液SP 试剂盒试剂 B,室温下孵育 20 分钟,甩去多余液 体倾去,不洗;Musashi-1:滴加 10%FBS,室温下孵育 20 分钟,倾去多余血清 不洗; 5滴加一抗(分别为抗鼠 BrdU 单克隆抗体,鼠抗人 P63 单克隆抗体,山羊抗人 Musashi-1多克隆抗体),4?冰箱孵育过夜; 6室温下复温 40分钟,PBS冲洗 3次,每次 5分钟; 7滴加二抗P63 和 BrdU选用生物素标记的羊抗鼠/兔 IgG, Musashi-1 选用生物素标 记的兔抗羊 IgG,室温下孵育 20分钟,PBS冲洗 3次,每次 5分钟; 8滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶SP试剂盒试剂 D,室温下孵育 15分钟, PBS 冲洗 3次,每次 5分钟; 9 DAB或 AEC显色,显微镜下观察颜色变化3-10 分钟,DW终止反应; 10苏木素复染 30秒,自来水洗 10分钟; 9暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 11梯度酒精脱水、二甲苯透明,中性树胶封片。 每次操作均设立 1 例阳性对照和阴性对照片。BrdU 的阳性对照选择同体肝组织; P63 的阳性对照选择成人前列腺组织,Musashi-1 的阳性对照选择胃癌组 织。阴性 对照以 PBS代替一抗,其余步骤与实验片相同。 2.4.2.3免疫组织化学双重染色 P63/ BrdU,Musashi-1/ BrdU 双重免疫组化染色采用 SP-SAP 法,步骤如下: l 组织切片常规脱蜡,梯度酒精水化; 2微波法抗原修复:切片置于柠檬酸盐缓冲液 0.01M, PH6.0中,中高档 25分钟, 室温下自然冷却 40分钟,PBS 洗 3次,每次 5分钟; 3滴加胎牛血清封闭,室温下孵育 20分钟,倾去胎牛血清,不洗; 4滴加抗 P63 或抗 Musashi-1,4?冰箱孵育过夜,二抗相应选用生物素标记的羊抗 鼠/兔 IgG或生物素标记的兔抗羊,然后滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶溶液, DAB显色 3~10 分钟,DW终止反应; 5PBS 冲洗 3次,每次 5分钟; 6滴加 BrdU 单克隆抗体,室温下孵育 2小时,PBS冲洗 3次,每次 5分钟; 7滴加二抗生物素标记的羊抗鼠/兔 IgG,室温下孵育 25分钟,PBS冲洗 3次,每 次 5分钟; 8滴加链霉素抗生物素蛋白-碱性磷酸酶SAP 试剂盒试剂 D,室温下孵育 20分钟, PBS冲洗 3 次,每次 5分钟; 9 NBT显色剂室温下显色 20分钟,自来水冲洗 5分钟终止反应; 10水性封片剂封片。 以 PBS分别代替 P63 单克隆抗体及 Musashi-1 多克隆抗体作阴性对照,其余步骤同 实验片。 2.5免疫组织化学结果判定 2.5.1定性分析: (1)免疫组织化学单标: BrdU:以染色背景清晰,细胞核内呈棕黄色或棕褐色颗粒为为 BrdU 阳性细胞。 P63:以染色背景清晰,细胞核内呈棕黄色或棕褐色颗粒为 P63 阳性细胞。 Musashi-1:以染色背景清晰,细胞核或/和细胞浆内呈棕黄色为 Musashi-1 阳 性细胞。 10暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 (2)免疫组化双重染色:染色背景清晰,P63/BrdU以在同一个细胞上细胞核呈棕 黄色和蓝黑色交汇,为双阳性细胞;Musashi-1/ BrdU以在同一个细胞上细胞核呈棕 黄色和蓝黑色交汇为双阳性细胞。 2.5.2半定量分析 在高倍镜下40X对有阳性表达的切片进行观察和计数,每张片随机取 6个视野, 计算阳性细胞百分率,即阳性细胞占全部细胞的百分率。 2.6统计学分析 采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析。两组均数间比较采用单因素方差分 析,以P0.05 为差别有统计学意义。 11暨南大学硕士学位论文 小鼠子宫内膜 BrdU、Musashi-1 和 P63的表达及其意义 3 结 果 3.1 BrdU 标记后小鼠的一般情况及小鼠子宫内膜的发育 BrdU 标记后,小鼠食欲、生长发育良好,较对照组无明显差别:BrdU 标记后 3w的小鼠体重为 8.7?0.5gn5,对照组为 9.0?0.4 g(n5)。出生时,子宫内膜为由 单层柱状的表面上皮围成,无腺体结构形成,基质层较薄;标记后 3天的乳鼠,可 见到表面上皮向基质部凹陷,形成昀初的单管状腺体样结构(图 1);在标记 4w 后, 子宫内膜腺体及基质发育完全(图 2)。之后,随着周龄的增加,子宫内膜逐渐增厚, 腺体增多,腺体结构更加复杂,肌层也不断加厚。由于小鼠没有月经,在其 4 天为 一个周期的发情期,未观察到子宫内膜有明显的结构变化。 3.2 BrdU 在小鼠子宫内膜的表达情况 BrdU阳性染色主要定位于细胞核,DAB显色时呈棕黄色或棕褐色颗粒状。以小 鼠同体肝组织作为阳性对照(图3),PBS替代一抗的阴性对照(图4)。标记后1w的 小鼠,子宫内膜上皮向基质凹陷以形成原始腺体,此时子宫内膜绝大部分的上皮和 基质细胞都被BrdU标记,且阳性细胞染色较深(图5) 。随着小鼠周龄的增加,子宫 内膜BrdU阳性细胞百分率逐渐降低(见表1,图1-1)。但阳性细胞的衰减并非均匀递 减,在第2w时在上皮和基质中仍有较多BrdU阳性细胞,其中上皮和基质部都广泛分 布(图6) 。第3-4w时上皮的阳
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