【doc】耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌选择培养基的研究

【doc】耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌选择培养基的研究 耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌选择培养 基的研究 中华医学检验杂志1996年3月第19卷第2期 7j,7b?临床微生物学? 耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球 菌选择培养基的研究/<; Ts' 卜摘要目的为防止耐药菌株流行,及时,准确地检出耐甲氧苯青霉索金黄色葡萄球菌 (MRSA1,给临床提供可靠的治疗依据.配制MRSA选择性培养基,苯唑青霉紊(oxacdlin)浓 度分别为2,4,@g/ml,NaC1浓度分别为I,6,8,并分别测试这些培养基对MRSA的敏感性和 特异性及分解甘露醇的情况.结果含2~g/mloxacillin的耐甲氧苯青霉索金黄色葡萄球菌选择培养 基(MRSACM)的特异性较差,可低至76.3;舍6~g/ml其敏感性较差,可低至69.4;而含4,~g/m[ 其敏感性和特异性均较好.Nf含量为6其培养基的特异性叉优于含量4的培养基结论使用 含4pg/m[oxacdlin,6NaC1的MRSACM的敏感性为100t特异性?99t且不影响甘露醇产酸 结果.此培养基配法简便,不需特殊设备t便于推广 关键词苎!!曼兰苎皇兰苎苎!堕坠兰 StudyofSelectiveculturemediumformethiclllumresistancesta 【phylocoeeusaureusSuJianrongt埘4 JipingXuShuzhenBeL3gFrlendsht#H.s.B~jmg[OOO5Q AbstractOhjeCtlveTofindoutaculturemediumthatMRSAstrainscanbeisolatedexactlyan d idenfifiedintime.Methods165testingstrainsofStaphy10c0ccus(85MRsAStrainsand80M ASSA str~ias)werein~u[attd? MRSAselectivemediumc:ompo~ed0{variousconcentration0{oxacillin(2, 4,6t~g/mt)andNaC1(4,6,8),thesensitivityandspecificity{orMRSAWerestudied.Resulls TheminimumspecificityofMRSAselectivemediumcomposingof2#g/mloxacillinr? 76.3.The minimumsensitivityofthemediumcontaining6vgJmloxaci|linwas69.4.Thesensitivityand speci— ficity.{themediumcomposing.f4#g/m[oxacillinwere100and? 99respectively.Conclusions Theculturemediumcontains4pg/m[oxaeillum,and6NaCtforMRSAisoiloptimummedium,the sensitivityandspecificity&re100and?99respectively KeywordsCuhuremediaStaphylococcusaureusPenicillinresistance 耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRsA) 是目前医院内感染的重要病原菌,其感染几乎 遍及国内外各级医院.更严重的是,这种细菌 的耐药性逐年升高.并且感染死亡率也逐年 一 升高,即使在万古霉素治疗下.严重感染的死亡 虹仍可达10,有时高达50这种细菌耐 受鑫善种抗菌药物,目前某些发达国家已将MR— SA烈性传染病同样对待].由于MRSA 作者毡位:100050北京苴谊医院检验科 菌落内细菌分敏感和耐药两个亚群,典型MR— SA为不均一耐药,且许多临床标本为混合菌 生长,故使用常规培养基分离MRSA可能漏 检.为了防止耐药株的流行+及时,准确地检出 MRSA,为临床提供可靠的治疗依据,我们研究 出MRSA高选择性培养基的最佳条件. 和方法 一 , 材料 1.菌株:(1)菌株:金黄色葡萄球酋ATCC 25923,29213}金黄色葡萄球菌(MIC2~xg,'mD米自澳 大亚皇家病理学院;金黄鱼葡萄球菌(MIC=4 gm1)采自澳大利jlE皇家痛匪学院(2)实验菌株(自 临床实验室分离,经VITEK—AMS系统及常规洼鉴 定J:金黄色萄萄球苗165椽凝固酶阴性葡萄球菌 (CNS):50株(其中表皮葡萄球菌40株:腐生葡萄球菌 8株}溶血葡萄球菌,木糖葡萄球菌各1株,. 2MH培养基:购自Oxoid公司;甘露醇单糖自 靓. 3.抗生索:o骱iliin标准品,多牯菌素B标准品均 购自卫生部生物制品检定所. 4耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌选择培养基 (MRSACM)自制. 二,方法 1.用琼脂稀释弦测定葡萄球菌对oxaci[1in的 Nil(;值:根据美国国家临床实验室标准委员会(NC CLS)标准.以金黄色葡萄球菌ATCC29213为质控菌 株进行测定. 2.试驻MRSACM对金黄色葡萄球菌的敏感性和 特异性:敏感性:指MRSA在MRSACM生长百分率即 MRSA生长株数,'MRSA株数.峙异性:指对甲氧苯 青霉素敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)在MRSACM 上不生长百分率即:1一MSSA生长株数/MSSA株 数.用ATCC25923(金黄色葡萄球菌),ATCC29215 c金黄色葡萄球菌)和澳太利亚皇家病理学院提供的 MIC=2#g/ml金黄色葡萄球菌作为MSSA质控菌株. 用澳大利亚皇家病理学院提供的MIC=4~g/ml金黄 色葡萄球菌作为MRSA质控菌株.血平板培养基作为 生长对照.(1)配制MRSACM:M—H培养基补加1甘 露醇,酚红指示剂(,6,8)NaCI(2.4,5#g./m1) 表1MRSA(MSSA)在MRSACM上 24h生长株数 ChinJMedlaBSci,March1996rVo[19,No.2 oxacillin,多粘菌索B.(2)转种金黄色葡萄球菌(包括 ,8小时. MRSA,MSSA)于MH肉汤中35C孵育6 (3)接种M=H肉汤培养物(10CFU/ml,10'CFU/ml, 10CFU/m1)于台不同浓度NaCI和oxacillin和MR— SACM上(表1),35c孵育24小时(按NCCLS标准) 3.}则定葡萄球菌分解甘露醇情况.并在台4#g,/ml oxaciliin,6NaCI的MRSACM上接种10CFU/mI的 葡萄球菌.观察甘露醇产酸(培养基变黄)结果. 4.接种临床常见的其他细菌(不包括葡萄球菌)于 MRSACM上.35C孵育24小时.观察生长情况这些 细菌包括:放线菌,星形奴卡菌,类志贺邻单胞菌,嗜水 气单胞菌,白色念球菌,宋内志贺菌,福氏志贺菌,鼠伤 寒沙门菌,大肠埃希菌,产气肠杆菌,胡沟肠杆菌,聚团 多源菌,肺炎克雷伯苗,臭鼻克雷伯苗,产酸克雷伯菌, 奇异变形杆菌,普通变形杆菌,枸橼酸弗劳地菌,迟缓 爱德华苗,粘质沙雷菌,小肠结肠炎耶尔森菌,醋酸钙 不动杆菌,绿脓假单胞菌,斯氏假单胞菌,浅黄微球菌, 肺炎链球苗,A群链球菌,B群链球菌,粪肠球菌,屎腑 球菌等30种细菌. 结果 1.MIC测定结果为:MIC?4~g/ml金黄色 葡萄球菌即MRSA85株;MIC?2~g/'ml金黄 色葡萄球菌即MSSA80株;MIC?4>g/ml凝固 酶阴性葡萄球菌5o株 2.金黄色葡萄球菌在MRSACM上培养 24小时生长情况见表l(对照全部生长) 3.MRSACM对MRSA的敏感性和特异 性见表2. 表2不同oxacillin和NaCI浓度的MRSACM 对MRSA的敏感性(特异性). 端NaC】含量() 96.5(1O0) 90.6(100) 69.4(100) 98.8(92.5) 96.5(1O0 8O(1O 1oo(91.爱) 1.6(1~3o; 1o988(989) 94.1(1oo) 84.7(1oo) 1o'1oo(80) 100(99) 97.6(100) 10s100(76.3) 100(975】 976(99) 97.6(1oo) 92.9(100) 80(1oo) 100(85) 1O0(i00) 94.1(1O0) i00(82.5) 100(99) 95.3(100) 生长:拮在MRSACM上旱融台或百雾状生长,生 .牛::篡警4,KMSSAB法药物敏感试验结果为中介.度(抑80其生长株数;总株敦株 括号内数字为其生长株数……………,…'-[,. 扣华学墙验志l996年3月第19卷舅2期 表3甘露醇_产酸结果(株数)比较 一24h(一):折细莆在24h内廿解甘露醇}迟缓(}j:指细菌,十24,72h丹解甘露醇l 【):指细菌在太于79h仍末分解甘露 醇;24k术生最:指细菌在24k求生长 菌环直径?J0ram为耐药;l1,12mm为中介 度;13ro_m为敏感)的5株金黄色葡萄球菌中:2 株抑菌王f:直径为llmm,其中1株MIC为2~Lg/ m1.1株为4,ug/m[,在MRSACM上均不生长,3 株抑菌环直径为J2ram,其中2株MIC为2pg/ mt,1株M为4~g/m[在MRSACM上生长 5.在含4~Lg/mloxacillin,6NaCI的MR— SACM及甘露醇发酵培养基(单糖管)上甘露 醇分解情况见表3 6.临床常见细菌t不包括葡萄球菌)在 MRSACM上24小时生长情况:生长细菌:白 色念珠菌,阴v勾肠杆菌,醋酸钙不动杆菌,浅黄 微球菌,粪肠球菌.不生长细菌:除上述细菌均 未生长. 讨论 1.由表J.2可见含2,ug/m[oxacillin的 MRSACM检测MRSA时.特异性较差}在接 种量为J0;CFU/m[,4NaCI的MRSACM上 特异性可低至76.3+这是由于oxaeiLlin浓度 过低,不能抑制MRSA生长.用含6~g/ml oxacilIin的MRSACM检测MRSA时,特异性 好而敏感性较差,可低于69.4这是由于高 浓度oxaciHin使MIC在6,ug/m[的MRSA不能 在培养基上生长用含4pg,"mloxacillln的MR? SACM检测MRSA时,敏感性和特异性均较 好,其中NaCI含量为6%的MRSACM特异 性,又优于4的MRSACM这是由于高浓度 (6)NaCI较低浓度(40/,)NaCI对MSSA的抑 制作用更强. 2.5株K—H法药物敏感试验结果为中介度 (1J,J2mm)的金黄色葡萄球菌.相应的MIC 为2~g/ml(敏感)或4~Lg,"ml(耐药)时.MIC为 4,ug/ml的金黄色葡萄球菌在MRSACM上生 长(2株),而MIC为2~g/'ml者不生长(3株) 3.由表3可见,金黄色葡萄球菌中有1株 甘露醇迟缓阳性凝固酶阴性葡萄球菌中有2 株为24小时分解甘露醇],其中J株为木糖葡 萄球菌.1株为溶血葡萄球菌尽管这2株细菌 在临床并不常见,但仍可说明只用甘露醇鉴别 金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌会出现 错误需用血浆凝固酶试验一及耐热DNA酶 试验作最后定论由表3还可见:凝固酶阴性葡 萄球菌中有3株出现24小时未生长(生长对照 生长),而延长孵育时间生长,金黄色葡萄球菌 全部生长.说明高浓度NaC[对凝固酶阴性葡 萄球菌生长的抑制作用大于金黄色葡萄球菌- 故若用本培养基分离MRCNS+最好延长时间 (不属本文研究内容) 4.有些临床常见菌可在MRSACM上生 长+存在问题可用下列方法解决:(1)在MR— SACM上生长的细菌的菌落特点与MRSA不 同(除浅黄微球菌j,故不会固将MRSA忽略而 漏检(2)革兰染色显示菌体形态的特征不同. 可将这些细菌与MRSA区别. 综上所述,接种菌量?10'CFU/ml时,使 用含4,~g/'mloxac[Ilin,6NaCI的耐甲氧苯青 霉素金黄色葡萄球菌选择培养基敏感性为 Jo0,特异性?99+且不影响甘露醇产酸结 果.我们介绍的培养基配法简便一不需特殊设 备,便于推广. 参考文献 l李忡兴.部家齐.李家宏.诊断细菌学香港;黄河文化出 短I1;93l81. 2娄永新一,蛊良实用临床细菌学检驻与进展一天滓科技 翻译出版公司.19鲫5559 3TaylorPC,5ch.enknFD,SherrisJC,etafDeter~ tionminimumbacteriaLconceatrations0ox~iHinfor Staphy[ococcus~ureus:iaflueaceandsigni~moftechnb cat[actorsAnrimicrobAgentsChemothPr.J983t23:142 4ChambersHF.Methiciilin—res~tantStaphylococciChnMi— iroRe.1988,1=173. 5KtoosWE,l+ambeDW.ManualofCtinlcatMicrobiology. 5thed.WashingtonDC:Ameri~nSocietyforMicrob[olo- ChinJM甜I_abSci,March1996,Vol19,No.2 gy.1991.22—237 SWangerA.MooreI)G.LaroccoM.Use.J~atexagglutina fiottIQrrepididentit"icationofmethicillin—resistantStaphy一 】0c0c…aU/-eus(MRSA)~coveredfromsel~ttvemedia. In.AbstT.89thAnnu.Meet.Am.Soc.Microbio[.W拙h_ in,tonDC:AmericaaSocietyforMicrobiology,1989C一 147:418. (嘘稿:1999l215修回:1995l2—21) (本文编辑:毛家都) 一 株对37种抗菌药物敏感的侵袭性大肠杆菌 王秀英陈添弥 1990--1994年,我们在对西藏600余倒腹泻病患 者致病菌的调查研究中,从大量标本中分离筛选出L 株对多种抗菌药物敏感的野生型侵袭性大肠杆菌 (EIEC).现将结果如下: 一 ,材料与方法 1菌株来源:该菌株自一名藏族年轻女性患昔粪 便中分离.患者日食用羊肉食品,引起愎痛,愎胀,发 热,里急后重,日便5,6次,于1990年7月16日到拉 萨市人民医院就谚.就谤前未曾甩药.粪便常规检查 外观呈脓血样,镜检可见大量白细胞和少量红细胞;粪 便培养.分离出该菌.菌株编号90240. 2.实验材料:E1EC诊断血清(11种)购自兰卅I生 物制品研究所;实验动物琦自华西医科大学实验动物 中心;聚合酶链反应(PCR)诊断试剂盒购自军事医学 科学院微生物流行病研究所;质控菌株(ATCC-25922) 购自四川省卫生干部管理学院{药敏纸片购自中国药 品生物制品检定所(WHO推荐的标准药敏纸片),判断 标准参照卫生部抗菌药物细菌耐药性监测中心"抗菌 药物药敏试验判断标准"进行 二,结果 l_菌株鉴定:90240椿在ss和麦康凯培基中生长 呈粉红色菌落,为革兰阴性杆菌系统生化反应符台大 晒艾希菌属.应用侵袭质粒抗原H(iPaH)基因同源区 两个各20碱基序列作为引物,通过PCR扩增出一个 车项研究课题为^五全军医药卫生青年基金资助 作者单位:6100盯成都军区卫生防症队高原医学研究室 (王秀英);军事医学科学院生物研究所(陈添弥) 498bpH基因片段,检测90240栋,结果可见清晰特异 的498bp单一扩增区带,表明PCR检测结果为阳性. 同时采用豚鼠角膜试验(Sereny法)进行参比,结果该 株在24小时内对啄鼠角膜有很强的侵袭力.血清学试 验结果:90240株与志贺菌血清不发生凝集,与侵袭性 大肠诊断血清O28ac;K73呈强凝集反应,固此确定 90240株为侵袭性大肠杆菌O28acK?3血清型. 2.药敏试验采用K—B药敏纸片法对90240株进 行药敏检测,确定90240株对青霉索类,头孢菌素类, 氨基糖甙类,四环紊类,大环内脂类,多糖类,磺胺类, 呋喃类,喹诺酮类等37种抗菌药物敏感(具体37种抗 生素略). 三,讨论 侵袭性大晒杆菌与其他致病菌一样.菌株的耐药 性普遍存在,而且日趋严重.我国分离的菌株大多数已 产生了不同程度的耐药性,其中抗四环紊株几乎达到 100.本研究报道的90240号菌株,对包括四环素在 内的37种抗菌药物均敏感是很罕见的,分析认为该菌 株可能是西藏高原边远地区由动物携带感染人类,成 为原始流行株,该菌株尚待进行基因质粒圉谱分析研 究. 目前,在基因工程口服活痘苗的研制中,首要的难 题是作为抗原载体菌株的耐药性同题,一般很难选到 不耐药菌株发现这种对37种抗菌药物敏感的野生型 侵袭性大肠杆菌,对研究细菌产生耐药机理和活菌疫 苗的研制.都有重要的价值和意义. (收稿:1995一O5—31修回:1995-0904) (本文编辑:毛家都)