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【doc】粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义

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【doc】粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义【doc】粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义 粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义 第24卷第lO期 2002年lO月 第三车医大学 ~_CTAACADEMIAEMEDICINAEMIL1TARISTERTIAE Vo1.24.No.10 Oct.20021241 丈章编号:1000—5404(20o2)10—1241—04 粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义 陈东风,易萍,郑伟,周继红(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所消化内科,重庆400042) 论着 提要:目的研究4种粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中...
【doc】粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义
【doc】粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的达及意义 粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义 第24卷第lO期 2002年lO月 第三车医大学 ~_CTAACADEMIAEMEDICINAEMIL1TARISTERTIAE Vo1.24.No.10 Oct.20021241 丈章编号:1000—5404(20o2)10—1241—04 粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达及意义 陈东风,易萍,郑伟,周继红(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所消化内科,重庆400042) 论着 提要:目的研究4种粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的表达规律并探讨其意义.方法采用粘蛋白1(Mucinl,MUC1),粘蛋白2 (MUC2),粘蛋白3(Muc3)及粘蛋白5AC(MUC5AC)的单克隆抗体,应用免疫组化和Westernblot检测对照组胆囊24例,胆囊腺瘤样息肉 l9例.结果MUC1,MUC2及MUC5AC免疫组化及Westernblot表达在胆囊腺瘤样息肉组较对照组显着增高(P<0.01),而MUC3在腺 瘤样息肉组较对照组显着降低(P<0.01).结论粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中呈现非同步表达,可能与其属癌前病变有关. 关键词:粘蛋白;胆囊;腺瘤样息肉 中图法分类号:R341;R730.26;R735.802文献标识码:A Expressionandsignificanceofmucinincholecysticadenomatoidpolyps CHENDong-feng,YIPing,ZHENGWei,ZHOUJi—hong(DepartmentofGastroenteroleogy,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversit y,Chongqing 400042,China) Abstract:ObjectiveTostudytheregularrulesofmueinsexpressionincholecystieadenomatoidpolypsandinvestigateitsrelations~pwith precancerouslesions.MethOdSMucinl(MUC1),Mucin2(MUC2),Mucin3(MUC3)andMucin5AC(MUC5AC)weredetectedinthemueosaof 24humannolmalgallbladders,andl9gallbladderswithadenousmatoidpolypswithirmnunohistochemiealandWesternblottingmethods.Resu~s Thepositiveratesbyimmunohistochemistryandopticaldensityvalues(0DU)fromWestemblottingofMUC1.MUC2andMUC5ACwereincFease(I significantly(P<0.O1),but,MUC3wasdecreasedmarkedly(P<0.O1)inthepolypsgroupVScontro1.GoocJusion11heexpressionsofmucin arenotconsistentwithadenomatoidpolypsofgallbladder.Mucinmaybeassociatedwithprecancerouslesionsinthecholecyst. Keywords:mucin;cholecyst;adenomatoidpolyps 粘蛋白(Mucin,MUC)是一类以高度糖基化和含有 连续重复肽链序列为特征的高分子量糖蛋白,在体内 分布广泛,粘蛋白与某些肿瘤的发生,发展及预后有一 定关系.多数学者认为胆囊息肉,尤其是腺瘤样息肉 属胆囊癌的癌前病变,粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的 变化既往研究较少.本研究旨在研究4种粘蛋白 MUC1,MUC2,MUC3和MUC5AC在胆囊腺瘤性息肉中 的变化及意义,探讨粘蛋白与胆囊癌前病变的关系. 1资料和方法 1.1研究对象 所有患者均系我院及新桥医院1999年3月至2001年3月 因胆囊结石或胆囊息肉而行胆囊切除术者,手术时无急性炎症 发作.对照组胆囊标本24例,标本取自其它疾病行胆囊切除 之胆囊,且经组织学检查证实无明显炎症,增生及化生等病理 改变.l9例胆囊息肉标本,息肉直径0.5,1.0cm,均经病理检 查证实为腺瘤样息肉. 1.2主要试剂及仪器 1.2.1MUC1,MUC2,MUC3及MUC5AC单克隆抗体购自深圳晶 美生物公司,抗体工作深度为1:80.ABC染色试剂盒购自深圳 晶美公司. 1.2.2Western二抗(辣根过氧化酶标记的抗鼠IgG)购自北京 中山试剂公司.Westernblot发光试剂盒(NENTM公司美国), 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970039) 作者简介:陈东风(1964一),男,重庆市涪陵区人,博士,副主任医师,副教授, 主要从事肝脏损伤与修复,胆石症及消化介入方面的研究,发表论 文40篇.电话:(023)68757342 收稿日期:20024)7—31;修回日期:2002-09434 PVDF膜(BehringerMannhein公司),核酸蛋白仪(Beckman 美国),转移槽(BIORAD美国),胶片(FUJ1日本),GLDoe2000 图像分析系统(美国). 1.3方法 1.3.1常规HE染色,光镜观察病理变化. 1.3.2免疫组织化学染色操作步骤按文献[1]进行. 1.3.3Westemblot杂交 1.3.3.1粘膜组织匀浆及样品制备取胆囊粘膜或息肉组 织100,200mg置入lOml离心管中,剪碎后加入细胞裂解液1 mJ,充分匀浆,4?12000r/min离心10min,去上清液分装成2O 管,蛋白分析仪测定蛋白浓度,用三蒸水调校蛋白浓度为20 ~g/ml,然后加入等体积缓冲液稀释备用.上样后煮沸5min,短 暂离心,按每孑L6o蛋白准备上样. 1.3.3.2电泳垂直电泳槽中加入分离胶,然后用注射器 注入浓缩胶,插入梳子,室温聚合1h.待胶完全聚合后取下梳 子,用滤纸吸净样品孑L中液体.按每孑L60蛋白上样,每样上 两块平行胶,按对照组,息肉组顺序上样.向电泳槽内加入 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,预电泳电压先以8Ov恒压进行,待溴 酚蓝指示剂入分离胶后将电压改为120V电压,待指示剂到达 底边处停止电泳,取胶. 1.3.3.3电转膜取分离胶置于转移缓冲液中30min,按塑 料孑L板一海绵一滤纸电泳凝胶一PVDF膜一滤纸一海绵依次组装好转 印夹层,置于转移槽中转膜,加入转移缓冲液,80mA恒流电转 移l5,20h. 1.3.3.4杂交取下PVDF膜,PBS洗3×5min.置于1% BSA/PBST中4?封闭过夜,加入1:100稀释的一抗,37oC×1 h,取出PVDF膜1×PBSrr漂洗1×15min,4×5min加标记的相 应二抗(1:1000),37?×1h,PBST漂洗1×15min,4×5min. 1.3.3.5制片取NEN化学发光试剂A,B液各1ml放入 玻璃培养皿中混匀,加入PVDF膜约4oS后蛋白条带均匀发光 l242j.:I久,,十【{第24卷 后取出,放人暗盒使x线胶片爆)匕0.5,3min,取m胶片放显 影液中显影,清水冲洗后放人定影液中20,30nfin,冲洗,凉T, 观察结果. 1.3.3.6WesternBlot杂交分析所得结果扫描人计算机, 采用G1D(x,2000图像分析系统进行图像分析处理 1.3.4统计学分析所得数据采用SPSS统计软件(8.0)进 行Y检验及t检验. 2结果 2.1光镜观察 所有对照组胆囊标本均无明显炎细胞浸润,也未见化生, 增生.胆囊腺瘤样息肉病变皆为单发,0.2,0.5c一,表面光滑, 扁圆无蒂.镜下见粘膜局限性增生,固有膜下可见少许炎细胞 浸润,未见典型恶变征象. 2.24种粘蛋白在胆囊腺瘤样息肉中的免疫组化表 达,见表1 2.2.1MUC1免疫组化表达情况经免疫组化染色观察发 对照组MUC1阳性表达主要由柱状细胞表达,胞浆内呈颗粒 状乃至片状分布,胞核内无表达.腺瘤性息肉标本中MUC1表 达广泛,细胞表面,胞浆内皆有表达,且着色颗粒多,染色呈深 棕色.从表1可看出,胆囊腺瘤样息肉MUC1阳性表达率与对 照组比较差异非常显着(P<0.O1),见图1. 表1MUC1,MUC2,MUC3和MUCSAC在胆囊腺瘤样息肉中的表达 Tab1PositiveratesofMUC1,MUC2,MUC3andMUCSACingallbladder adenomatoidpolypsandcontrol 2.2.2MUC2免疫组化表达情况对照组阳性表达仅占5 例(21%),腺瘤样息肉组阳性表达高达16例(84.2%),差异非 常显着.MUC2粘蛋白呈颗粒状分布于胞浆中,也见于细胞表 面,但表达较弱.腺瘤样息肉组MUC2表达部位与对照组相 同,但表达阳性及表达强度都较对照组高,见图2. 2.2.3MUC3免疫组化表达情况对照组MUC3表达阳性 率高达l8例(75%),与MUC1,MUC2及MUCSAC不同的是,腺 瘤样息肉组MUC3表达明显减少,仅2例(10.5%),差异非常显 着(P<0.01).同时MUC3在腺瘤样息肉组粘蛋白表达分布于 胞浆内,胞核周围密度增大,核内仍无表达,见图3. 2.2.4MUCSAC免疫组化表达对照组胆囊标本粘蛋白弥 漫均匀分布于胞浆两极区域,粘膜表面也有均匀的一层阳性表 达产物.腺瘤样息肉组表达情况相似,仅阳性率显着升高(P< 0.05),表达阳性密度总体观察稍有增强,见图4. : 图1MUC1在腺瘤样息肉中的表达(ABCX200) F1ExpressionofMUC1ingallbladderadtmonmtiodpolyps(ABC×200) 图2MUC2在腺瘤样息肉中的表达(ABCX200) Fig2K,~pressinnofMUC2ingallbladderadenomatiodpolyps(ABCX200) 图3MUC3在腺瘤样息肉中的表达(ABC×200) Fig3ExpressionofMUC3ingallbladderadenomatiodpolyps(ABC×200) 图4MUCSAC在腺瘤样息肉中的表达(ABC×200) Fig4ExpressionofMUCSACingallbladderadenomatiodpolyps(ABC×200) ? .t f , 第10期陈东,等.粘蚩白住胆囊腺熘样息IIt的表达及意义1243 2.34种粘蛋白Weste111blot杂交分析见表2 表24种粘蛋白westernblot杂交结果(n=6,4-s) Tab2ODVfromWesternb~oaingofmucinincholecystadenon~tiod polypsandcontrol(H=6.j-t-S) Gm... O ... d .. u .— / —— m —— m — 2 ——— o —— f ——, w .. e .. s .. t . e .. r . n ... b .. 1 . o .. t . t . i . n .. g ..— w — 4fi .. c —. h —— s —— e —— a —— m —— ai — n — g ———— b — y ———— ( — x —— M —, T~.... t . e .. r .—— MUCIMUC2MUC3MUC5AC :P<0.05.*:P<0.0l傩control;Odu:opticaldenstityvalues MUC1粘蛋白,Westemblot所得结果与免疫组化结果一致, 腺瘤性息肉组表达量显着高于对照组,然而在MUC2,对照组胆 囊几乎不表达,这与免疫组化结果似乎柏矛盾.事实上免疫组 化结果也同样提示对照组MUC2表达与MUC1,MUC3,MUCSAC 相比是最少的,仅有5例,但Westernblot显示在腺瘤性息肉组 已有一定的表达,尽管无法进行统计分析,但此时其表达明显 增高.MUC3同免疫组化结果相同,在腺瘤性息肉组表达量同 样显着低于对照组.MUCSAC与MUC1和MUC2变化相一致, 腺瘤性息肉组较对照组显着升高(P<0.01). 3讨论 粘蛋白(MUC)是一类含有寡糖链的糖蛋白,其分 子量较大,糖链的比例约占整个分子量的50%, 90%.粘蛋白主要存在于胃肠道,呼吸道,泌尿生殖道 表面细胞及其分泌的粘液中,除保护和润滑功能外,还 参与细胞间粘附,细胞问通讯,作为细胞受体等多种功 能[3j.迄今,已发现9种粘蛋白,分别被命名为MUC1 , 9.胆囊上皮细胞也可分泌粘蛋白,胆汁中有丰富的 粘蛋白成分,对粘蛋白研究既往主要集中在胃肠道相 关疾病,与胆囊疾病,尤其是与腺瘤样息肉的研究甚 少. 粘蛋白与癌前病变及癌的关系既往研究集中在胃 肠道肿瘤及乳腺肿瘤等领域,研究表明粘蛋白与胃癌 及乳腺癌及其癌前病变有一定关系,粘蛋白可作为一 种肿瘤标志物J,并有学者发现粘蛋白相关性肿瘤疫 苗可作为肿瘤生物治疗的一种方式,有一定效果]. 在胆囊的慢性炎症和胆囊结石的长期反复刺激下,胆 囊上皮细胞会发生化生,增生,不典型增生,还可发生 息肉.胆囊息肉,尤其是腺瘤样息肉常伴有增生和化 生,与胆囊癌发生有一定关系,被认为属癌前病变范 畴. MUCI和MUC5AC在对照组胆囊粘膜中皆有表 达,主要分布于柱状的细胞浆内,而MUCI和MUC5AC 也同时存在于细胞表面,可能与MUCI和MUC5AC是 跨膜蛋白有关,MUCI和MUC5ACWestembl0t结果与 免疫组化结果一致,提示这两种粘蛋白广泛存在于胆 囊上皮细胞中,是胆囊上皮细胞合成和分泌的一种蛋 白质.在胆囊息肉组,免疫组化显示MUCI和 MUC5AC较对照组阳性率明显升高(P<0.01),且阳性 表达程度明显增高,颗粒多,染色深,偶可见聚积现象, Westemblot也显示同样结果.提示在发生胆囊腺瘤 样息肉时,MUC1,MUC5AC表达明显增强,这可能与其 基因被激活,使其呈现出增殖能力活跃的生物学性 状,从病理学角度看胆囊腺瘤样息肉常伴有化生和 不典型增生,可能属于胆囊癌前病变的一种.我们的 研究结果与MUC1和MUC5AC在胃癌前病变中变化相 类似],这从另一个侧面提示胆囊腺瘤样息肉可能是 一 种癌前病变. MUC2在正常胆囊粘膜阳性率较低,阳性颗粒数 量少,且主要存在于胞浆内,这可能是因为MUC2属分 泌蛋白有关.在腺瘤样息肉组阳性率显着增高(P< 0.05),而Westemblot结果与免疫组化略有不同,对照 组胆囊标本表达极微弱,而在腺瘤样息肉时表达有所 增加,这与在膀胱癌研究中发现当细胞显示增生活跃, 分化度变差时,MUC2基因可被激活,使得其蛋白表达 有所增加.尽管这与MUC1,MUC5AC变化相一致, 但为何正常胆囊上皮中IHC染色可出现阳性,而West— emblot几乎无杂交信号,这可能与MUC2在正常胆囊 粘膜表达少或免疫组化结果干扰因素较多有关". MUC3主要分布于肠道,肠癌时表达明显增强. 四种粘蛋白中,MUC3在对照组阳性率最高,是因为 MUC3是正常胆囊上皮细胞分泌的主要粘蛋白引.但 在胆囊腺瘤样息肉时,MUC3表达却显着下降(P< 0.O1),结合病理观察腺瘤中不典型增生越重者MUC3 表达越少,其原因可能是癌前病变或发生癌变时 MUC3大量消耗或基因关闭,突变所致.我们还在胆 囊炎中的研究资料显示MUC3随炎症加重也进行性下 降,腺瘤时更低.这是否提示胆囊结石,慢性炎症,癌 前病变是一个相互关联,渐进发展的过程. 胆囊息肉样病变属胆囊癌前病变范畴,4种粘蛋 白在正常胆囊粘膜及息肉时表达不同步,提示疾病状 态下粘蛋白表达有时序性.粘蛋白与胆囊腺瘤样息肉 发生和发展有一定关系,但它们是否为胆囊腺瘤样息 肉向胆囊癌发展的始动或促进因素,尚需进一步研究. 参考文献: [1]蔡文琴,王泊.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].成 都:四川科学技术出版社,1994.496—497. [2]金冬雁,黎孟枫,译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社, 1995.888—905. 13jVoynowJA,RoseMC.QuantitationofmucinmRNAinrespiratoryandint. finaleplthehalcells[Jj.AmJRespirCellMolBid,1994.11(6):742—756. t4jKlinkspoorJH,YoshidaT.LeeSP.Bilesaltsstimulatemucinsecretion bycultureddaggallbladdereplthelialcellsindependentoftheirdetergentef- feetlJj.BiochemJ,1998,332(pt1):257—262. 15JYaoT,KouzukiT,KajiwaraM,et.Serratedadenonlaofthec0lorec. ttml,withreferencetoitsgastricdifferentiationanditsmalignamtpotential 第24卷第l0期 l2442002年l0月 第三军医大学 ACrAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAE Vo1.24.No.10 0ct.2002 【J].JPathol,1999,l87(5):5I1—517. [6]ApostolopoulosV,SaudrinMS,Mcke~mieIF.Carbohydrate/peptidemim— ics:effectoI1MUC1cancerinwmmotherapy[J]JMolMed,1999,77(5): 427—436. [7]于皆平,沈志祥,罗和生.实用消化病学lM].北京:科学出版社 1999.1321—1322. 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(编辑郭建秀) 个案与短篇 6例骨原发性平滑肌肉瘤临床病理,免疫组化研究及文献复习 文章编号:lO00—5404(20o2)10一l244l Clinicopathologicandimmunohistochemicaistudyof6casesofprimaryleiomyosarcoma deriredfromboneandliteraturereview 李增鹏,仲召阳,吴晓华,陈芳(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科, 重庆40o042) 骨原发性平滑肌肉瘤比较少见,自Evans(1965年)首先报 道1例发生于左胫骨上端的平滑肌肉瘤以来,国内外共报道百 余例,我们报道6例骨原发性平滑肌肉瘤,并结合文献对其临 床病理特征及组织发生进行探讨. 1材料和方法 6例骨原发性平滑肌肉瘤选自大坪医院1997—1999年,经 病理确诊.全部标本用10%福尔马林固定,石蜡包埋,5连 续切片.试剂SMA,Vimentin,S-IO0,CK,Desmin均为Dako公司 产品. 2结果 2.1临床资料 6例骨原发性平滑肌肉瘤,男性5例,女性1例,年龄28, 67岁,平均年龄44岁.临床症状最多见为疼痛,其次为肿块及 病理性骨折,病变部位最多见于下肢长骨的干骺端,尤其是膝 关节附近4/6(66.7%),其次为股骨粗隆及胫骨,各占16.7%,有 2例发生复发及转移,分别转移到肺和骨.X线主要表现为溶 骨性破坏,3例呈中心无明确境界的不斑片状溶骨性破坏, 2例呈囊状多房膨胀性改变,并且有溶骨性破坏.1例为境界 不清的斑片状溶骨区伴有不规则致密钙化影,有明显的骨膜反 应,表现为Codman三角. 2.2病理资料 2.2.1巨检肿瘤特征性的表现为浸润性的灰白色肿块伴 有局灶性坏死和囊性变.损害范围2,8cm,平均为5.3c,有 作者简介:李增鹏(1958一),男,山东省济南市人,副教授,主要从事肿瘤方面 的研究,发表论文lO篇.电话:(023)68757384 收稿日期:2001—10-O9;修回日期:200112-09 3例(50%)穿透皮质,累及软组织.肿块多为结节状,质嫩,呈 鱼肉样.病变处骨皮质扩张变薄,部分突破骨皮质向肌肉浸润 性生长形成多个小结节. 2.2.2光镜观察肿瘤细胞呈束状排列,部分区域显示有 特征性的车辐状排列.高分化的平滑肌肉瘤,瘤细胞长梭形, 胞浆丰富,红染,有的核两端钝圆,呈雪茄样,核模清晰,核染色 质呈颗粒状,核分裂多少不等,另外可见有典型的血管外皮瘤 样病变,多形性的平滑骨肉瘤中,瘤细胞大小不一,形态各异, 核圆形,椭圆形,梭形,不规则形,可见有多核细胞及巨细胞. 核分裂像多见,间质有出血,坏死及炎细胞浸润.上皮样平滑 肌肉瘤中可见肿瘤细胞呈圆形,核大空泡状,有清楚的核仁. 每l0个高倍视野的核分裂例1到l6例,平均为5,6个. 2.3免疫组化结果 所有肿瘤的Vimentin和SMA都强阳性,弥漫分布,有3例 Desmin和S-100呈局灶性弱阳性,1例上皮样平滑肌肉瘤,低分 子量角量蛋白呈局灶性弱阳性. 2.4随访 6例均得到随访,随访时间为4,27个月,随访结果,4例无 瘤生存,2例发生转移,1例转移到股骨上段,另一侧转移到肺, 3个月后死亡. 3讨论 骨原发性平滑肌肉瘤比较少见,发病年龄为l3,90岁,高 峰年龄为60,70岁,男女发病率大致相等.长期进行放化疗 患者,白血病,淋巴瘤以及Paget病的患者,双侧视网膜母细胞 瘤的患者,易患有骨内平滑肌肉瘤.临床症状无特异性,最多 见为疼痛,其次为肿块及病理性骨折.肿瘤具有孤立性发生的 特点.本肿瘤较少发生转移,转移最多见于肺,其次为骨.骨 (下转1247页)
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