[终稿]豆腐乳毛霉干粉菌剂的研制

[终稿]豆腐乳毛霉干粉菌剂的研制 豆腐乳毛霉干粉菌剂的研制 摘 要 本论文主要进行了以下几方面的研究工作: 首先，研究了中国传统腐乳酿造中的毛霉酿造工艺，并且进一步研究了使用纯菌种发酵与传统自然接种发酵之间的差异。 第二，研究了腐乳菌种Z328及其前酵条件。Z328属于放射毛霉属，最适生长温度28?，pH5~6，相对湿度96~97%。 第三，研究了毛霉发酵型腐乳的风味产生机理。腐乳中的鲜味物质主要是氨基酸，毛霉在豆腐坯表面生长时，在豆腐坯表面形成坚韧的皮膜，并产生大量的蛋白酶，蛋白酶对豆腐坯中的蛋白质进行分解产生氨基酸，成为豆腐乳中的主要风味物质。 第四，研究了毛霉菌种的扩大培养及其中的无菌操作。 第五，研究了冷冻干燥法制作毛霉干粉菌种的工艺。 最后，对毛霉干粉菌剂的使用方法进行了研究，并进行了腐乳的生产实验。 关键词:腐乳，毛霉，发酵，酿造，蛋白酶，干粉菌种 Development on the Powder culture of Sufu Mucor ABSTRACT The thesis’s major rusearch tasks are as follows: Firstly, the traditional technology of SOFU production in china was invested,and the differences between the tradition technology and the new technology that ferments with pure Mucor.were also mentioned. Secondly,Mucor sufu Z328 and the conditions for the strain Z328 were at pH5~6,temperature28?,relative humidity96~97%. Thirdly,researched the flavor constituent in SOFU,the amino acide formed by Mucor is the major flavor factor of SOFU.While the Mucor growing on the TOFU curd ,it produced protein enzyme,which converse protein into amino acide. Fourthly,practiced the extention development of Mucor,and reviewed the operation without germ. Fifthly,practiced the refrigeration dehydration used in pure Mucor production. At last,I practiced the producation of SOFU with dehydrated pure Mucor togain the usage of pure Mucor. KEYWORDS:SOFU,Mucor,Z328,protein enzyme,amino acide ,refrigeration dehydration. 目 录 摘 要 ...................................................... I The Development of Powder SOFU Mucor ...................... II ABSTRACT .................................................. II 录 .................................................... III 目 第一章 绪 论 ............................................... 1 1.1豆腐乳生产的发展及现状 .............................. 1 1.2豆腐乳的分类 ........................................ 2 1.3 豆腐乳的酿造机理及主要风味物质 ...................... 3 1.4 豆腐乳消费水平及前景 ................................ 4 1.5豆腐乳的营养保健功能 ................................ 4 1.6 本论文的主要研究内容 ................................ 5 第二章 Z328的扩大培养及菌种的保藏 .......................... 6 2.1 引子 ................................................ 6 2.2 实验材料及设备 ...................................... 6 2.2.2 实验设备 ...................................... 6 2.3 Z328扩大培养的实验方法 ............................. 6 2.3.2 三角瓶培养基的灭菌 ................................... 6 2.3.3 三角瓶麸皮培养基的接种 ............................ 7 2.5 结果与讨论 .......................................... 9 2.6 本章小结 ............................................ 9 第三章 冷冻干燥法制取Z328干粉菌种 ........ 错误～未定义书签。 3.1 引子 ............................... 错误～未定义书签。 3.2 实验设备及操作要求 ................. 错误～未定义书签。 3.2.1实验设备 ......................... 错误～未定义书签。 3.2.2 LY-1型冷冻干燥机操作要求 ........ 错误～未定义书签。 3.3 冷冻干燥的实验操作 ................. 错误～未定义书签。 3.3.1预冻操作 ......................... 错误～未定义书签。 3.3.2 冷冻干燥实验操作 ................. 错误～未定义书签。 (1)干燥机参数介绍: .................... 错误～未定义书签。 (2) 实验操作流程 ....................... 错误～未定义书签。 3.4 结果与讨论 ......................... 错误～未定义书签。 3.5 本章小结 ........................... 错误～未定义书签。 第四章 干粉菌种生产验证实验 ............... 错误～未定义书签。 4.1 引子 ............................... 错误～未定义书签。 4.2 实验设备及材料 ..................... 错误～未定义书签。 4.2.1 实验材料 ......................... 错误～未定义书签。 4.2.2实验设备 ......................... 错误～未定义书签。 4.3 验证实验的操作 ..................... 错误～未定义书签。 4.3.1 稀释菌液的制备 ................... 错误～未定义书签。 4.3.2 稀释菌液的生长对比实验 ........... 错误～未定义书签。 4.4 结果讨论 ........................................... 10 4.5 本章小结 ........................................... 11 致 谢 ..................................................... 12 参 考 文 献 ............................................... 13 第一章 绪 论 1.1豆腐乳生产的发展及现状 腐乳由我国首创，早于1500年前便有相关记载。千百年的腐乳生产历史上，我国劳动人民一直采用自然接种，自然霉制的方法进行制造。直至二十世纪四十年代，著名微生物专家方心芳教授在四川五通桥腐乳坯上分离出五通桥毛霉之后，国内各大厂家才陆续提取和使用纯菌种进行腐乳的发酵生产，生产技术才开始得以科学化的发展，通过选择优良菌种进行纯化培养，减少了杂菌污染的机会，既保证了产品的卫生质量又提高了产品的品质。 我国的腐乳生产主要有两大类:腌制型和发霉型。腌制型是不经发霉阶段而直接进行后期发酵，它主要利用辅料带入的微生物进行自然发酵和依靠所添加的辅料如红曲米、面糕曲、黄酒、米酒等进行生化变化，如唐场腐乳。发霉型是豆腐坯经过纯种培菌或自然培菌，经48~73小时或更长时间，待豆腐坯上长出白色网状菌丝，即可进行腌制和后期发酵。因使用菌种的不同分为毛霉型、根霉型和细菌型。毛霉的作用与根霉相似，不同的是根霉能耐受37?的高温，毛霉则不能。目前大多数厂家都采用毛霉和根霉进行腐乳的酿造，只有少数厂家采用细菌酿造，如黑龙江的克东腐乳厂。 近几年来我国的研究人员已经把对腐乳菌种的研究转向对后期发酵过程中生化反应的变化研究。腐乳生产的后发酵阶段是腐乳特有风味的形成和蛋白质降解的主要阶段。余若黔、陈维民等人研究表明,腐乳后发酵过程中可溶性蛋白及氨基酸的含量变化较直观地反映了腐乳的成熟情况,当可溶性蛋白含量达到ω=18%,20%(干基),氨基酸态氮达到ω>0.15%时腐乳已基本成熟。鲁绯、孙君社的研究中发现腐乳的后发酵过程中,随着发酵的进行腐乳的质构、酸度、以及化学成分都发生了相应的变化,且主要发生在后发酵40d内。腐乳坯体粘度迅速下降,坯体和汤料的酸度逐渐增加,50 d两者的酸度趋于一致。游离氨基酸含量随着发酵时间的延长而增加,汤料及坯体中淀粉酶活力较稳定,而蛋白质酶与脂肪酶活力变化较大。马勇、韩北忠和Frans M R等人研究了在腐乳生产过程中食盐对腐乳及脂肪水解的作用对总酸、游离氨基酸和游离脂肪酸的影响。研究表明,含盐量高(14%)的产品在后发酵过程中会增加其硬度和弹性而粘度则降低。含盐量低的产品蛋白质的水解快,游离氨基酸态氮增长较快,相反含盐量高的产品水解较慢,并提出在实际生产中采用8%或者稍低食盐含量进行试生产,这对腐乳的低盐化生产提供了依据。龚丽、郝淑闲等人对腐乳后发酵过程中大豆异黄酮含量及存在形式进行了研究。研究发现,在后发酵过程中异黄酮以4种形式存在且在不同时期含量也有所变化:大 豆糖苷呈上升趋势;染料木素糖含量甚微;大豆苷元呈上升、下降至平缓变化过程;染料木素总体呈上升变化。研究还发现,后发酵过程中异黄酮总量在30d和90d均可达到最大值。借对后发酵过程中化学变化和成分变化的研究可以了解到后发酵过程中的一些动态变化，为完善腐乳的酿造机理及生产中对腐乳成熟度的控制提供了一定的理论依据。 早在1980年代，美国的研究人员就开始对腐乳进行了研究。Lin从台湾坯子和稻草上分离到冻土毛霉以及华根霉。Wai研究了一种实验室制作腐乳的方法，接种前先在100?的热空气炉中烘15min，以便表面干燥，后来Hesseltine对Wai的做法进行了一些改变，在热空气处理前，将豆腐坯浸入酸性盐溶液中，这样可以防止腐败细菌的生长而不抑制毛霉的生长。美国还有一种涂抹腐乳，它是在的豆腐块生涂一薄层白色松软的豆酱，让它熟化。然后将豆酱涂层从熟化的豆腐块上刮去，并将豆腐块浸泡在水中，直至在水的作用下豆腐块的含盐量达到平衡。最后将豆腐块搅打成一种奶油状组织的产品。采用这种技术制作的产品中未添加任何添加剂，产品呈新颖的奶油状，耐水分离，具有低脂肪、低钠、基本不含胆固醇等有益健康的特点，并具有可口的味感。由于传统大豆产品具有豆腥味，一度不被西方国家居民接受，生产和消费都较少。近年来随大豆育种技术和食品生产水平的提高，无豆腥味大豆制品得到普遍发展，加上传统大豆制品也有食用方便，含有丰富的蛋白质和钙，并且其中也富含大豆中的特殊功能保健因子，因此传统大豆制品如豆腐、腐乳等也受到西方国家居民的广泛欢迎，消费量在逐年升高。 据传，早在公元1700年，(红)腐乳的制作技术即由鉴真和尚东渡时与豆腐制法一起传入了日本。由于当地气候、风土、饮食习惯及嗜好的客观因素，豆腐乳的制作很快受到了改良。在当时的如苯，豆腐乳并不是被作为低档品消费，而是在一部分上层社会中被作为滋养食品和佐餐佳肴。从1970年代开始，安田正昭研究组对传统冲绳豆腐乳的制法进行了研究，与1989年告一段落，而后向豆腐乳新技术的开发(如利用酶类，依靠生物反应器等新技术进行大规模腐乳生产)。后来安田小组筛选到一株豆腐蛋白凝乳酶活力高的芽孢杆菌并对其进行全面的酶学研究后，采用基因工程的方法获得了高产稳定的大量凝乳酶生产菌株，从而将腐乳的研究深入到了分子生物学的水平。日本腐乳的特点:咸味不大，略甜，组织柔滑，粘滑性适中。 1.2豆腐乳的分类 腐乳通常分为青方、红方、白方三大类。其中，臭豆腐属于“青方”;“大块”、“红辣”、“玫瑰”等酱腐乳属于“红方”;“甜辣”、“桂花”、“五香”等属于“白方”。白色腐乳在生产时不加红曲色素，使其保持本色;腐乳坯加红曲色素即位红腐乳;青色腐乳是指臭腐乳，又称青方，它是在腌制过程中加入了苦浆水、盐水、故呈豆青色。臭腐乳 的发酵过程比其他品种更丰富。特别是其中含有较多的丙氨酸和酯类物质，使人吃臭豆腐乳时感到特殊的甜味和酯香味。但是，由于这类腐乳发酵彻底。致使发酵后一部分蛋白质的硫氨基和氨基游离出来，产生明显的硫化氢臭味和氨臭味，使人远远就能嗅到一股臭腐乳特有的臭气味。腐乳品种中还有添加糟米的称为糟方，添加黄酒的称为醉方，以及添加芝麻、玫瑰、虾籽、香油的花色腐乳。江浙一带，如绍兴、宁波、上海、南京等地的腐乳以细腻柔绵、口味鲜美、味甜著称;而四川大邑县的唐场腐乳川味浓郁，以麻辣、香酥、细嫩无渣见长;另外四川成都、遂宁、眉山等地所产的白菜豆腐乳也很有特色，每块腐乳用白菜叶包裹，味道鲜辣适口;河南拓城的酥制腐乳则是醇香浓厚，美味可口。 1.3 豆腐乳的酿造机理及主要风味物质 在酿造培菌阶段，毛霉生长的变化大致分为孢子发芽生长阶段，菌丝生长旺盛阶段和菌丝产酶阶段。这三个阶段变化过程如表1-1所示 表1-1 毛霉生长变化过程 名称 培养最适温度/? 培养时间/h 生长变化过程 孢子开始发芽，品温自 然上升，14h能见白坯孢子发芽生长阶段 18~22 8~20 表面长出白茫茫的一批 短菌丝 此时进入生长旺盛期， 菌丝大量丛生，白色菌 丝已长满白坯表面，品菌丝生长旺盛阶段 28~30 24~32 温上升，产生大量发酵 热 毛霉进入成熟阶段，是 酶系分泌的高峰期 菌丝产酶阶段 26~28 40~48 在前期菌丝生长阶段，豆腐坯中的蛋白质已经开始被蛋白酶水解为水溶性蛋白(眎和胨)。经过前期培菌后，豆腐坯中的水溶性蛋白质由原来的3.61%达到55.54%。前期发酵的作用归纳起来有两点:一是使豆腐坯表面有一层菌膜包裹，成为腐乳形状。其次是在毛霉培养过程中分泌大量蛋白酶，以利于蛋白质水解为各种氨基酸。在蛋白质水解 过程中，需要多种酶系，主要有内肽酶和外肽酶的协同作用。经过前期培菌后，使豆腐坯的含水量由原来的73%下降到64%，毛坯形状变小，坯身变硬，蛋白质的水解作用已开始，毛坯中的氨基酸已达到0.08~0.14%。 后期发酵主要三酶系与微生物协同参与生化反应的过程。后期发酵包括毛坯腌制及添加料酒等辅料，让毛坯陈酿后熟。在后酵之前，将毛坯加盐腌制，腌制时间6~8天，毛坯变为咸坯，咸坯含盐量控制在16%以上。腌制的目的是:使毛坯内渗透盐分，析出水分，坯身收缩，坯体变硬。经腌制咸坯的水分由白坯的73%降为56%左右。咸坯入坛后加入以酒为主要的辅料。加酒的目的是:酒精能抑制微生物的生长繁殖，防止腐败;其次是酒精对蛋白酶有抑制作用，使蛋白酶作用缓慢，促进其他升华反应，生成腐乳的香气;酒精能合成酯类等芳香物质，形成腐乳独特的风味。微生物中的脂肪酶将腐乳坯中的脂肪水解为甘油及脂肪酸，甘油进一步被转化为各种有机酸。在腐乳的整个生产周期中所产生的氨基酸、酯类、有机酸等共同构成了腐乳的风味成分。 1.4 豆腐乳消费水平及前景 腐乳作为一种传统的大豆制品，是中国广大消费者喜爱的传统食品，国内外的研究也证明它是营养和健康的食品，随着人们消费意识的转变和健康意识的增强，传统大豆制品的市场空间会越来越大。目前我国年产量大致在30万吨左右。现行生产技术与生产方式已经对其发展产生了阻碍。传统大豆制品尤其是腐乳生产呼唤新的技术革命，如何将传统工艺同现代工艺相结合，从传统中升华，实现生产的规模化、工业化和安全化三企业能否抓住市场机遇的关键。若能解决腐乳生产周期长、保质期短、含盐量高、携带不方便、新品种少等诸多问题，其国际市场前景将十分广阔。 1.5豆腐乳的营养保健功能 腐乳作为一种大豆的发酵制品，它除了具有大豆的营养价值，如蛋白质优、富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，不含胆固醇(这对降低血清胆固醇，防止血管硬化、高血压和冠心病有一定作用)等外，它还具有更高的营养价值——含钙量更高、更易于消化吸收。在腐乳的加工过程中是以水为溶剂提取大豆蛋白，并以盐卤或石膏作为凝固剂，因此腐乳中的钙含量比大豆中更丰富。另外腐乳是经过微生物发酵,通过微生物所分泌的酶对蛋白质进行降解,使其转化成更有利于吸收的氨基酸和肽类,故氨基酸含量得到了很大程度上的提高。从营养角度来看,腐乳比其他发酵豆制品,如豆豉、豆瓣、豆酱、纳豆的蛋白质含量高,营养丰富,容易消化,老少皆宜。 此外腐乳不仅具有大豆本身含有的多种生理活性物质,而且由于微生物的发酵作用,产生了一些大豆没有的生理活性物质,提高了一些生理活性物质的保健功效,使得腐乳更具有营养和保健功能。腐乳中的活性成分主要有大豆多肽、大豆异黄酮和大豆皂苷。 大豆多肽比大豆分离蛋白更容易消化吸收。另外它还具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性;具有低抗原性,不会产生过敏反应;能增强运动员体能和肌肉,促进肌红细胞复原,帮助消除疲劳;能促进钙、铁、硒、锌等多种微量元素的吸收;促进微生物生长作用;促进脂肪分解、能量的代谢,具有预防肥胖及减肥作用;降低血清胆固醇的功能、降血压及抗氧化性等功能 。大豆异黄酮是多酚类混合物,是大豆生长中形成的一类 次生代谢产物。研究发现,大豆异黄酮具有抗癌作用 、预防骨质疏松、缓解更年期综合症、抗氧化、预防心血管疾病、降血糖、抗衰老等多种生理功能 ,它能有效地预防和抑制白血病,尤其对乳腺癌和前列腺癌有积极的预防和治疗作用。未发酵的大豆制品则主要以苷的形式存在,而发酵的食品主要以游离型异黄酮苷原形式存在。游离的苷原具有更广泛、更强烈的生物学活性,如抗菌活性、抗氧化活性、雌激素活性等,这些苷原可以被肌体肠道有效地吸收。大豆皂苷是存在于大豆及其制品中的活性成分,近年来关于大豆皂苷的生理活性研究日趋成为热点。研究发现大豆皂苷具有抗脂质氧化、降低过氧化脂质的生成、抗自由基的作用、增强免疫调节功能、抗血栓的作用、抗病毒的作用,此外大豆皂苷还具有抗衰老、防止动脉粥样硬化、抗石棉尘毒性等多种功能。 1.6 本论文的主要研究内容 本实验主要对豆腐乳毛霉菌种Z328进行菌种形态、菌种生产、以及冷冻干燥方法生产干粉菌种的方法进行研究，并对实验产品进行生产特性的研究。 a.菌种的扩大培养及其中的无菌操作; b.冷冻干燥机的使用及其操作; c.豆腐乳前期发酵的实验操作、其过程中环境条件的控制及菌群生长特性的观察; d.通过腐乳坯上毛霉生长情况的对比实验，确定菌种使用方法及浓度。 e.腐乳毛霉Z328的形态观察。 第二章 Z328的扩大培养及菌种的保藏 2.1 引子 由于纯菌种价格较高，且不利于大规模接种生产，因此在实际生产中大都采用菌种的扩大培养来获取生产发酵用菌。 2.2 实验材料及设备 2.2.1实验材料 麸皮，纯种Z328菌种，棉花(不脱脂)，脱脂棉，医用纱布，棉线绳，报纸，医用75%酒精，营养琼脂。 2.2.2 实验设备 酒精灯，接种针，1000ml三角瓶，试管，玻璃棒，1000ml烧杯,电炉，石棉网，镊子，电炉，白瓷盘，手提式不锈钢消毒器(型号YX28013,电源220V/2KW，容积18L，产品编号0327073)，SW—CJ—1D实用垂直新颖单人净化工作台，恒温培养箱。 2.3 Z328扩大培养的实验方法 2.3.1 麸皮培养基的制备 取干燥麸皮放于白瓷盘中，加水和匀，加水程度以手捏后成团放开则麸皮散开为准(加水过多则湿度过高，不利于气生菌丝生长;加水过少则无法满足菌种繁衍生长需求)。之后放入三角瓶中，铺满瓶底约1~1.5cm厚(注意尽量不要使麸皮粘在瓶壁上)。在三角瓶上加带纱布包裹的棉塞(此处使用非脱脂棉)，用报纸将瓶口封上，使用棉线绳扎成一个活结。 2.3.2 三角瓶培养基的灭菌 使用手提式不锈钢蒸汽消毒器对三角瓶(连同麸皮培养基)进行高压湿热灭菌 1.打开锅盖，取出内胆，望锅底部添加水，加至能覆盖住锅底标尺为准。 2.将扎好口的三角瓶放入锅胆内，和锅胆一起放进锅内，之后将锅盖盖上，把锅盖四周的旋钮全部放到锅盖上方，然后两边对称一一旋紧，全部旋好之后在检查一遍。 3.打开锅盖上的排气阀，接通电源，进行加热，待葱排气阀排出粗壮的水汽之后继续加热10min(为了排出锅内空气中的杂菌)。 4.压下排气阀，使压力升至0.1~0.15Mpa(温度121~125?)，当温度及压力超出此范围时，拔下灭菌锅电源;低于此范围时再插上电源(在此过程中始终要在锅旁检视，防止锅内压力过大，导致安全阀跳起，甚至爆炸)。使温度和压力维持在此范围内30min。 5.拔下电源，使压力表上温度自然降为0Mpa，之后拔下排气阀放气，打开锅盖取出锅内的三角瓶。 2.3.3 三角瓶麸皮培养基的接种 此操作在高压湿热灭菌后的三角瓶冷却至室温之后进行。 1.将SW—CJ—1D实用垂直新颖单人净化工作台接通电源，按下通风按钮，开启紫外灯，10min之后关闭通风设施，将备用的接种针，酒精灯，打火机，试管Z328菌种，待接种的三角瓶一起放入箱体内，预灭菌10min以上。 2.在接种前先使用吸收液洗手，之后使用沾满医用酒精的脱脂棉球擦拭双手。 3.关闭紫外灯并开无菌操作箱的玻璃门，点燃酒精灯，将接种针烧红，杆部也要烧到，但是要避免烧到根部的塑胶把手部位，之后用右手小拇指夹住试管Z328菌种的棉塞，将接种针放入其中先行降温。 4.试管菌种的试管口部位在酒精灯火焰上旋转火烤灭菌，注意旋转均匀，防止炸口。 5.使用接种针从试管内挑出少许菌丝体，最好带出一些琼脂培养基。并迅速将试管口塞上。 6.同样使用右手小拇指将三角瓶的棉塞拔出，在酒精灯火焰上对三角瓶口进行火烤灭菌，注意旋转均匀防止炸口。 7.将接种针头部迅速放入三角瓶内底部的麸皮培养基上，并进行轻微的搅拌。之后 马上将三角瓶口用棉塞塞上，用报纸封上，使用棉线绳扎好口。 8.重复3~7的操作直至将剩余三角瓶接种完。 9.接种完毕后，清洗接种针，打开通风设施，通风5min之后关闭电源，合上玻璃 门。 注意事项: 1.在接种过程中接种针不要接触到除菌种及培养基外的任何物品。 2.挑出的菌丝体如果由于粘连不稳，掉到操作台上，或接触到其他任何物品，即应当弃用。 3.在操作中无论是试管的棉塞或是三角瓶的棉塞，一律应当使用右手小拇指夹出，并保持夹在小拇指中，而不应该放于实验台。 4.在向三角瓶麸皮培养基上接种时，注意不要使接种针带出麸皮，并使之粘于瓶壁上。 2.3.4 三角瓶内菌种的培养 1.将恒温培养箱的温度调至22?，把接种好的三角瓶放入培养箱内。 2.24小时之后打开培养箱，取出三角瓶，发现其中部分位置已经有毛霉生长成一团白色的菌球，取出三角瓶，将培养基进行震荡，以使其中的孢子分散到整个培养基内。之后再将三角瓶放入恒温培养箱。并将温度调至26?。 3.继续培养36~48小时之后，观察到三角瓶内的培养基已经基本长成饼状，菌丝体已将麸皮包裹起来，并且在培养基内部也布满了营养菌丝。此时取出三角瓶，用手拍击三角瓶的底部，使麸皮饼脱离三角瓶底并斜靠于三角瓶壁上(因为毛霉是好氧型真菌，为了培养基底部的毛霉也正常生长，必须使其也接触到空气)。将三角瓶放倒，置于恒温培养箱内继续培养。 4.再培养24~36小时后，麸皮培养基已经完全成为一个布满毛霉菌丝体的饼状物，其表面的菌丝已经长到白色甚至微黄色。 2.4 菌种保藏的试验方法 2.4.1 制备琼脂溶液 先把5支试管及1000ml烧杯洗涤干净，备用。称取20g营养琼脂，放入1000ml烧杯中，加水至1000ml刻度。将电炉打开，上面放好石棉网，把烧杯放到上面进行加热，在加热的过程中，要不断使用玻璃棒搅拌，防止液体沸腾。待琼脂全部溶化之后， 放置片刻使烧杯稍作冷却，但不要使琼脂凝固，趁热将琼脂液倒入试管中，并迅速塞上棉塞，用报纸包好，扎口。 2.4.2 试管及琼脂溶液的灭菌 将包扎好的试管放入一个空的烧杯中，使其直立，之后将烧杯和试管一起放入灭菌锅锅胆内，在0.1~0.15Mpa(121~125?)下灭菌30min左右 2.4.3 斜面的制备 灭菌之后的试管从灭菌锅内取出，趁热将试管一一靠放于放在桌面上的海绵等固定物体上，高度合适，使形成的斜面上端达到试管的1/2至2/3处。冷却之后即形成斜面培养基。 2.4.4 斜面培养基的接种及培养 在无菌操作台上进行接种，操作方法与2.3.3的基本一致，不同的是在挑取菌体时选择生长旺盛菌丝颜色正常的来挑取使用。接种完之后，用报纸封口包扎好。 包扎好的试管放入26?的恒温培养箱内进行培养，菌体生长越旺盛越好。培养2~3天之后，取出试管，放于4?的冰箱冷藏。 2.5 结果与讨论 本次实验的扩大培养采用类似毛霉在豆腐坯上进行前期发酵的实验条件(包括温度，各个阶段的培养时间)，操作过程中较为严格地执行了无菌条件，生长出来的菌种菌丝充满培养基，无杂菌生长造成的菌斑，菌体气味正常。 在菌种进行冷冻干燥前的预冻过程中由于不可抗拒的原因造成冰柜断电，导致菌种发臭，产生大量的杂菌菌斑，因此丢弃了第一次培养出的菌种。并再次进行了菌种的扩大培养。所幸在操作过程中了菌种的保藏工作做的比较好，还有备用菌种可以使用，因此并未对实验结果产生太大影响。通过这次教训，认识到了微生物试验必须是严谨的，有前瞻性的，在实验过程中一定要考虑到所有可能发生的情况，并进行预先的防备。 2.6 本章小结 微生物实验一定注意无菌操作的性，对于食品行业而言，轻则造成菌种的破坏，重则造成致病菌的感染出现安全隐患。因此实验操作及设计一定要严谨，要用科学的态度来进行实验并应对实际操作中出现的问题。 需要全文请联系QQ869260800 菌种在豆腐坯上的生长状况与时间的关系如下所示: 生长一天后1/100长毛均匀，豆腐坯连于一体，毛长约1.5cm，腐乳菌丝体布满豆腐坯表面;1/200生长类似于1/100只是豆腐坯未连于一体;1/400长毛不均与，周边菌丝长约1cm,顶部短，豆腐坯相互独立;1/800长毛甚弱，毛长约0.2cm。 生长2天后1/100长毛均匀，毛长2~2.5cm，豆腐坯粘连，表面略有发绿;1/200毛长2~2.5cm左右，豆腐坯粘连，部分表面有发绿;1/400毛长1.5~2cm，豆腐坯粘连，表面发绿;1/800毛长1cm，豆腐坯粘连，表面稍有发绿。 生长3天半后，1/100长毛旺盛，毛长3cm，毛色泛黄，毛霉形成的皮膜呈黄褐色;1/200毛长3cm，毛色泛黄，皮膜黄褐色;1/400毛体旺盛，豆腐坯完全粘连，皮膜呈黄褐色，略有泛青;1/800毛长约2cm，生长旺盛，毛色泛黄，皮膜呈青褐色。 4.4 结果讨论 本次实验表明，1/800的稀释浓度完全可以适合工业生产进行腐乳发酵，实验菌种在豆腐坯上的生产实验完全正常，菌种纯度较高，无杂菌生长产生的菌斑。 4.5 本章小结 本次实验的干粉菌种干燥彻底，可以长时间储藏，冻干之后仍有较高活性，可以应用于工业化生产。 注意: 1.在稀释菌液的配制过程中，例如1/100的稀释菌液并非是使用1g的菌种兑上100g的无菌水，而是1g菌种兑上99g的水。 2.生产验证时，如果使用的是同一个喷嘴来喷不同浓度的菌液，要从低浓度到高浓度来喷洒。高浓度到低浓度则容易造成实际喷到豆腐坯上的菌液浓度高于预定的浓度，对对比实验造成影响。 致 谢 本论文是在李宏梁老师的精心指导下完成的，在三个多月实验及论文撰写过程中，李老师不厌其烦多次指正实验中出现的问题，无论是从学术上还是从科学态度上都给了我极大的指导。李老师严谨的科学态度敏锐深邃的洞察力，务实的研究态度，高度的责任心和敬业精神，虚怀若谷的胸襟和平易近人的作风，特别是献身科学的高贵品质，使我受益颇深，并将鞭策和激励我在以后的工作和学习中，克服困难，不断进取。在此，谨向李老师致以最崇高的敬意的衷心的感谢。 在实验过程中还受到了杨大庆和卢亚婷老师的鼎力支持，在此表示真挚的谢意。 同时，感谢我的同学们，谢谢你们在实验过程中的支持，有了你们我的实验才得以顺利完成。 最后，再次感谢所有关心和支持我的广大老师，朋友和同学～ 谢谢诸位～ 郭远洋 2007-6-12 参 考 文 献 [1] 周德庆.微生物学教程[M].北京:高等教育出版社，2002 [2] 钱存柔，黄仪秀等.微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社，1999 [3] 高福成，王海欧等.现代食品工程高新技术[M].北京:中国轻工业出版社，2006 [4] 王瑞芝.中国腐乳酿造[M].北京:中国轻工业出版社，1998 [5] 李宏梁.白腐乳生产新工艺的研究[D].无锡轻工业学院硕士学位论文，1991 [6] 田三德等.大豆腐乳加工工艺的研究[J].食品科学，2004(4):203~206 [7] 孟祥苓，李兰凤.豆腐乳古今谈[J].江苏调味副食品，2001，30~31 中国调味品，2005,(12)，11~13[8] 程丽娟，赵树欣.豆腐乳中的功能性成分[J]. 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