试验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白[总论]

试验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白[总论] 实验三 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清脂蛋白 课程名称:生物化学与分子生物学实验课 :2005 专业、层次: 授课教师:符伟玉 职称:讲师 学时:3学时 基本教材:自编《生物化学与分子生物学实验指导》 教学目的与要求: 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，了解其操作。 2、了解血清脂蛋白各组分的分离情况。 大体内容与时间安排: 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 5min 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤及示范 10min 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意事项 5min 4、学生做实验 100min 教学方法:讲授式+启发式 教学重点、难点: 重点:1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤 难点:1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 2、实验操作中的灌胶和点样 一、实验原理 (一)浓缩效应 - 在pH=6.7的浓缩胶中带电粒子的泳动速度为: Cl>protein>Gly，蛋白质样 -品夹在Cl和Gly之间被挤压成一条狭窄的区带,使蛋白质样品浓缩。 (二)电荷效应 不同蛋白质pI不同，在相同pH值下所带电荷不同，因此在相同电场强度作用下，在电场中的移动(泳动)速度不同，可以根据这一效应把蛋白质分成不同的区带。 (三)分子筛效应所聚合形成的PAG为多孔网状结构，对大分子物质的穿透有一定阻力，蛋白质在通过具有均一孔径的凝胶时，因颗粒大小不同，形状规则程度不同，所受阻力也不相同。利用本效应也可以将蛋白质分离为不同的区带。 颗粒大形状不规则的分子?阻力? ?电泳v ?颗粒小, 球形分子?阻力? ?电泳v ?将血清脂蛋白用苏丹黑B丙二醇预染，加于聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此它的分辨率高，可将血清脂蛋白各组分清晰分开。 二、操作步骤 1、4%凝胶制备:将清洁的0.5 ×1.5cm玻璃管若干支垂直插在橡皮座上，以备 制胶。从冰箱中取出下列试剂，在室温中平衡，然后在一小三角瓶中依次加 入: 30% Acr 1.3ml Tris-EDTA-Na缓冲液 1.2m1 2 蒸馏水 7.3ml TEMED(四甲基乙二胺) 0.01ml 10%过硫酸铵溶液 0.5m1 (加入过硫酸铵轻轻混合后即开始聚合。因此, 装柱要求在5min内完成。) 2、装柱:迅速用吸管吸取上述混合液沿管柱注入玻管中,每管0.8ml-1.0ml,随即 用滴管经针头沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度以隔氧，室温静置30min, 在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示凝胶聚合己完成，倒去水层，用 滤纸条轻轻吸去凝胶表面水分，注意不能损伤已聚合的凝胶表面。 、样品制备与加样:取血清0.2ml, 加苏丹黑B丙二醇液0.02ml,加25%蔗糖溶3 液0.02ml,混匀,室温放置45min后, 2000r/min离心5min。然后取预染血清50 μl,加在凝胶面上, 再沿管壁缓慢加入电泳液直至管的顶端。 4、电泳:将加样的凝胶玻管从橡皮座上取下，插入带孔的电泳槽中，塞紧。不 能漏水，凝胶管必须垂直。在上下两槽中分别注入电泳缓冲液，上槽接负极， 下槽接正极，电流为2,5mA/管，待第一色带到达胶管下段约1cm时停止电 泳，一般需20,30min。 5、剥胶:将上槽缓冲液倒出(装于另一瓶内)，将凝胶管取下。取一支带长针头 (约10cm)的2ml注射器;吸满蒸馏水，将针头从浓缩胶一端小心地沿管壁 插入其与凝胶之间，转动玻管，同时注入蒸馏水，使胶柱随水的压力及润滑 作用从玻管中脱出。必要时在针剥后用洗耳球从一端缓慢吹出。 6、观察与作图:肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其排列顺序，绘图记录之。 三、注意事项 1、丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，过硫酸铵为有毒成份，并对皮肤有 刺激作用，注意避免直接接触(漏胶时不要用手接触)。大量操作时应在通 风橱中进行。 2、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4?)保存。可贮 存1~2月。测定pH值(4.9~5.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。 3、TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。 4、配胶取样要准确，最后加过硫酸铵，加完后轻轻混合(关键); 5、配好胶后应于尽快灌胶(不要形成气泡)，5分钟内完成装柱，清洗仪器; 6、切记装柱后立即用蒸馏水封闭; 7、灌胶和电泳时要注意排除气泡; 8、加样时注意不能损伤已聚合的凝胶表面; 9、电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳槽垂直; 10、凝胶和滤纸请放入垃圾桶中，勿直接倒入水池; 11、电泳时间不能过久，待第一条色带到达玻璃管下端约2cm时停止电泳，否则 色带会变宽。 四、思考题 1、正常空腹血清脂蛋白电泳可出现哪些区带,将本实验的电泳图谱与血清琼脂 糖凝胶电泳图谱比较并解释。 2、聚烯酰胺凝胶电泳分离出的各种血清脂蛋白是否为均一物质,为什么, 小 结 实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋 白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种 效应，所以此方法分离效果好，分辨率高。兔血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶盘状电 泳中可分出3~4个组份。