神经节苷脂对大鼠体外循环脑损伤保护作用研究（可编辑）

神经节苷脂对大鼠体外循环脑损伤保护作用研究（可编辑） 神经节苷脂对大鼠体外循环脑损伤保护作用研究 神经节苷脂对大鼠体外循环脑损伤 保护作用的研究 张振 页 计学位论文 表 格 个 插 图幅 指导教师张铁铮教授 专业名称麻醉学 申请学位级别硕士学位 论文答辩日期年月 论文提交日期年月 学位授予日期年月 学位授予单位大连医科大学 评阅人 答辩委员会主席独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究彭 作及取得的研究成果据我所知除了文中特别加以标注和致谢的 地 方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包 含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明 确的说明并表示谢意 学位论文作者签名已燃 签字日期 坦年 月一日目 录 一摘要一中文摘要 二英文摘要 二正文一前言 二材料与方法 三结果四讨论五结论六参考文献 三综述 一综述 二参考文献 四附录 五致谢神经节苷脂对大鼠体外循环脑损伤保护作用的研究 硕士生姓名张振 指导教师张铁铮教授 指导小组孙英杰曹慧娟 专业名称麻醉学 摘要 目的通过建立大鼠体外循环模型探讨单唾液酸神经节苷脂对体 外循环脑 损伤的保护作用及其机制 方法成年雄性大鼠只体重随机分成假手术对照组 组体外循环组组体外循环单唾液酸神经节苷脂处理组组每组 只组未建立体外循环模型组预充液中加入生理盐水 于结束即刻 组在预充液力 组和组进行 结束后采集血标本用法检测大鼠血浆肿瘤坏死因子一叻 水平结束后时断头取脑组织标本透射电镜观察大脑皮层超微结 构变化 法标记神经细胞凋亡免疫组化法检测一心蛋白的表达法 检测皮质区蛋白的活性 结果组和龃转流中平均动脉压心率红细胞比积 差异无统计学意义 与组比较在透视电镜下组大脑皮层细胞核膜模糊核仁消失核 内异染色质凝聚边集细胞器有减少或出现空泡化细胞问紧密连 接相对松散 组超微结构的改变较之明显减轻 免疫组化结果显示可使大脑皮层神经细胞凋亡增多与组比较 组组中的神经细胞凋亡均增多且差异有统计学意义尸与 组比较组凋亡的神经细胞均减少且差异有统计学意义尹 与组比较和组时点血浆?水平均升高与 组比较组时点血浆一水平均降低且时点差异有统计 学意义尸 免疫组化和结果表明可使大脑皮层神经细胞的蛋白 表达增高与组比较组和组蛋白表达均增高且差异有统计 学意义与组比较组蛋白表达均降低且差异有统计学 意义结论 体外循环脑损伤与皮质神经细胞凋亡相关 全身炎性反应因子激活可能是导致脑皮质神经细胞凋亡的原因 之一 单唾液酸神经节苷脂可以一定程度上减少体外循环炎性反应因 子的表 达具有减缓神经细胞凋亡的作用因此具有脑保护作用 一心 关键词神经节苷脂体外循环脑损伤 护 耵师一 埘 诵 一 析? 谢 一出 析 神经节苷脂对大鼠体外循环脑损伤保护作用的研究 硕士生姓名张振 指导教师张铁铮教授 指导小组孙英杰 曹慧娟 专业名称麻醉学 刖 舌 年医生首次把成功应用于临床心内直视手术在随后的 半个多世纪里装置不断改进麻醉技术和手术技巧逐步提高以及 器官保护 措施的日益完善这些进步大大地减少了对人体造成的影响和伤害但脑损 伤的问题仍未彻底解决据报道术后短期内轻微认知异常记忆力减退发生 率为而中风的发生率则高达到延长患者住院时间 增加并发症和死亡率对病人术后顺利康复构成了极大地威胁然而目前对 相关的脑病理生理变化和脑部并发症发生机理仍然缺乏了解因此也缺少相应 的治疗和预防措施 目前的研究表明引起脑损伤的突出特点是机体广泛的防御反应及炎症 反应的发生究其原因可能为期间肝素化血液与非内皮化人工表面以及伤口 组织持续接触机械牵张性破坏控制性低血压过程以及缺血一再灌注损伤触发了 全身性病理生理反应其中相关性炎性因子激活引发了凝血机制激活和机体 强大的促血栓形成作用细胞信号分子蛋白的释放微血栓子血管活性及细胞 毒性物质的产生影响着机体的内环境组织和器官导致心脏脑肺肝肾 胃肠道等多种重大器官的功能障碍相对于其它器官脑组织是人体最敏感的 器官脑部控制全身活动其功能持续稳定地发挥需要一个相对稳定的代谢水平 与环境因此即使是微小的损伤都可能造成严重的影响产生明显的功能丧失 和结构变化局部低灌注水肿微血栓和循环中的细胞因子可以造成认知功能 行为模式生理和躯体功能的敏锐丧失这些变化可能不引起人们注意但可明 显引起患者的神经精神功能障碍昭示着实施与维护的失败因而在心脏 手术与转流相关不良后果中脑损伤是最常见也最具灾难性的对其进行深度 研究就显得刻不容缓同时从何处着手采取何种手段检测也显得尤为重要 甚至直接影响着研究的成败与可信度 核转录因子 是一类常见蛋白的因子能与免疫球蛋 白轻链基因的增强子序列特异性结合具有多向转录调节作用尤其在诱导 细胞因子的基因表达中起关键性地调控作用如?一单核细胞趋 化蛋 白和一氧化氮等的产生增加细胞因子则是一类在机体炎症反应过 程中起重要作用的分泌性低分子蛋白质能调节细胞分化增殖并诱导细胞发 挥功能其中尤为令人注意近年研究显示一的过度激活与脑损 伤后的炎症反应密切相关在细胞因子表达上调中起重要作用而伍可以 反向激活的表达 神经节苷旨是一组异构的含唾液酸的糖鞘脂由疏水的神 经酰胺和亲水的含唾液酸的寡糖链组成因为唾液酸的位置和寡糖核心的长度的 差异可分为单唾液酸神经节苷脂和双唾液酸神经节 苷旨等机体内的主要见于神经系统常见于神经细胞膜脂质 双层结构的外层神经酰胺部分地嵌入细胞膜内而寡糖链一端突出于细胞膜外 这种非对称性分布及其化学特异性不仅改变了膜的物理性质流动性电荷性 同时也令其成为神经元细胞膜表面的受体与膜中其他成分如腺苷酸环化酶十一 酶一道组成信息传导系统担负着接收和传递细胞外分子信息调节细 胞活动的生物功划研究表明可促进神经组织分化成熟对神经元损伤 具有保护作用外源性的可以通过血脑屏障与神经生长因子协同作用促进 神经再生对损伤后继发性神经病变有保护作用近年来的脑保护作 用越来越受到学者们的重视 本研究通过建立大鼠模型在中给予单唾液酸神经节苷脂干预 通过检测大鼠血浆肿瘤坏死因子?水平检测大脑皮层蛋白的表达 情况观察皮层超微结构变化和神经细胞凋亡情况探讨其对大鼠炎性反应 脑损伤程度的影响进而讨论其体外循环脑保护作用及其机理为临床导致 的脑损伤防治提理论依据有助于策略方法的改进和完善 材料和方法 一材料 一主要药品及试剂 江苏亚邦强生药业 盐酸多巴胺注射液 天津药业集团新郑公司 硫酸阿托品注射液 呋塞米注射液 河南润弘制药 肝素钠注射液 天津生物化学药业 生理盐水 沈阳志鹰制药厂 水合氯醛 沈阳军区总医院 甘露醇 上海百特公司 碳酸氢钠 山东鲁抗辰欣药业 羟乙基淀粉 杭州民生药业 中性甲醛固定液 沈阳军区总医院 戊二醛 沈阳军区总医院 醋酸铀 英国 缓冲液 沈阳军区总医院 英国 锇酸四氧化锇 乙醇 汕头新宇化工厂 丙酮 汕头市先华化学厂 环氧树脂 上海树脂厂 柠檬酸铅 天津天大化工实验厂 武汉博士德生物技术有限公司 兔抗 凋亡检测试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 单唾液酸神经节苷脂 齐鲁制药公司 免疫组化试剂盒 武汉博士德生物技术有限公司 二主要的仪器及设备 手术刀片 上海医用缝合针厂公司 一次性注射器 山东威高集团 一次性压力传感器 新加坡公司 蚕丝线 苏州市嘉盛公司 一次性无菌手套 沈阳市盛道公司 一型小动物呼吸机 江西省特力麻醉呼吸设备公司 大鼠专用膜式氧合器 广东科威医疗器械有限公司 德国 低温离心机 日本光电公司 多功能监测仪 输血输液加温仪 康奈尔上海医疗器械公司输液泵 公司 一次性静脉套管 美国公司 瑞士 血气分析仪 型恒流蠕动泵 保定兰格恒流泵有限公司 日本电子 电镜 超薄切片机 瑞士公司 共聚焦显微镜 日本 组织切片 德国公司 恒温水浴锅 北京六一仪器厂 显微图像分析系统 美国显微镜照相装置 日本 德国公司 微量移液器 蛋白电泳仪 美国 大鼠脑切片模具 日本成茂株式会社 灭菌高压锅 山东新华医疗器械公司 电子天平 德国公司 低温高速离心机 美国公司 沈阳军区总医院 匀浆器 上海佳安仪器厂 微量进样器 二实验动物与分组 一实验动物 健康成年雄性清洁级大鼠只体重由沈阳 军区总医院实验动物中心提供整个动物实验由沈阳军区总医院动物实验伦理委 员会批准并严格按照沈阳军区总医院动物实验指南执行按随机数字表法随机 分为组每组只 二分组 假手术组组仅在各部位插管不转流机械通气 体外循环组组等量生理盐水 药物干预组组 三体外循环建立 一麻醉手术操作及监测 实验前禁食水的大鼠只腹腔内注射水合氯醛麻醉 经口气管插管套管针后固定行机械通气潮气量约呼吸频率 次呼吸比气道峰压约吸入氧气浓度大鼠四肢连 接心电图导联接多功能监测仪行心电监测直肠温探头插入肛门行直肠体 温监测手术部位备皮消毒在无菌操作下左股静脉直视下留置套管 针连接微量输液泵羟乙基淀粉维持静脉通路右股动脉穿刺置 套管针经压力换能器连接监测仪实时监测动脉压并按时抽取动脉血行血气 分析颈部正中偏右纵行切口显露右颈动脉留置套管针固定灌注 备用 右颈动脉穿刺成功后经静脉给予肝素钠行全身肝素化使达到 秒经右颈静脉置头端多孔的 穿刺针右心房引流备用 二环路连接 主要由静脉引流管储血器注射器滚压式血泵膜式氧合器及颈动 脉灌注管组成环路采用右颈静脉引流和右颈动脉灌注储血器由注 射器制成低于大鼠心脏水平借助重力引流血液安装于泵前由内径 的硅胶管垂直与腔房引流管连接膜式氧合器安装在蠕动泵后通过管道与颈动 脉灌注端连接 预冲 采用无血预冲预充液总量为 由羟乙基淀粉 碳酸 氢钠 及甘露醇 组成组在预充液中加入 组加入等量生理盐水 四转流 妥善固定各部分连接管道后打开腔静脉引流端使静脉血回流到储血槽打 开滚压式血泵开始转流可见储血槽暗红色血液经膜式氧合器后 变为鲜红色的 动脉血后泵入右劲动脉转流开始时流量约为逐渐增加到 保持平均动脉压转流平稳后停止机械通气 氧合器供氧为氧流量与灌注流量比值保持为通过输血输液加 温仪对管路进行加温维持大鼠肛温?并采用稳态法血气管理 五停机 转流 后恢复机械通气逐步降低灌注流量后停机依次拔除各 管道管道中剩余血液常温下以转离心 以浓缩预充所致的 血液稀释将浓缩所得红细胞缓慢回输待自主呼吸恢复平稳后停止机械通气 拔除气管导管维持呼吸循环稳定小时 六监测及管理 过程中持续监测心率平均动脉压和肛温分别在麻醉后前 后 停即刻停后 停后 个时间点进行动脉血气分析测定动脉血氧分压动脉二氧化碳分压 碱剩余值红细胞比积和电解质等酸碱平衡管理采用稳态 维持值在之间 在由血 气分析造成的失血需要加入相当体积的羟乙基淀粉补充转流过程中根据静脉 引流情况调整流量满足灌注要求在转流过程中根据足底反射实 验监测麻醉深 度必要时追加水合氯醛 四标本留取及检测方法 一电镜检查方法 在组穿刺后 组组后在水合氯醛溶液 腹腔注射麻醉下经颈静脉快速灌注生理盐水当颈动脉流出液为 无色时再灌注多聚甲醛磷酸盐缓冲液约用以固定实验动物灌 注后取左侧大脑皮层组织切成小块若干置入戊二醛锇 酸四氧化锇固定乙醇梯度脱水环氧树脂包埋型超薄切片 机切片行醋酸铀一柠檬酸铅双染色一型透射电镜下观察观察皮层细 胞超微结构变化并拍照 二法测凋亡 组穿刺后 组和组后在水合氯醛溶液 腹腔注射麻醉下经颈静脉快速灌注生理盐水当颈动脉流出液为无 色时再灌注多聚甲醛磷酸盐缓冲液约用以固定实验动物左侧 大脑皮层组织置入多聚甲醛溶液固定制作切片然后采用检测细胞凋 亡 具体步骤如下 固定好的皮层组织切片厚度常规脱蜡脱水 加入蛋白酶溶液室温分钟 蒸馏水洗次每次 加入含一溶液室温 液洗次每次 切片上加滴酶缓冲液?分钟 切片上在滴加 酶反应液湿盒内反应性对照 染色加不含酶的反应液 加终止反应缓冲液 ?保温 液洗次每次 加滴抗地高辛抗体?湿盒内反应 液洗次每次 滴加新鲜配制的溶液室温显色 蒸馏水洗次 甲基绿复染分钟 蒸馏水及正丁醇各洗次每次 二甲苯脱水次每次 干燥封片镜检 三免疫组化法 组穿刺后 组和组后在水合氯醛溶液 腹腔注射麻醉下经颈静脉快速灌注生理盐水当颈动脉流出液为 无色时再灌注多聚甲醛磷酸盐缓冲液约用以固定实验动物左 侧大脑皮层组织置入多聚甲醛溶液固定制作切片然后采用免疫 组化法检测细胞内的表达 具体步骤如下 石蜡切片常规脱蜡脱水 柠檬酸盐缓冲液煮沸抗原修复 切片恢复室温后液洗次每次 甲醇液浸泡消除内源性过氧化物作用 液洗次每次 的山羊血清封闭液?温育后弃去液体不洗 加 加稀释后的一抗抗 单克隆抗体?过夜 液洗次每次 加生物素化二抗?温育 液洗次每次 加标记链亲和素?温育切片 液洗次每次 显色光镜下观察适时终止反应 自来水冲洗苏木素衬染 脱水透明封片镜检 四免疫印迹法 在组术后组组后断头处死实验动物取左 侧大脑皮层组织放冻存管内置液氮罐内备用然后采用保方法测定 蛋白的表达 具体步骤如下 蛋白质样品的提取 配制但白裂解缓冲液样本每加裂解液加瑚用研 磨器反复混匀持续冰上裂解分钟后在的速度下离心分钟 收集上清液分装后保存于?保存 蛋白质浓度测定用倍蛋白裂解液稀释未煮的蛋白样品然后配制 蛋白品取一新孔板每空加入配制好的工作液斗立即加入蛋白标准品 盖好盖子后迅速放入?恒温箱内孵育分钟在紫外分光光度计于 测定吸光度值并根据标准曲线计算出实际蛋白含量 电泳 洗板将玻璃板用清洗剂洗净晾干 配制和灌注分离胶配制的分离胶将分离胶注入玻璃板夹层中 立即在浓缩胶中插入干净的梳子切勿产生气泡将凝胶垂直放置在室温下 蛋白定量和上样根据待分析的蛋白质样品的定量结果加入适量浓缩 的蛋白上样缓冲液用微量加样器吸取雎在梳井内加样加样完毕后接通电源电压设定为电泳直至溴酚蓝指示剂到达 分离胶底下沿时停止 转膜 配制转膜缓冲液然后将电泳后的胶取出浸入转移缓冲液中水平摇床 缓慢摇分钟根据凝胶情况裁取相同大小的滤纸和聚偏二氟 打蛋白印迹膜 按顺序组装转膜夹子整个过程在转膜缓冲液中进行切勿留气泡盖 上顶层电极板后接通正负极电源下转印分钟 杂交 转膜完毕后取出膜洗一次和胶相邻面向上加入 封闭液下在摇床上缓慢摇小时至过夜 吸尽封闭液立即加入按稀释的一抗兔抗单克隆抗体 室温下在摇床上杂交小时取出膜用洗分钟×次 将膜加入稀释的荧光二抗羊抗鼠稀释度为避光室 温下摇床上杂交小时取出膜用洗分钟×次 洗片 根据膜大小裁好底片显影水中漂洗定影将晾干的片子贴于膜上放 在自动电泳凝胶成像分析仪上分析 条带灰度值 五血标本采集及检测 于结束即刻结束后取上腔静脉血立即离 心分离出血浆?保存待测 按试剂盒说明书检测?操作步骤如下 加入稀释好后的标准品于反应孔加入待测样品于反应孔内 立即加入的生物素标记的抗体盖上膜板轻轻振荡混匀温育小时 甩去孔内液体每孔加满洗涤液振荡秒甩去洗涤液用吸水纸拍 干重复此操作次 每孔加入的亲和链酶素一轻轻振荡混匀温育分钟 甩去孔内液体每孔加满洗涤液振荡秒甩去洗涤液用吸水纸拍 于重复此操作次 每孔加入底物各山轻轻振荡混匀温育分钟避免光照 取出酶标板迅速加入终止液加入终止液后应立即测定结果 在波长处测定各孔的值 以吸光度值为纵坐标相应的娅标准品浓度为横坐标做 得相应的曲线样品的?含量可根据其值由标准曲线换算出相应 的浓度 五统计分析 应用 统计软件进行分析计量以均值士标准差土表示组问比 较采用单因素方差分析为差异有统计学意义以软 件绘制统计图表 结果 一 三组大鼠的一般情况见表 表 各组大鼠的一般情况 注为穿刺后转流前为后 为停即刻为停后 为停 后 组为穿刺后小时 组和组转流中平均动脉压心率差异无统计 学意义 二大脑皮质神经元超微结构改变 组在低倍镜下观察皮层正常神经元细胞全貌细胞呈圆形细胞膜光 滑完整与周围细胞及组织距离较近细胞核较大可见双层核膜平行走行细 胞质内膜系统丰富核大而圆核仁显著染色质电子分布密度均一以常染色 质为主 高倍镜下可见双层核膜平行走行核孔分布均匀内可见电子致密物细胞 内内膜系统丰富大量粗面内质网线粒体高尔基体等细胞器分布于细胞核周 边线粒体呈椭圆形或圆柱状为双层膜结构双层膜间距均匀膜嵴清晰可见 内可见均匀电子分布图 组低倍镜下可见大鼠的大脑皮层神经元肿胀呈气球样变细胞膜尚 可见明显晕界与周围组织有明显界限但未见清晰的高密度双层膜结构部分 膜结构已破坏出现孔洞核膜模糊核仁消失代以放射状分布的电子致密物分 散于核区 高倍镜下核膜存在但完整性欠佳核膜双层结构欠佳区分困难较多孔 洞分布孔洞未见电子致密物核纤层增宽核仁解体核常染色质裂解异染 色质成块边集轮辐状分布内膜系统均呈扩张表现数量明显减少破坏严 重核糖体内质网数量减少粗面内质网和高尔基体极度扩张胞浆中出现大量 空泡区线粒体极度水肿内嵴融合消失双层膜间隙增宽外膜断裂有空 泡出现或固缩成为电子致密影部分线粒体己破裂可见较多碎片较多溶酶体 出现内含大量吞饮物图 组低倍镜下可见神经元水肿明显缓解细胞膜规则完整均有较明 显 细胞核核膜相对完整但核内异染色质增加常染色质相对减少偶见细胞凋 亡细胞内膜系统较丰富电子密度均匀 高倍镜下可见神经元轻微肿胀膜结构明显细胞内膜系统轻度肿胀但 基本结构存在核糖体线粒体内质网数量明显增加细胞核结构存在核仁 清晰集中分布于核区以常染色质为主但核内异染色质增多核膜双层结构 明显核孔分布规则核孔内可见电子致密物线粒体肿胀明显缓解较少见空泡 样变细胞质少量空泡出现见少量溶酶体内含吞饮物图一 注一表示核仁表示线粒体?表示高尔基体今表示核膜?表示核糖体 图 电镜下大鼠皮质神经元的超微结构 三法检测大脑皮质神经细胞凋亡 每组选张切片每张切片不重复随机取大脑皮层组织个视野倍下 显微图像分析系统得到 用 显微镜摄像 平均积分光密度表 组皮层神经元凋亡明显增加组皮质神经元凋亡明显减少 但高于组尸表图 ? 蔓 ??冀杉 菩一?簿 一亭鼻 蘸??? 图 法检测大鼠皮质神经元细胞凋亡 二 一?家 ? ?麓 ?藏薯 哆?影 蕊 ?毋 ?尝堕醺 图免疫组化检测阳性细胞 表凋亡细胞及阳性细胞平均积分光密度士 与组比较拌与组比较趔日腑山卜矧雄 图各组阳性细胞值比较 与组比较撑与组比较 四免疫组化检测阳性细胞 免疫组化分析采用显微图像分析值后大脑皮质神经细胞免疫 组化染色显示组仅极少量阳性细胞表达俨组及 组与组比较阳性细胞数明显增加俨与组比较组阳性 细胞数明显减少俨酊见表图 趔 熏 ? 芋 矧 谁图各组阳性细胞值比较 与组比较拌与组比较 五 分析检测 曝光所得图片灰度值大脑皮质 应用 分析 一蛋白表达的平均灰度值显示组仅有极少量蛋白表达 组及组与组比较皮质蛋白表达明显增加 与组比较组皮质蛋白表达明显减少尸见图 蠢 絮 镳 昼 嵩蠛驰 黔一 图各组皮质蛋白表达水平比较 零 菌 止 图各组蛋白表达水平比较 与组比较撑与组比较 六血浆水平的变化 与组比较组和组时点血浆水平均升高 与组比较组时点血浆水平均降低有统计 学意义见表图 组别 与组比较拌与组比较 四 圆 村黎毋卜罂茁寸卜 图各组时相伍表达水平比较 与组比较撑与组比较 讨论 体外循环脑保护是临床工作中备受关注的热点问题和难点问题目前认为 多种因素与体外循环脑损伤相关但具体机制不清为明确脑损伤大脑皮层 神经元的损伤性质本研究以透射电镜观察大脑皮质神经元及亚细胞结构的变化 的形式之一是 细胞凋二是程序性细胞死亡 主动性的细胞自杀行为程序性细胞死亡侧重于从发育生物学或者功能分化 上强调细胞的适时退出而细胞凋亡则偏重于从形态学角度描述一种从生化代 谢到细胞结局都不相同的一种细胞自杀式行为其最具特征的就是凋亡发生时染 色质的凝集嗜碱性染色增强细胞核崩解等变化本研究结果表明使大 鼠大脑皮层神经元肿胀核膜模糊核仁解体核常染色质裂解异染色质成块 边集呈轮辐状分布上述形态学观察提示可能存在细胞凋亡为了对这一 现象进行更深入的研究本实验应用法对实验大鼠脑皮质神经元进行观察 检测染色后发现组皮层神经元凋亡明显增力同时对 阳性细胞进行值测定发现组阳性细胞值明显增加 呈现典型的凋亡形态学特征综上透射电镜观察及法发现大脑皮质神经 元的凋亡是脑损伤的一个重要原因 脑损伤主要由包括体外循环时的低灌注状态脑缺血和或缺氧栓塞 缺血再灌注损伤全身炎性反应等因素所引发有研究表明体外循环后可引发 组织自身炎性反应使炎性细胞向损伤区聚集浸润进一步加重损伤导致神 经元死亡本研究发现与假手术组相比较组血中浓度明显上升 大脑皮质神经元一表达明显增加作为一种普遍存在于中枢神经系统 各个组织中的转录因子是多种信号传导通路的汇聚点在调节脑缺血再灌注炎 症反应的基因表达转录过程中起着关键作用在脑损伤中可使炎性 介质如单核细胞趋化蛋白和一氧化氮等的产生增 加而使抗炎介质如的产生减少有学者认为炎性介质如俚能反 向激活从而使炎症发生连锁反应呈瀑布效应放大从而加重对组织的 损伤有研究表明当家族成员与细胞膜上的相应受体结合激活受体 可导致受体胞内的死亡区域三聚化从而启动细胞内的信号转导通 路诱导细胞凋亡与细胞凋亡的关系尚未明确有的文献认为其能上调 许多有害细胞因子能促进细胞凋亡实验认为脑缺血发生后 通过死亡受体途径和线粒体依赖通路诱导了凋亡的发生本研究结果表明 可诱导炎性反应和促进神经细胞凋亡同时还促使炎性因子浓度的显 著上升和大脑皮质神经元表达明显上调由此推测可诱导炎性反应 全身炎性反应因子激活可能是导致大脑皮质神经细胞凋亡的原因之一 神经节苷脂是含唾液酸的糖神经鞘脂存在于哺乳动物细胞膜上在中枢神 经系统组织内含量极为丰富尤其是突触连接处 神经节苷脂是神经细胞膜的 组成部分对损伤后的神经恢复起非常重要的作用目前用于促进 神经细胞生长 和抗损伤作用的神经节苷脂主要是外源性的能促进神经再生能对抗 损伤后的继发性神经病型阻断细胞凋亡过程还能抑制大鼠神经元超 氧化物歧化酶的活性降低丙二醛含量减少细胞内钙内流减少自由基对神经 元的损割因此本研究在预充液中应用探讨其对所致脑 损伤作用及产生作用的机制透射电镜结果表明与组相比可明显缓 解神经元水肿核膜相对完整偶见细胞凋亡与假手术组比较核内异染色质 增加常染色质相对减少结果提示可降低阳性表达的 值即可减缓皮质神经元凋亡信号的表达可见使大鼠大脑皮质神经元的 超微结构发生改变甚至产生凋亡而可改善大鼠大脑皮质神经元超微结构的 病理改变减缓神经细胞凋亡因此可以认为单唾液酸神经节苷脂在一定程度 上具有减缓所致神经细胞凋亡的作用本研究还发现使大鼠血中炎性 因子一浓度的显著上升和大脑皮层神经元表达明显上调而可降 低血中上升的水平和脑组织表达上调的程度可见可减轻 所诱发的全身炎性反应而炎性反应与凋亡密切相关因此认为通 过减少体外循环炎性反应因子的表达进一步减缓神经细胞凋亡的作用产生脑 保护作用但是应该注意到凋亡是个程序化调控的过程具体的大脑皮层 神经元凋亡是何种途径启动发生的单唾液酸神经节苷脂又是如何抑制这一过程 发生的本实验尚不能据此完全解释 综上所述本研究通过建立大鼠模型结果显示使血中炎性介质 的水平升高大脑皮质神经元表达上调使皮质神经细胞超微结构 发生病理学改变甚至产生凋亡表明可诱发炎性反应进而促进神经细胞 的凋亡从而加重对组织的损伤在预充液中应用单唾液酸神经节苷脂可 以减轻诱导的炎性反应改善皮质神经细胞超微结构的病理学改变减少 大鼠皮质神经细胞凋亡本研究提示单唾液酸神经节苷脂可通过抑制表 达对抗对大脑神经细胞的损害为体外循环脑损伤的治疗提供了新的途径 结论 体外循环脑损伤与皮质神经细胞凋亡相关 全身炎性反应因子激活可能是导致脑皮质神经细胞凋亡的原因之一 单唾液酸神经节苷脂可以一定程度上减少体外循环炎性反应因子的表达 具有减缓神经细胞凋亡的作用因而具有脑保护作用 参考文献 宋兵任旭东张巧燕等不同灌注方法对深低温停循环下脑保护的 实验研究中国 体外循环杂志 胡志兵陆雪芬郑德枢等神经节苷脂对新生大鼠缺氧缺血性脑损 伤保护作用的实 验研究临床神经病学杂志 李斌董啸徐建军龙翔晏浩车建鹏杨威无血预充大鼠深低温停循环模型的建立 中华实验外科杂志年卷第期 王伟温健景桂霞乌司他丁对兔心急缺血再灌注损伤的影响陕西医学杂志 位 出与体外循环的脑损伤关系的研究 张振综述张铁铮审校 体外循环是指应用人工管道将人体大血管与心 肺机连接从而将血液从静脉或右心房引出经由泵氧合后再注入动脉系统循环供 氧简而言之就是在体外维持呼吸和循环功能并且提供一个相对无血的环境 为完成心脏手术操作或其他的治疗手段提供有利条件年医生首 次 把成功应用于临床心内直视手术在随后的半个多世纪里装置不断改 进麻醉技术和手术技巧逐步提高以及器官保护措施的日益完善这些进步大大 地减少了对人体造成的影响和伤害但对人体重要器官的影响仍未完全消失 在其实旌过程中所产生的人体病理生理及代谢变化仍就不容忽视据报道 术后短期内轻微认知异常记忆力减退发生率为而中风的发生率则升 高到延长患者住院时间增加并发症和死亡率增加患方负担耗费 医疗卫生资源尤其目前对相关的脑病理生理变化和脑部并发症发生机理仍 然缺乏了解对脑并发症仍然缺乏有效的治疗和预防措施各个医疗中心一直在 尝试不同的方法研究和治疗脑并发症 核因子心叫曲是年和从细胞中发现的一种能和免疫 球蛋白轻链基因增强子佃序歹特异结合的转录调节因子具 有多向转录调节作用尤其在诱导细胞因子的基因表达中起关键性地调控作用 如一单核细胞趋化蛋白和一氧化氮等的产生增加细 胞因子则是一类在机体炎症反应过程中起重要作用的分泌性低分子蛋白质能调 节细胞分化增殖并诱导细胞发挥功能现已明确一出广泛存在于多种细胞 中如脑血管内皮细胞神经元和神经胶质细胞等它参与调控多种基因的表达 其亚基含有大量特异结合区近年研究显示的过度激活与脑损伤后 近年来发现一心 的炎症反应密切相关在细胞因子表达上调中起重要作用 对于体外循环脑损伤有重要影响 一 体外循环脑损伤的原因和影响因素 体外循环致脑损伤的机制尚不十分清楚目前认为主要与体外循环的低灌注 状态脑缺血和或缺氧栓塞体外循环引起的全身炎性反应缺血再灌注损 伤等因素有关但是体外循环所引起的全身炎性反应是导致脑损伤的被认为是最 主要因素主要通过以下机制诱导?缺血一再灌注损伤导致活性氧和炎性分子 进入循环?白细胞补体血小板凝血系统的激活以及其它可能继发于血 液与体外循环管道接触的炎症因子的释放?术中及术后由于内脏血流灌注相对 不足导致肠壁缺血毛细血管通透性增加致使肠内菌群异位进入血液循环 二及相关分子 一曲瓜蛋白家族 是一种多向性转录因子其末端含有一个高度保守的约个氨基酸 残基的同源区属于家族哺乳动物家族有个成员 和姐其中编码同源内 含有结合区二聚体化区及核定位信号 分别具有与的序列结合与同源或异源亚基形成二聚体以及与家族成员 相互作用等功能并且和 末端有反式转录激活域它可触发靶 基因的转录和基因编码大量多肽酶前体和和 的末端分别水解为和这些亚基含有大量特异结合区但是 源二聚体末端缺少反式转录激活域因此没有内在能力进行转录 和基形成和一同源二聚体及异源二聚体其 异二聚体数量最多并发挥主要生理功能通常所说的活化的且此亚型 已 为的抑制蛋白在胞质中与以结合并以非活性异寡聚体的 形式存在哺乳动物主要包括以下七种心 一 和这些抑制蛋白由个氨基酸组成的同源序列称为锚蛋白重复序列 可与的核定位序列结合从而阻止向核内转运不能发挥转录 作用 蛋白的主要功能包括?阻止转移入核?阻止与 结合?可解离复合物家族中最重要的是和心有 个而出则有个锚蛋白重复序列通常它们与结合共同组成三聚体存在于 细胞质内 的激活 大量的实验证明许多因素可以引起信号转导途径的激活目前公认 的主要包括两个途经经典途径及旁路途径的激活主要与激酶 导致脱磷酸化有关是激活的主要限速步骤 活性稍有下降可使降解大幅度减少活性显著降低细胞在静息状态下 细胞质中的与结合成三聚体使不能核易位在经典途径中 当细胞受到如细胞因子有丝分裂原病毒蛋白内毒素过氧化物蛋白激酶 钙离子载体蛋白合成抑制剂及射线等细胞外信号刺激时的单位 被磷酸化激活继而引起的矛位点被磷酸化磷酸化的再被泛 素化后在蛋白水解酶复合体作用下降解而被释放狗进行核易位 与基因上的位点发生特异性结合从而发挥调节细胞功能的作用实验证实在 出的激活过程中发挥了重要作用并在小鼠生长发育中神经系统具有重要影响 与经典途径不同旁路途径主要是指含有或忙聚体的的激活 在特定细胞类型中细胞外信号刺激细胞后在诱导激酶的作用下引 起磷酸化活化从而进一步活化导致发生磷酸化依赖性剪切生 成有活性的复合物并进入细胞核与靶基因结合调节基因的表达州除 此之外近年的研究发现紫外线激活的机制与以上途径不同紫外线通过 激活酪蛋白激酶弓起的端磷酸化从而引起泛素化后降解 的激活不依赖而是通过丝裂原活化蛋白激酶因匕一一也是激活 的途径之一川 三与体外循环 手术可引起补体系统的激活活性氧肌酸激酶伍及 脂多糖的大量释放这些因素均可以活化进一步促进炎症介质的基 因转录加重组织器官的损伤已有很多研究者注意至可能在术后并发 症的发病机制中扮演着重要角色并进行了动物实验及临床研究 以探索预防 术后组织器官损伤新的治疗方法 四在体外循环脑损伤中的作用机制 促进炎症的发生发展 时由于血液接触体外循环管道异物内表面缺血再灌注损伤肠道吸 收的内毒素注射的肝素和鱼精蛋白手术创伤及低温使血液系统激活导致大脑 及外周的促炎症因子被激活表达并分泌至细胞外此炎症过程主要包括?无 细胞成分指各种炎性细胞因子化学趋化因子和类花生酸类物质?细胞成分 指的是外周炎性细胞浸润至损伤的脑组织内其中中性粒细胞是脑缺血损伤后最 早进入脑组织的炎性细胞可以被上调表达的细胞因子有一一 旺和一等而这些因子反过来又可以激活一翘从而使活化在组 织间不断扩散加重了炎症反应此外可促进血管细胞问黏附分子 内皮白细胞黏附分子一一细胞问黏附分子一和内皮细 粒细 胞选择素等黏附分子的表达介导外周炎性细胞进入脑组织 胞从循环中进入脑实质首先要附着聚集于血管壁阻塞微血管造成微循环障碍 此外被激活的粒细胞可以释放蛋白水解酶活性氧和自由基从而破坏血一脑 屏障粒细胞游出到达缺血损伤区以后释放溶酶体酶阳离子蛋白白细胞三 烯前列腺素氧源性代谢产物等诱发炎症反应从而加重组织损伤由此可 看出黏附是中性粒细胞浸润的关键环节是炎症反应的触发点也是干预炎症 反应的着力点一即分化群抗原是广泛分布于血管内皮细胞的黏附 分子其配体分化群抗原 分化群抗原分布于各种炎性细胞 其中以中性粒细胞最多等发现通过促进内皮细胞表达 从而在白细胞浸润中发挥始动作用由上可以推断参与炎症的整个过程 促进了炎症的发生发展从而加重了脑损伤最近掣也从致炎性基因 的表达细胞凋亡巨噬细胞的活化三方面阐述了与炎症的关系 的促凋亡作用 等应用大鼠永久性大脑中动脉局灶性脑缺模型运用免 疫组化方法检测的免疫活性发现缺血后就可见到的表达在 达高峰从开始逐渐衰减在此过程中免疫活性细胞遍及纹状体和 大脑 皮质缺血区而且普遍存在于胞核和胞浆说明脑缺血后被激活活 化的由细胞浆向细胞核移位等利用基因敲除大鼠进行研 究发现与野生型大鼠相比基因敲除大鼠在局灶性脑缺血损伤后其梗死体 积脑组织水含量及神经功能缺损均明显减轻说明脑缺血过程中被激活 并引起细胞死亡众所周知细胞凋亡的经典途径有两个?为死亡受体途径 是指肿瘤坏死因子受体 死亡受体 死亡受体 等死亡受体与其相应的 配体结合将信号传递到细胞内最终激活一?是线粒体依赖通路凋 亡刺激信号使细胞色素从线粒体膜间隙释放至胞浆通过 一系列反应最后激活发现神经细胞在经受低氧复氧应激 后被激活并促使弦从线粒体释放导致细胞死亡实验证实 小胶质细胞在经受低氧复氧应激后被激活并促使小胶质细胞表达的 配体即因此推测脑缺血发生后通过死亡受体途径和线粒体依赖 通路诱导了凋亡的发生 介导自由基损伤 体外循环脑损伤发生后可产生大量活性氧和自由基包括超氧阴 离子羟自 由基等在体内产生连锁反应加重组织损伤激活后可促进自由基产生产 生的自由基又可以激活一从而形成正反馈机制使自由基损伤不断加剧 等将过度表达铜锌超氧化物岐化酶的转基因小鼠和野生鼠大脑中 动脉阻塞后再灌注免疫组化显示过度表达减轻了缺血诱导的 免疫反应及结合活性一下游基因的免疫反应在缺血 皮质增加说明过度表达阻止有害基因表达减轻缺血损伤 与钙超载 脑缺血再灌注后钙超载主要发生在再灌注期主要因为钙内流增加钙超载 后干扰线粒体的氧化磷酸化使生成减少且使细胞膜和线粒体膜损伤加 速黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶从而促使自由基损伤研究发现细胞内 与的活化密切相关利用内质网抑制剂能减少大鼠皮质神经元中 出结合活性并可阻断和谷氨酸盐引起的活化叭国内学 者利用非特异性钙离子同道阻滞剂氟桂利嗪可明显减轻激活说明对 转录过程有显著影响引等报道他们找到了独特的钙调蛋白依赖 的调控的证据睇 五的信号通路的阻断策略 由于在许多疾病发病机制中扮演关键角色通过动物模型和人类疾病 的大量研究证明通过抑制的过度激活可以减轻脑组织的炎症反应减少 神经细胞凋亡达到脑保护和神经再生的作用?目前抑制出活性的主要方法 有?抗氧化剂抗氧化剂的研究最多氧自由基在介导许多活化剂激活 过程中起重要作用使用抗氧化剂乙酰半胱氨酸维生素衍生物以及抗坏血酸 等抑吝的产生或活化对抑制炎症有一定作用?抗炎剂目前研究发现阿 司匹林水杨酸钠可能是出激酶复合的竞争性抑制剂能特异抑与 结合依赖的磷酸化明显减弱活化的皮质激素受体能直接与活化 的的亚单位结合抑制出与结会?免疫抑制剂他克莫司环 孢菌素和雷帕霉索等免疫抑制剂可与细胞受体衔接抑制不同刺激因素诱导细 胞产生?蛋白酶和蛋白酶体抑制剂肽酶类硼酸肽类钙蛋白酶抑制蛋 白可阻止的降解和的激活及其核移位?拮抗活性环戊烯前列醇 素抑制的活性阻止磷酸化达到抑锘活性的目的?抑制 合成反义寡核苷酸通过碱基配对选择性与构成成员的基因或 结合最终抑制成员的转录或过程?圈套寡核苷酸即合成与结合元 件中一致的圈套双连寡聚脱氧核糖核替酸与竞争性结合干扰与靶基 因位点结合 六展望 综上所述作为一种新兴的转录因子由于在脑损伤炎症反应中的枢 纽作用被过度激活后常导致细胞因子的高表达导致机体损害因此深入研 究的信号转导通路探索具有靶细胞特异性和对不同成员具有选择性 的细胞内活化阻断剂可能为临床治疗开辟新的途径调节和控制活 性是缓解脑组织损伤的一种有力的治疗策略但需要注意的是在维持机体 的防御功能和细胞生死平衡方面起着极其重要的作用过度或长期抑制 的活性可致细胞凋亡机体免疫功能下降感染机会增加等因而的活性 必须受到严格的调控因此如何将一的水平控制在达到其在中枢神经系统缺 血性损害中的双重作用的平衡点以及该因子及其相关分子在机体健康和疾病状 态下的功能有待于进一步深入研究一国有望成为脑保护的药理学靶点为体 外循环脑损伤的临床治疗提供新思路 参考文献 雒 仃 刘达及其活性的研究天津医科大学报 王拥军何芳李小玲白藜芦醇对实验性脑缺血的保护作用中华医 学杂志 一 以 田华万琪刘舅级等核因子砌在原代神经细胞缺血再灌注的表达 第四军医大 学学报 认 一 附录 缩略语表 致谢 首先向我的导师张铁铮教授致以最崇高的敬意感谢他对我多年来的悉心指 导和关心导师严谨的科研作风和孜孜以求的敬业精神永远是我学习的楷模 感谢刘晓江主任刁玉刚副主任周锦副主任孙莹杰副主任医师在研究过 程中给予的指导和建议感谢曹慧娟博士于冬梅博士宋丹丹博士曹晓燕护 士长姚婧主管护士在工作学习和生活中给予的无私帮助和关怀 感谢我的同学姚国泉硕士王洪乾硕士孙文文硕士以及所有研究生同学在 实验工作和生活上给予的手足般的关心和帮助 感谢父母和亲人在学习期间给予的无私的关心支持鼓励和理解 这些都 是今后我能够不畏艰难克服困难的精神动力 由于本人的水平有限文中尚有很多需要改进的地方敬请各位评委和专家 指教这是对我莫大的帮助和鼓励在此请允许我向您表达我由衷 的谢意