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改-HIV病毒载量检测及耐药分析

2017-09-02 22页 doc 232KB 82阅读

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改-HIV病毒载量检测及耐药分析改-HIV病毒载量检测及耐药分析 HIV病毒载量检测及耐药分析 一、HIV病毒载量 (一)HIV病毒载量的概念 1987年由John首次提出,它是指病毒的负荷,即在HIV感染者体内复制病毒的数量。 感染者体内复制的病毒数量不能够直接检测,一般用血浆中HIV-RNA的拷贝数来代表HIV的病毒载量。 (二)病毒载量检测的意义 1、检测HIV病毒载量可预测疾病的进程。 HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密 切,观察感染者病毒载量的水平可以大 致预测其发病的可能。 2、可用于辅助诊断 ?急性感染辅助诊断 在HIV...
改-HIV病毒载量检测及耐药分析
改-HIV病毒载量检测及耐药分析 HIV病毒载量检测及耐药分析 一、HIV病毒载量 (一)HIV病毒载量的概念 1987年由John首次提出,它是指病毒的负荷,即在HIV感染者体内复制病毒的数量。 感染者体内复制的病毒数量不能够直接检测,一般用血浆中HIV-RNA的拷贝数来代表HIV的病毒载量。 (二)病毒载量检测的意义 1、检测HIV病毒载量可预测疾病的进程。 HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密 切,观察感染者病毒载量的水平可以大 致预测其发病的可能。 2、可用于辅助诊断 ?急性感染辅助诊断 在HIV急性感染的早期,会出现抗体 的窗口期,此时无法检测到HIV特异性抗 体。但这时感染者体内的病毒RNA通常 会出现一个高峰期。因此,采用病毒载 量来作为抗体检测的辅助诊断,会避免了由于窗口期而造成的漏检。 ?婴幼儿HIV感染早期诊断 宫内感染:HIV阳性的母亲所生的婴儿出生48小时内,进行病毒载量检测,如果检测到病毒核酸,则提示孕期(宫内)感染。 对18月龄以下幼儿的早期诊断:目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测如果均为阳性提示为HIV感染,均为阴性提示未感染。同时到18个月时做抗体检测,抗体确证阳性方可诊断为HIV感染。 3、指导治疗及评估疗效 ?CD细胞计数结合病毒载量检测是决定抗病毒治疗开始的两个非常关键的指4 标。HIV感染后并不是在任何情况都要进行抗病毒治疗,通常在病毒载量达到一定水平后(如>35000-50000cps/ml)开始治疗。 ?通过治疗后检测病毒载量的水平来确定治疗是否有效。HIV患者在接受治疗后,通常血浆中的病毒载量水平在4周内可下降10倍;在治疗3~6个月后,病毒载量应检测不到,否则可认为治疗效果不佳,甚至治疗失败。 (三)病毒载量的检测方法 1、样品的采集和处理 ?用于HIV病毒载量检测的样品可以为血清、血浆、组织和其他分泌物,有时候还包括生物制品。 ?采集样品应避免微生物和核酸的污染,避免RNA酶造成的降解,采集后应在4~8个小时内进行处理。处理的样品应分装、标记,冻存于-20?以下,RNA类样品需冻存于-80?。 ?样品的运送应在低温条件下进行。特殊情况下,可用特快专递形式投寄,但必须将盛样品的试管包扎紧固,保证不会破碎和溢漏。 1 检测病毒载量既可预测HIV进程,预测其发病,又可辅助诊断,那如何来进行病毒载量的检测,检测的结果又如何进行解释呢, 2、病毒载量的检测方法及质量控制 目前用于病毒载量检测方法主要有以下三种:RT-PCR、EasyQ和bDNA。三种方法呢均通过美国FDA认证,但三者检测原理不同。 ?RT-PCR方法 •原理 RT-PCR是基于HIV-1 RNA形成的CDNA的多聚酶链式反应。首先用异硫氰酸胍法提取病毒RNA,用异丙醇沉淀RNA。使用具有逆转录酶和DNA聚合酶活性的rTth DNA多聚酶,进行RNA逆转录,形成cDNA。在生物素标记的HIV引物、rTth DNA多聚酶、脱氧三磷酸核苷和合适的缓冲液成分存在的条件下,cDNA被PCR扩增到非常高的拷贝数。将扩增产物变性,变性后的单链DNA与微孔板上包被的核苷酸探针结合,被捕获在微孔板上。最后加入过氧化物酶标记的亲和素,与扩增产物结合,再加入特异的产色底物,产色底物在过氧化物酶的催化下,就可以发生颜色变化,此时用酶联检测系统就可以读出光密度。如果在提取RNA之前每份标本中加入已知拷贝数的标准品。定量系统通过比较病毒核酸和标准品扩增产物的光密度,计算出病毒RNA的拷贝数。 简而言之,PCR的方法为提取RNA,逆转录酶cDNA,然后对cDNA进行PCR扩增,形成大量的RNA拷贝,又将RNA拷贝变性成单链固定在微孔板底部,对固定的DNA进行标记,最后使底物显色。 •PCR的基本过程 第一步进行HIV-RNA的提取、纯化,裂解病毒包膜释放出RNA,经RNA纯化后,对RNA进逆转录,形成cDNA。 RNA 第二步对cDNA进行扩增,利用PCR的原理进行变性,形成两条DNA单链。 2 经过退火,引物会和DNA单链上的特异性序列相结合。 3’ Target Sequence 5’ Primer 2 Biotin Primer 1 Biotin 最后为延伸,通过Tag DNA聚合酶的作用促进引物延伸,完成一次PCR。 上述PCR过程完成后,原来的一条DNA双链即可形成两个完全相同的DNA双链,完成一次扩增。 Target Sequence Biotin Biotin PCR扩增结果 经过一轮循环,一条DNA双链就会形成两条DNA双链;两个循环后,可形 n成四条。PCR过程以2倍数进行扩增,如果进行30个循环,最后将得到一个庞大的DNA数量。 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 3 最后为扩增后检测 首先要将扩增的DNA双链进行变性,使它成为单链DNA,然后通过单链DNA与固定在微孔板底部的核糖核苷酸相结合,使变性的DNA单链被固定在微孔板的底部。 向其中加入可以和固定的DNA单链结合的氧化酶,并加入底物,在氧化酶的作用下底物会发生颜色反应。固定的DNA越多,结合在固定DNA上的过氧化物酶越多,产生的颜色反应越强。定量系统通过比较病毒核酸和标准品扩增产物的量即可定量计算出病毒的拷贝数。 •RT-PCR特点 第一,自动化程度比较高,每次最多检测48个样品。 第二,亚型覆盖范围广,包括HIV M组的A亚型~G亚型。 第三,RT-PCR动态检测范围是400~750,000 cps/ml,超敏方法检测下限达到50~75,000cps/ml。 第四,被临床和实验室广泛接受。 第五,受PCR固有某些因素的影响,如扩增污染,一些血浆成分和抗凝剂可能影响酶活性。 ?NASBA核酸序列扩增系统(NucliSens EasyQ) •EasyQ的原理 EasyQ是使用NASBA技术的扩增试验。NASBA技术选择性利用2个引物、 3 PCR步骤。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒个酶能够直接扩增病毒RNA而不经过 提取高纯度RNA,RNA通过重复的合成和转录得到扩增。具体过程为在AMV-RT的作用下,HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA,RNA链被RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成,形成双链DNA后,通过T7RNA多聚酶启动RNA的合成,如果这个循环不断重复,就使得HIV靶RNA在等温条件下得到大量扩增,扩增效率可达到100万到1000万倍。 扩增后的产物RNA通过Realtime的方法进行检测。如果在RNA提取前即加入一定量的拷贝数已知的内标物,定量系统通过样本核酸的测定值与内标物测定值的比较可计算得到样本病毒RNA的拷贝数。 •EasyQ的基本过程 首先裂解病毒,提取RNA,硅胶纯化。 其次为RNA扩增,RASBA中RNA扩增需3个酶、2个引物,其中的引物1具有一段T7启动子的位点。首先引物1与纯化后的RNA相结合,在逆转录酶的催化下形成DNA-RNA杂核双链,同时核糖核酸酶可将DNA-RNA杂核双链中的RNA进行切除。 反应完成后,原来的RNA被全部降解,得到一条DNA单链。引物2与此DNA单链结合,在逆转录酶作用下,形成DNA双链。 双链形成以后,T7启动,促使T7 RNA聚合酶结合在T7启动子位置,进而启动RNA的复制。经过复制后得到大量的RNA,这些RNA可循环进入下一轮逆转录,形成DNA单链,DNA双链再进行逆转录,如此循环,使RNA得到大量的扩增。 4 5’ 3’ 正义DNA AMV逆转录酶 核糖核酸酶H 3’ 5’ T7RNA聚合酶 扩增子 引物1 引物2 最后是扩增后实时监测检测,向扩增后的RNA中加入荧光分子信标的物质。荧光分子信标是一段人工合成的剪辑序列,一端为荧光基团,另一端是淬灭基团。当两端靠近时,荧光基团产生的荧光被淬灭基团所遮蔽,荧光不能显现;随着结 ,发光基团和淬灭基团距离增加,合的碱基越来越多,荧光分子信标的颈部被分开 荧光基团产生的荧光不能被淬灭基团所遮蔽,即可出现荧光。 通过检测荧光就可以实现对RNA分子的检测,复制的RNA越多,荧光强度就会越大。 如果在RNA提取的过程中,加入已知拷贝数的内标物,随同样本核酸一起提取纯化扩增。完成扩增后,内标物会形成一条曲线,定量系统可通过样本核酸的曲线和已知拷贝数内标物所形成的曲线进行比较,最终计算得到样本病毒RNA的拷贝数。 目标RNA 荧 光 强 度 内标物 反应时间 5 •NASBA-EasyQ的特点 第一,恒温(41? )RNA扩增,不需要温度循环。 第二,选择性RNA扩增,对扩增单链RNA的产物直接进行检测。 第三,对污染的控制,EasyQ系统采用独立、封闭反应试管,消除扩增后操作步骤,排除交叉污染因素。 第四,8个一组,每天可以做48个。 第五,与real-time检测技术相结合,边扩增边检测,大大缩短了检测的时间。 ? 分支信号放大系统(bDNA) •bDNA原理 血浆中的HIV-1 RNA通过信号逐级放大而定量,而不通过扩增,也不需要RNA提取和纯化。主要步骤:首先离心浓缩病毒颗粒,然后用去垢剂和蛋白酶K裂解毒粒,释放病毒RNA。裂解产物与两组寡核苷酸探针一起孵育,第一组捕获病毒RNA、同时与结合在微孔板上的寡核苷酸探针杂交。第二组寡核苷酸探针进行信号放大,它包括4种成分:与靶RNA和预放大探针具有同源性的寡核苷酸靶探针、预放大探针、放大探针和与碱性磷酸酶结合的标记探针。每一个组分都通过杂交与下一个位点结合,按照这种方式,信号被逐级放大而病毒RNA并没有复制。用碱性磷酸酶特异底物通过化学发光进行检测,发光强度与结合的核酸量成正比。 HIV-1 RNA的绝对量由在同一板上反应的外标曲线来确定,外标曲线即为已知拷贝数的标准品检测形成的曲线。 •bDNA基本过程 首先裂解病毒颗粒,释放出其中的靶标RNA。 靶标 RNA 病毒裂解同时灭活病毒RNA酶释放病毒RNA 第二步,病毒RNA的捕获固定。通过既可以与病毒RNA结合,又可以与微孔板上寡核苷酸探针结合的捕获探针将病毒RNA固定在微孔板底部。同时既能与病毒RNA结合,又能与预扩增探针相结合的靶探针也结合在病毒RNA上,为放大做好准备。 6 病毒RNA 捕获探针和靶探针同时和靶RNA结合, 靶探针 将其固定于微孔板底部 捕获探针 包被好的捕获探针 微孔板 第三步,前信号放大分子杂交:加入预放大探针后,预放大探针即可通过靶 以结合若干预放大探针,探针结合在已经固定的病毒RNA上,每个病毒RNA上可 信号被放大。 预扩增探针 预扩增探针 每一个预扩增探针必须结果两个靶探针 病毒RNA 靶探针 捕获探针 包被好的捕获探针 微孔板 第四步,信号放大分子杂交:如果再向其中加入放大探针,它选择性地结合在预放大探针上,每一条预放大探针上可以结合大量的放大探针,信号得到进一步的放大。 7 放大探针 放大探针 预扩增探针 病毒RNA 靶探针 捕获探针 第五步,如再向其中加入磷酸酶标记的标记探针,标记探针与放大探针相结合,每一个放大探针上可结合大量的标记探针,使信号更进一步被放大。 与放大探针结合 后的标记探针 预防大探针 碱性磷酸酶表姐的标记探针 病毒RNA 靶探针 捕获探针 包被好的捕获探针 第六步,向其中加入标记探针作用的底物,在标记探针上碱性磷酸酶的催化作用下,底物产生荧光,进而得到检测。通过标本反应强度与标准品强度的比较,确定标本的病毒载量拷贝数。 8 与放大探针结合 后的标记探针 加入底物及底物增强剂发光 预防大探针 光的强度与病毒RNA含量成正比 靶探针 光的强度与病毒RNA含量成正比 捕获探针 包被好的捕获 探针 •bDNA技术的特点 不需要RNA提取、纯化及PCR扩增,避免了提取和扩增核酸可能产生的污染问题。 没有PCR反应,不受抑制Taq DNA聚合酶因素(如肝素)的影响。 精确度好,结果数据稳定可靠。 能够与HIV-1 M群的A~G亚型结合。 可批量处理样品,最多168个。 实验环境不高(one room technology)。 方法操作简便,无需特殊耗材,操作人员易于掌握。 ?对三种病毒载量检测方法进行比较。 Amplicor HIV-1 方法 NucliSens EasyQ Quantiplex HIV-1RNA Monitor 原理 RT-PCR NASBA+realtime bDNA 400-750,000cps/ml 检测范围 50-3,000,000IU/ml 50-500,000cps/ml 50-75,000cps/ml 结果比较 0.51cps/IU 1cps/IU 0.31cps/IU 检测亚型 A~G A~G A~G 标本量 0.2ml 10μl-2ml 1ml FDA批准;可检测组织FDA批准;不扩增,降优点 FDA批准;应用广泛 和体液等标本;检测范低了 污染的可能性;围宽 同时可检测大批量标本 易受污染;对抗样品提取(不使用无内标,无法控制 缺点 凝剂敏感,只能使用自动提取仪时) 时工作单孔间的失误,每次12 EDTA 量较大。 个标准品,少量检测, 9 成本较高 ?病毒载量检测结果的分析和解释 目前用于统一不同定量方法检测值的标准品尚未问世,因此不同定量方法结果之间不能直接进行比较,对同一病人治疗前后进行检测尽量采用同一方法、同一类样品进行检测,尽可能减小误差。 分析一个病人不同时间病毒载量测定的结果,首先要考虑测定结果的变化,病毒载量的变化范围如果超过实验和每日的正常变化大约3倍,应视为存在生物学的意义的变化。 病毒载量核酸检测的显著优点为高度敏感性,因此增加了污染和取样误差的危险。作为HIV感染的辅助治疗,病毒载量检测不能完全确定是否感染HIV,但当病毒载量出现较高拷贝数值的阳性结果时(>1000),提示HIV感染的可能性非常大。这时,应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析判断。对于低于最低检测限的样品,也不能排除HIV感染。 Amplicor HIV-1 Monitor、NucliSens EasyQ、Quantiplex HIV-1RNA这三种病毒载量核酸检测敏感性都非常高,这也就意味着如果出现污染或取样量误差,结果会谬之千里,那么要采取哪些质量控制手段,从而尽可能减少误差呢, ?质量控制 •样本 样本的类型,血清和血浆样本均可以用来测定病毒载量,用三种方法进行比较发现血清和血浆测定的结果有高度的相关性。 抗凝剂,抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适合做Amplicor HIV-1 Monitor,不同抗凝剂对RNA降解的速度是不同的,EDTA钠盐是首选的抗凝剂。 标本的处理时间和温度,用加有EDTA抗凝剂的真空采血管抽取静脉血,快速分离血浆,6h之内分离标本的测定结果较好。并分装1.2~1.5ml/管,低温保存。-70?保存能减少HIV RNA的降解,样品避免反复冻融。 •检测 检测实验室应该能够满足需要,做到严格分区。 应该严格按照操作说明书或实验室制定的SOP(标准操作程序)进行检测。 病毒载量检测方法本身的复杂性增加了系统和随机误差。试剂昂贵的价格也限制了技术人员对方法的熟悉、对试剂的和对仪器的研究,这些都增加了出现错误和误差的危险。因此要认真分析这些因素,确定重点监控对象,同时应避免过分纠缠没有临床意义的细小误差而造成浪费。 •结果 一般仪器检测完毕可进行自动分析,打印出结果报告,通过察看报告来确定此次实验是否通过、是否需要重复并查明原因。 报告中应注明使用的检测方法、最低检测线、样本的种类及样品量。 报告中还应附上仪器打印的数据。 发报告前应核对原始检查记录和报告,同时参考病人的资料,分析病人在一 10 段时间内的变化和趋势,对与临床情况不符时进行仔细调查。同时监测一段时间内正常与异常检测报告的比例,及时发现问题。 二、HIV病毒变异和耐药性的检测 (一)HIV耐药定义 HAART治疗的广泛开展,病毒变异和耐药株正在不断出现,甚至对一随着 个药物的耐药可引起多种药物的交叉耐药。 定义 HIV的耐药性是指HIV病毒通过自身的遗传变异产生对药物抑制作用,敏感性降低或者不敏感的现象。如AZT敏感的野生株抑制50%病毒生长的药物浓度(IC)为0.01~0.05μmol,高度耐药病毒株可达1μmol以上。 50 (二)耐药机理 9101、内因:HIV基因的高度变异性,HIV有很强的复制能力,每天约产生10~10个病毒颗粒,而HIV逆转录酶缺乏纠错功能,因此在复制过程中,病毒核酸表现出高度的错误倾向性。理论上,病毒基因组中平均每个碱基每天突变一次。HIV基因重组也可进一步增加基因变异。 2、外因:药物的选择压力,在抗病毒药物的选择压力下,敏感病毒株受到抑制,耐药病毒株趁机大量复制而成为优势株。在药物选择压力下,耐药变异株最快能在14~28天内完全取代药物敏感株。 3、HIV病毒耐药性的产生 是HIV耐药株在病毒自发性的高频率的基因突变中产生,在药物选择性的压力下优势复制的结果。 4、促使HIV耐药性病毒株出现的因素 ?病毒载量 研究证实,病毒载量越高,耐药病毒株出现的时间越快。 ?患者服药的依从性 11 当患者的服药依从性超过95%时,治疗失败的概率只有21%左右。相反患者的服药依从性小于70%,治疗失败的概率高达82%。 100 82.1 病80 71.4 毒66.7 学 54.6 60 失 败 率40 21.7 % 20 0 >95 70-80 <70 90-95 80-90 服药依从性 (%) ?药物配伍不当 药代显著不同的药物配伍,几种药物代谢速度不同,会造成在接受抗病毒治疗的时有一段单药治疗时间,易诱导产生耐药性病毒株。 缺乏对某一时相细胞内病毒的抑制,相同血药浓度对活化期细胞内的病毒产生抑制作用,而对静止期细胞则无抑制作用。 ?其它因素 包括胃肠道吸收障碍(呕吐、腹泻);随意间歇停药;与中药或其他药物同时服用等。 及时发现HIV病毒耐药对患者控制病情,防止并发症,延长存活时间均有重要意义,那么,什么时间,采用哪些方法能及时发现HIV耐药, (三)HIV耐药检测方法及原理 1、检测方法有三种:表型耐药检测法、基因型耐药检测法以及虚拟表型耐药检测法。 ?表型耐药检测(Phenotyping):是指在不同药物浓度下检测病毒RT基因和PI基因的复制能力。直接测出HIV-1对药物的敏感度,并能揭示事先存在或交叉的耐药情况,有利于指导HIV-1感染者有效地用药。这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药量度数据(低,中,高)。缺点是试验慢且昂贵,技术要求高。 ?基因型耐药检测(Genotyping):检测病毒RT和PI基因序列,与标准序列对比。当病毒对某些药物产生耐药性时,病毒基因会发生一些明确的突变。病毒耐药基因型的检测有助于预测某些药物的治疗效果。基因型耐药检测方法的特点是简单快速,费用低。缺点是能确认所分离到的基因变异,但无法指出药物耐药的程度。 ?虚拟表型耐药检测(Virtual Phenotyping):根据基因型耐药监测结果推测表型耐药结果。 12 2、HIV耐药检测原理 无论是表型耐药或基因型耐药,首先要经过PCR扩增,得到患者体内病毒的逆转录酶基因以及蛋白酶基因。 如果采用基因型耐药检测方法,应对得到的逆转录酶基因以及蛋白酶基因进 测序结果和参考序列进行对比,最后通过计算机分析模拟,得出基因型行测序, 耐药报告。 如果采用表型耐药检测方法,将目的基因插入到一个基因重组的质粒中,用此质粒去感染一种具有感染性的病毒颗粒,形成具有感染性病毒颗粒后,在不同药物浓度下检测其复制能力,依据对照株病毒与被检测病毒的复制能力的改变来进行判定。 (四)耐药检测 1、两个概念 ?IC50是抑制病毒50%生长时的药物所需浓度 ?FC值(Fold-change)是用病人病毒的IC与对照病毒的IC的比值 5050 2、表型耐药检测报告 病人的FC值=病人的IC/对照病毒的IC,FC值如果达到5~10倍以上,则可5050 认为检测报告是阳性,即耐药。 % Patient: Control : Fold-change =10 % Inhibition 病人病毒 IC/ 50 对照病毒 IC50 Nelfinavi r 表型耐药检测的报告会给出每一种药物的耐药程度,直观清楚,有利于医生掌握病人耐药的情况。 13 Virologic PhenoSense结果 Virologic PhenoSense结果 3、基因型耐药检测的检测原理 ?检测方法 患者体内从患者的血浆中提取病毒RNA,然后进行逆转录、PCR扩增并得到病毒的蛋白酶和逆转录酶基因片断,对其进行测序,对测序结果进行分析和标准株进行对比,鉴定耐药突变,解释变异模式。 ?检测原理 A图黑箭头所指的方向是野生株序列,不耐药的野生株的这个位点是一个碱基C,一旦发生耐药后,B图中同样的位点则变为碱基T,说明这个碱基发生了突变。由于3个核苷酸编码为一个密码子,每一个密码子又编码一个氨基酸。因此一个密码子发生突变就可能导致它所编码的氨基酸发生突变,而氨基酸一旦发生突变,病毒的耐药性即可能出现。 野生株序列 参照序列 基因突变的表达形式,通常是以字母、数字、字母方式来表示,第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸,第二个字母代表在特定密码子处被替换的氨基酸,中间的数字表示突变位点的位置。例如逆转录酶基因,K103N的突变,表示逆转录酶第103位密码子的氨基酸由原来的赖氨酸K变成天冬酰胺N。 14 K103N “K”是 “野生型” 氨基酸 “N ” 突变氨基酸 赖氨酸(Lys ) 天冬酰胺(Asn) “103”氨基酸密码 核苷类药物标志性突变,M184V非常常见,出现这个位点HIV病毒很可能对拉米呋啶产生耐药性。出现在L74V位点,很可能会对DDI、ABC产生耐药性。 非核苷类药物常见的耐药突变模式,包括K103N、V106M、Y181C以及Y188L等。 4、基因型耐药检测方法与表型耐药检测方法比较 表型耐药检测方法优点为解释简单,多位点突变效应可以直接解释净效应;缺点为很多药物还没有确定临床相关阈值,临床应用经验少,价格昂贵 ($1000),出结果慢(3~4 周)。 基因型检测方法优点为临床经验比较多,相对比较便宜,1~2天可出结果;缺点是结果解释困难,多位点的突变难以确定静效应。 5、基因型检测的注意事项 ?突变株占病毒总数的20%以上才能检测出来。 ?病毒载量500~1000以上才可进行检测。 ?检测的是正在服用或最近(1个月内)服用过的药物的耐药情况。 ?需要专家解释结果。 ?耐药检测结果可提示弃用某药,而不能指导用药。 6、选择耐药检测的时机 IAS-USA 欧洲指南 临床背景 DHHS 以下情形推荐(1)开始治疗; 原发/新近感染 考虑 考虑 (2)当地耐药性毒株的传播率较 高;(3)怀疑耐药患者所传播。可 考虑或留取标本 慢性HIV感染 考虑 通常不推荐 考虑,或留取标本 推荐使用 初次治疗失败 推荐使用 推荐使用 推荐使用 多药治疗失败 推荐使用 推荐使用 推荐使用 怀孕 推荐使用 推荐使用 15 7、应用病例 左图为某儿童病例,开始进行抗病毒治疗后,病毒载量出现下降,但效果并不理想,而且很快出现了病毒反弹,经连续检测三次,发现病毒载量持续维持在一个较高的水平。我们对他进行耐药检测,发现他对所有的核苷类药物几乎全部 因此给予颗粒质治疗,效果非常明显。 耐受。 右图病例,开始接受抗病毒治疗效果非常理想,病毒载量几乎为零,而且长期维持在这样一个水平,但4个月后产生了病毒反弹,且病毒载量越来越高,到后期该患者几乎对所有的核苷类、非核苷类以及蛋白酶抑制剂全部产生耐药。 DP31 HZ161 M41L,E44D,T69D, L100I, V118I,M184V,L210W, M41L,D67N,T69N,K103N Kaletra T215Y,M230L 1,000,000 D67N,T69N,K70R,A98G,K70R,A98G, 1,000,000 None M184V,T215F, K219Q M184V,T215F 100,000 L63P 100,000 M46I,L63P, 10,000 L24I,L63P10,000 V82F None , 1,000 1,000 A71V,V77100 100 I, (lg V82A,I9310 10 HIV-1 Plasma compies/ml)L RNA1 1 0 1 2 3 4 6 8 10 11 12 13 15 24 0 2 6 8 19 25 37 Months Months HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切,感染者病毒载量的水平可以大致预测其病程。HIV耐药 株是在病毒自发性的高频率的基因突变中产生,在药物选择性的压力下优势复制的结果。二者的关系是: 病毒载量越高,耐药病毒株出现的时间越快。对于HIV感染者而言,检测其病毒载量和耐药状况,对于 指导合理的临床治疗,减少并发症,延长生命均有十分重要的意义。 16
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