瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响

瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响 瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响 2oo6年6月第34卷第3期临床翠医杂志(ClinJMedOfl~c) 瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响 周红宇,阳学风(南华大学附属第二医院消化内科,湖南衡阳421001) ? 论着? 摘要:目的观察瘦素对人L-02脂肪变肝细胞三酰甘油(TG)沉积的影响,探讨瘦素在非乙醇性脂肪性肝病发生,发展中的作用.方法 人肝L-02细胞培养接种于50ml培养瓶中,用50%胎牛血清1640培养基造模,时间24h.设立正常组,模型组,瘦素处理1,2,3组,处理 组瘦索浓度分别为10,moI/L,IO—mol/L,IOmol/L,分别处理6h;再以10mol/L浓度瘦索建立时效关系分别处理(6,l2及24h). 每组均行油红…O染色观察脂肪化情况,高效液相色谱测细胞内TG含量变化.结果油红…0染色显示50%的胎牛血清的1640培养基 24h能成功地制造肝细胞脂肪变性模型,加入瘦素处理后脂肪化程度减轻.高效液相色谱显示细胞内TG明显减少,且与瘦素呈剂量,时 间依赖性关系.结论肝细胞脂肪变性时,瘦素能使肝细胞脂肪化程度减轻,能减少肝细胞Tc的沉积,对脂肪肝防治有一定的作用. 关键词:脂肪变肝细胞;瘦素:三酰甘油-' 中圈分类号:R977R589.2文献标识码:A文章缩号:1671-3826(2006)03-0265-04t EffectsofLeptinonDispositionofTriglyceridein-FartyLiver:Cells ZhouHong—yu,YangXue-feng(DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,NanhuaU niversitY,Hengyang, 42l0ol,China) Abstract:ObjectiveToexploretheeffectofleptinontriglyceride~dispositioninnormalandn onalcoho~cinducedfattylivercel1. MethmisL-02livercellswereculturedin50ndculturedish.Fattylivercellmodelsweremadewith50%inactivatedembryo bloodserul~for24hours.ResultsOilredstainingshowedthat50%inactivatedembryobloodserumcanmakefattylivercellmod- e1.AfterL-02liver,cellswereturnedintofatrylivercells.1eptinWa$addedtofatrylivercells.TheHPLCshowedthatthemodel group~triglyceridedispositionincreasedclearly,butafterleptinWasgivenintothemode/cells,triglyceride~dispositiondecreased obviously.whichWaspositivecorrelatedwithleptin? Concentration.ConclusionWhenliverL-02cellswereturnedintofattylivel cell.leptincaninhibittriglyceride,sdisposition.Leptinhassometherapeuticeffectonfattylivercells. Keywords:fattylivercell:leptin;triglyceride 非乙醇性脂肪肝(NAFLD)是一种肝组织学改变与乙 醇性肝病相类似,但与饮酒无明确关系的临床病理综合 征,根据其病理学改变及临床现分为单纯性脂肪肝,脂 肪性肝炎,脂肪性肝纤维化,脂肪性肝硬化.. 肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所,肝脏选择性地 摄取血中的非饱和脂肪酸,经酯化合成三酰甘油(TG),TG 在肝细胞内,一方面氧化供能,另一方面分泌入血转化为 低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)被其他组织 利用.肝脏所含脂质绝大部分为TG,各种致病因素可导致 肝细胞内TG异常堆积而导致脂肪肝(FLD)的发生. 瘦素是肥胖基因(obesegene)编码的蛋白产物,其受体 广泛分布于脂肪,骨骼肌,肝脏,心,肺,胰,卵巢,睾丸等外 周组织.瘦素通过与受体结合而发挥作用.瘦素的主 要作用是调节机体脂肪的稳定,抑制食欲,增加能耗和减 少体质量.本研究以人肝L-02脂肪变细胞模型,通过油红 "O"染色,高效液相色谱等方法对瘦素作用后的脂肪变细 胞进行研究,了解瘦素与NAFLD的关系,并初步探讨了瘦 素对其的治疗作用. 1材料和方法 1.1主要试剂和仪器1640培养基(GIBCO),胎牛血清 (成都哈里生物有限公司),胰蛋白酶(Sigma),l,2,4丁三 醇(Buches瑞士),油红"O"(北京生物化学有限公司),正 己烷,异丙醇,乙腈(国产分析物).二氧化碳恒温培养箱 (日本SANYO公司),超净工作台(德国Heraeus公司),倒 置相差显微镜(OLYMPUS),5Oml培养瓶,24孔细胞培养 板(NUNC公司),酶标分析仪(美国Bio—Bad550). 收稿日期:2006-04-05;修回日期:2006-05-10 作者简介:周红宇(1976-),女,湖南益阳人,医师,在读医学硕士,发表论文8篇. 临床军医杂志第34卷 1.2''实验方法 1.2.1非乙醇性脂肪变肝细胞模型的建立人肝L-02细 胞株培养接种于5OInl培养瓶中,在含体积分数10%的灭 活胎牛血清,100U/ml青霉索和100mg/L链霉素的1640 完全培养基中,于37~C,5%二氧化碳培养,饱和湿度,贴壁 生长,待细胞长满80%瓶底,消化液消化传代.在更换新 鲜培养液后加入胎牛血清,使其浓度为50%,继续培养24 h,即形成非乙醇性肝细胞脂肪变性模型.设正常组,模型 组,瘦素处理1,2,3组,瘦素处理组的瘦素浓度分别为 10,mol/L,10,mol/L,1075mol/L,分别处理6-h;再以lO mol/L浓度瘦素建立6,12,24h的时效关系分别处理.'每 组均行油红"O"染色观察脂肪化情况,高效液相色谱测细 胞内TG含量变化. 1.2.2油红…O染色观察造模是否成功采用Lillie氏油 红…O染色法t将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养 板,用PBS冲洗盖玻片3次,每次l5inin,5O%异丙醇固定1 min,油红…O染色液染色10min,蒸馏水冲洗3次,每次1 min,苏木素染色5rain,分色和返蓝后,HPIgS-1000型图像 分析系统收集图像.按Wada方法进行脂质染色的半定量 分析即根据脂滴的面积进行细胞分类.细胞脂滴的面积小 于细胞核的面积记为"一",细胞脂滴的面积等于或大于细 胞核的面积记为"+",每一块玻片计数100个细胞. 1.2..3色谱分析和计算安捷伦HP1100单元泵,自动进 样器,紫外监测器和化学工作站进行分析.检测波长230 nm,流速0.7ml/min,采用梯度洗脱A:乙腈B:水0—12 min:75%A一95%A:121min一18min:75%A.将标准溶 液浓度对甘油/内标峰面积比值线性回归后得回归方程用 于样品甘油浓度的计算.TG的浓度为总甘油浓度-游离甘 油浓度. 1.3统计学方法统计分析甩SPSS软件,实验数据甩均 数?标准差(王?s)表示,两组数据资料比较用t检验及方 差分析,P<0.05为有显着性差异. 2结果 2.1人肝L-02细胞脂肪化正常细胞用50%胎牛血清 培养基培养24h后.用油红"O"染色,显微镜下观察,细胞 浆内有大量脂滴存在,符合脂肪化肝细胞特点.同时用高 效液相色谱分析细胞内TG明显增加,与正常肝细胞比较 有显着性差异(P(0.05),其中细胞内TG从20:19g 增加到77.51g/g,说明细胞内有大量TG聚集,造模成 功. 2.2瘦素对人肝I.,-02脂肪变细胞TG的影响人肝L-02 细胞用50%的胎牛血清培养24h后,分别加入瘦素lO mol/L,10"6mol/L,t07~mol/L培养.6h.油红"O':染色,显 微镜下观察,细胞内脂滴依次减少.瘦素10.mol/L时效 关系显示油红"O"染色细胞数明显依次减少.高效液相色 谱分析细胞内总甘油与TG模型组比较有显着性差异(P< 0.05).与瘦素呈时间,剂量依赖性关系(见表1,2). 3讨论 近年来,随着人们生活水平的提高,饮食结构的变化, 检测手段的提高,非乙醇脂肪肝(NAFLD)发病率呈逐年上 升趋势.NAFLD根据其病理学改变及临床表现分为单纯 性脂肪肝,非乙醇性脂肪性肝炎,脂肪性肝纤维化,脂肪性 肝硬化.NAFLD曾被普遍认为发病率较低,仅发生在伴有 非胰岛素依赖性糖尿病的肥胖女性并且愈后良好.但是自 1994年起一系列研究结果表明NAFLD的发病在性别问没 裹l瘦素对人肝L-02细胞细胞内TG影响的量效关系 ?与模型组相比,P<0.05;?与前组相比,P<O.o5 裹2囊素对人肝L-02细胞细胞内TG影畸的时效关系 ?与模型组相比,P<0.05.?与前组相比.P<O.05 有明显差异,在非肥胖和糖尿病人中也有较高的发病率, 特别是发现NAFLD可进展至肝炎,肝纤维化和肝硬化之 后,才逐渐为人们所重视.肥胖,高脂血症,2型糖尿病与 NAFLD的发病密切相关.大约75%的2型糖尿病患者可 第3期瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响周红宇,等?267? 发生不同形式的NAFLD;70%的肥胖患者发生脂肪肝,其 中18%出现NASH【4J.NAFLD的发病机制尚非十分清楚, Day等提出的"二次打击"(twohits)理论目前被广泛认 同.多种遗传和代谢性因素的联合作用诱发胰岛素抵抗 (IR),后者通过增加的脂肪分解和FFAs转运至肝脏导致 第一次打击一脂肪肝形成,并造成肝脏对第二次打击的敏 感性增强.氧应激,脂质过氧化等进一步促进IR,加重氧 应激和肝细胞内细胞器损伤,导致炎症反应,肝细胞变性 和肝纤维化,即第二次打击.本研究结合文献采用高脂 培养基造模,形成典型的非乙醇性脂肪性肝细胞模型,主 要研究NAFLD形成的第一步肝细胞内脂肪沉积及瘦素干 预后的变化. 肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所.肝脏脂质代谢 稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基础,各种致病因素 可通过一个或多个环节导致肝细胞内TG异常堆积.TG 在肝细胞的沉积决定于其合成,代谢及转运三个环节.食 物内的脂肪和胆固醇经小肠吸收后,以乳糜微粒与载脂蛋 白结合的脂蛋白形式存在于血中,肝脏选择性摄取血中的 非饱和脂肪酸,经酯化合成TG,肝细胞不能储存脂肪,TG 在肝细胞内,一方面氧化分解供能,另一方面与载脂蛋白 B100,C等以及磷脂,胆固醇结合生成极低密度脂蛋白,由 肝细胞分泌通过血液循环运输至肝外组织.当肝细胞合成 TG增多,转运或氧化障碍时,都可能导致TG在细胞内的 堆积,形成脂肪肝. 本实验经过高脂培养基培养L-02肝细胞,发现肝细胞 普遍发生脂肪变性,细胞肿胀,内含较大的脂肪滴,可将细 胞核挤压向胞膜,可见高脂环境可引起肝脏脂肪浸润(TG 贮存).而经过瘦素处理后肝细胞内脂滴明显减少,细胞 形态恢复正常,高效液相色谱分析细胞内TG明显减少,与 瘦素呈剂量依赖性关系.说明10,moL/L,10,moL/L浓 度的瘦素对离体脂肪变肝细胞有积极的防治作用. 瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌合成的由167个 氨基酸残基组成的蛋白质类激素.瘦素的表达具有组织特 异性,主要在白色脂肪组织中表达,其中皮下脂肪的表达 最高,棕色脂肪组织,肌肉,胃黏膜,胎盘滋养层细胞和羊 膜细胞也可以合成少量瘦素J.瘦素通过靶细胞膜上的 受体及相应的信号转导体系发挥作用.OB.共有6种异 构体.OB.Rb的胞内结构域最长,由302个氨基酸搭配组 成,并包含Janus激酶(JAK)结合结构域以及信号转导转 录激活因子(STAT)结合的共同序列YXXQ,OB-Rb是唯一 能进行信号转导并调节热量摄入和能量消耗的异形体J. OB-Rb主要存在于下丘脑中能表达NPY的细胞表面,与瘦 素结合后,通过JAK以及信号转导和转录激活物(STAT) 蛋白发挥信号转导作用,调控核内DNA上Leptin效应基因 的转录活性.目前JAK-STAT途径被认为是Leptin受体信 号转导的主要途径J.瘦素可与特异性运输蛋白结合,通 过血脑屏障,然后与下丘脑特异受体结合,把体脂信号传 递给下丘脑.下丘脑再通过一系列神经体液因素调节机体 能量代谢,调整体脂,控制体质量相对恒定.给遗传性肥胖 的oh/oh小鼠进行肌内注射瘦素,能够明显抑制食欲,促进 代谢,4周后脂肪下降将近75%,而且没有明显的副作用. 给0b小鼠脑脊液中注入瘦素后【l进食量明显减少,体质 量渐降正常,而且减少的仅为脂肪组织.且其基础代谢率 有所升高,这说明抑制食欲,增加能耗和减少体重可能是 瘦素减肥的主要机制. 瘦素可能具有从外周直接拮抗肝脂肪变性的作用.瘦 素可以激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinki? nase)减少脂肪沉积【l,还可特异性抑制肝脏的硬脂酰基 一 辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoAdesaturase-1),使肝脏 VLDL生成和脂肪沉积减少.瘦素参与肝脏内糖及脂 肪代谢,它通过调控肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP. CK)的基因表达,促进肝脏对乳酸的摄取,减少TG合成, 同时通过蛋白激酶A激活肉碱脂酰转移酶,影响肝脏对 TG的氧化代谢?.Uygun等认为非脂细胞瘦素受体发 生功能障碍时细胞内TG含量能增加100倍,而持续表达 的异位高瘦素血症能使细胞内TG耗竭;瘦素还干预胰岛 素在肝脏中作用,一方面拮抗胰岛素诱导的PEPCK下调, 抑制胰岛素受体底物.1(IRS-1)的磷酸化,影响胰岛素受体 后信号转导;另一方面,瘦素通过对PEPCK及糖异生的影 响,限制TG的合成,提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感 性,Stumvoil等?副发现瘦素与脂联素等连用能促进小鼠肝 脂肪燃烧及能量消耗,可逆转缺乏过氧化物酶体增殖受体 (PPAR)a的脂肪萎缩小鼠的胰岛素抵抗.但是Chitmrl 等【l刮发现NAFLD患者有高瘦素血症,且瘦素水平与肝脏 的脂肪变性程度呈直接正相关.最近Chalasani等r71报 道,瘦素水平与脂肪肝的发生并无直接关系.因此,瘦素对. 肝脂肪变性的影响尚无定论. 本实验经过高脂培养液培养证实细胞内TG明显增 加,经过瘦素处理后肝细胞内TG明显减少,与瘦素呈剂量 及时间依赖性关系.说明瘦素能明显减少离体脂肪变肝细 胞的TG沉积,与文献【l-l报道一致.可见瘦素对非乙醇 性脂肪肝具有治疗作用.其对TG的作用明显,体内外实 验均表明,其可抑制乙酰COA羧化酶的表达而抑制TG的 合成,可激活肉碱脂酰转移酶而促进TG的氧化代谢.本 实验通过高效液相色谱分析也显示瘦素处理后脂肪变肝细 胞内TG量明显减少,瘦素能使肝细胞内TG沉积减少达到 治疗非乙醇性脂肪性肝脏疾病的目的. 参考文献: [1]PotterJJ,WomaekL,MezeyE.eIa1.Transdifferentiationofrat ? 268?临床军医杂志(ClinJMedOmc)2006年6月第34卷第3期 [2] [3] [4] [5】 [6] [7] [8】 [9] [1O】 hepaticstellateceHsresultsinleptinexpression[J].Biochem BiophysResCommun,l998,244:178一l82. 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