分子生物学技术产前诊断18三体综合征的研究进展

分子生物学技术产前诊断18三体综合征的研究进展 分子生物学技术产前诊断18三体综合征的 研究进展 国外医学计划生育/生殖健康分册2007年26卷第6期 Med,2o05,50(9):675-691. [9]RembouskosG,CiceroS,LongoD,eta1.Singleumbilicalarteryat ll一14weeks'gestation:rel~iontochromosomaldefects[J].Ultrasound ObstetGynecol,2003,22(6):567—570. [10]WallerK,ChaithongwongwatthansS,YamasmitW,eta1.Chromoso— malabnormalitiesamong246fetuseswithpleuraleffusionsdetected onprenatalultrasoundexamination:factorsassociatedwithanin— creasedriskofaneuploidy[J].GenetMed,2005,7(6):417—421. [11]RosatiP,GuarigliaL.Earlytransvaginalfetalorbitalmeasurements: ascreeningtoolforaneuploidy?[J].JUltrasoundMed,2003,22(11): 1201-1205. [12]PappC,BekeA,BanZ.Prenataldiagnosisoftrisomy13:analysisof 28cascs[J].JUltrasoundMed,2006,25(4):429-435. 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UltrasoundObstetGynecol,2006,27(2):151-155 分子生物学技术产前诊断18三体综合征的研究进展 天津医科大学总医院妇产科(300052)李晓洲综述张颖审校 摘要18三体综合征是一种常见的染色体三体征,其产前诊断的传统是染色体 核型分析,但该方法操作 复杂,实验周期长,不能出微小的染色体异常.随着分子生物学技术的发展,许 多新技术如比较基因组杂交 (comparativegenomichybridization,CGH),定量荧光PcR(QuantitativeFluorescence— PCR,QF.PCR)等用于18三体的产 前诊断.这些新技术敏感性高,特异性强,操作简便,实验周期短,适合18三体的产前 诊断. 关键词18三体综合征产前诊断定量荧光PCR比较基因组杂交荧光原位杂交 l8三体综合征也称Edwards综合征,是一种常 见染色体三体征,其发病率仅次于先天愚型.目前, 对于l8三体综合征产前诊断的方法主要是通过羊 膜腔穿刺,绒毛活检或脐静脉穿刺以获取胎儿细胞 进行染色体核型分析.该方法虽然是产前诊断的金 标准,但需要2周细胞培养,既不利于及时诊断,也 会对被检测者造成巨大的心理压力_1].随着分子生 物学技术的发展,许多学者将分子生物学技术应用 于l8三体综合征的产前诊断,弥补了传统染色体 核型分析的不足,本文对这一研究现状进行综述. 目前,用于产前诊断的分子生物学技术主要是 在原位杂交(insituhybridization,ISH)技术与聚合酶 链反应(polymerasechainreaction,PCR)基础上发展 起来的. 一 ,ISH 1.荧光原位杂交fluorescenceinsituhybridization, FISH)FISH是以荧光标记单链核苷酸为探针,与 收稿日期:2007—04—05修回日期:2007—09—22 待测样本的单链核苷酸进行原位杂交,形成的杂交 双链核酸在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和 计数[.用于l8三体综合征的诊断时,二倍体细胞 核可见2个荧光信号,而染色体三体的细胞核将显 示3个荧光信号_1]. Prabhakara等嘲对1例生长发育迟缓伴智力障 碍,多发畸形的患者及其母亲第二胎妊娠lO周时的 绒毛样本进行染色体核型分析,见一18p+染色体. 应用l8号染色体涂染探针,着丝粒探针(D18Z1)和 末端着丝粒探针(pcpl8p,pcpl8q)进行FISH,发现 二者都是l8号染色体部分三体,核型均为46,XY, +18,der[18;inv(18)?ql0;qlO]. FISH将荧光信号的高灵敏度,安全性,直观性 和ISH的高准确性结合起来.探针可以长期保存, 不但能显示中期分裂相,还能显示间期核,并且可以 判断异常染色体的来源.但是FISH技术每次只能 检测出1个或几个染色体异常,而且只能检测出已 知的染色体异常,不能一次性分析所有染色体,且技 ? 342? 术复杂,操作烦琐[1-2,4].因此,FISH技术不能完全替 代染色体核型分析,而应与其相结合对染色体病进 行产前诊断. 2.比较基因组杂交(comparativegenomiehybridiza. tion,CGH)CGH于1992年由Kallioniemi首先创 建,其基本原理是用不同的荧光染料标记等量的正 常基因组DNA和待测细胞DNA,再和正常人的中 期染色体杂交[引.若患者染色体某一片段存在缺失, 则正常对照DNA优先与中期染色体杂交;若患者 染色体某一片段存在重复,则其DNA优先与中期 染色体杂交;若患者染色体是平衡的,即不存在缺 失和重复,患者DNA和正常对照DNA等量与中期 染色体杂交.杂交形成的图像再经计算机软件处 理,对两种颜色荧光进行定量分析,通过检测染色 体上两种荧光信号的相对强度比率,了解待测组织 DNA拷贝数的改变,同时在染色体上定位,以确定 患者的染色体核型. 但是,CGH技术操作复杂,成本较高.在此基础 上,以基因芯片代替中期染色体而发展起来的点阵 列-比较基因组杂交(array.basedCGH,A—CGH)及微 阵列.比较基因组杂交(mieroarray—CGH,M—CGH)技 术以其自动化,高通量,高敏感性的特点很大程度 上弥补了经典CGH方法的不足,从而得到了广泛应 用[.Miura等[]抽取13例超声发现异常的胎儿羊 水,提取胎儿DNA进行MCGH,成功诊断其中12 例样本,包括2例18三体,其结果被随后的染色体 核型分析证实,1例平衡异位漏诊. 与传统细胞遗传分析技术不同,CGH无需体外 细胞培养,待测细胞核型产生于正常中期染色体; 与FISH相比,克服了需制备染色体特异区域探针 且仅能检测个别染色体或部分位点的局限性,是一 种全方位检测法,一次实验即可检测出待测标本整 个基因组DNA拷贝数增减[8].但是CGH技术精度 低,只能检测出较大片段的异常. 3.光谱核型分析技术(spectralkaryotype,SKY) SKY技术通过5种荧光素的不同组合,使每条染色 体都能产生不同的光谱,进而通过计算机处理,赋 予24条染色体不同的颜色,有效地进行诊断[7].该 技术在不需要知道染色体异常的情况下可以在一 次实验里对24条染色体按照颜色不同进行同步分 析,而且能对许多复杂的染色体重排做出快速诊 断;对于不明来源的标记染色体也能够根据其颜色 快速确定其来源. Yuval等[.]对5例经染色体核型分析发现1条 国外医学计划生育/生殖健康分册2OO7年26卷第6期 多余染色体的嵌合的羊水样本分别进行FISH和 SKY,前者仅诊断出其中1例,而SKY明确其中3例 多余染色体的来源,包括1例47,XX,+der(18)[53/ 46,XX[35].SKY克服了传统染色体核型分析技术 的缺点和FISH的局限,极大提高了诊断的精确度 和效率.但是SKY技术对于有丝分裂中期染色体标 本制备的要求十分高,良好的染色体扩散形态及较 少细胞质的有丝分裂中期标本可以减少背景噪声和 探针非特异性结合,因此对不同类型细胞的胃蛋白 酶消化时间和杂交时间的良好把握能够最大限度地 提高杂交的深度[7-s]. 二,PCR 1.定量荧光PCR(QuantitativeFluorescence.PCR, QF—PCR)QF—PCR的基本原理[4]是DNA样本通过 荧光引物进行PCR扩增,因此荧光信号变量与扩增 产物变量成正比,通过足够灵敏的自动化仪器实现 对荧光的采集和分析,通过基因扫描软件对DNA序 列相应的重复长度进行峰面积定量,实现对原始模 板量的定量.现在,许多学者应用QF.PCR扩增短串 连重复序列(shorttandemrepeats,STR)进行18三体 的产前诊断,杂合子显示定量之比为1:1:1的3个 峰;半杂合子显示2个峰,定量之比为2:1;纯合子显 示1个峰,其定量值为正常对照的3倍. Caroline等[]选取13,18,21,x和Y染色体上 的多个STR位点对2000年5月一2004年3月在英 国皇家产前诊断中心进行产前诊断的9080例样本 进行QF.PCR检测,共发现566例染色体异常胎儿, 其中包括130例18三体.Vincenzo等[帕]报道西班牙 和意大利两个遗传中心的28040例羊水,1120例 绒毛,196例流产胎儿外周血及694例组织样本 QF.PCR检测结果,其中29982例样本扩增成功,共 检测出216例18三体综合征,包括2例部分三体, 其核型为46,XY.dup(18)(q12.2q21.2)和46,XYdup (18)(ql1.2q22),结果与传统细胞遗传学分析一致. Cha等[11从9位因胎儿染色体异常终止妊娠妇女的 外周血中分离胎儿有核红细胞进行D18S535基因 PCR扩增成功,并成功诊断出1例18三体,该方法 不但可减少由传统的羊膜腔穿刺,绒毛活检或脐静 脉穿刺引起的不良反应,并且突破了进行羊膜腔穿 刺及绒毛活检的妊娠周数的限制. QF.PCR通过比较患儿及其父母的基因型可分 析出异常染色体的双亲来源,并且通过对STR基因 纯和性和杂和性的分析,可以判断异常染色体是来 源于减数分裂I还是减数分裂?,而且可以做多样 国外医学计划生育/生殖健康分册2007年26卷第6期 本,多基因位点的快速分析[1o-11].与常规PCR相比, QF—PCR有效解决了PCR污染问题,不需要电泳分 离.但是,只有当异常细胞的比例至少占所有细胞 的15%以上时,QF—PCR才可以检测到嵌合,同时应 用染色体核型分析和QF—PCR检测嵌合,比单独应 用核型分析或QF—PCR的检出率高_1. 2.实时荧光定量PCR(real—timefluorescentquan— titativePCR,FQ—PCR)FQ—PCR是一种在PCR反应 体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测 整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法,常用的检测模式为TaqMan探针. 该方法在PCR反应体系加入一个3'端结合淬灭基 团5'端结合发射基团的荧光标记探针,退火期探针 与DNA模板发生特异性杂交,延伸期引物在Taq酶 作用下延DNA模板延伸,当到达探针处,Taq酶切 断探针,荧光信号得到释放,荧光探测系统便会检 测到荧光密度有所增加.模板每复制1次,就伴有 1个荧光信号的释放.被释放的荧光基团数目和 PCR产物数量是一对一的关系,因此可通过荧光密 度对模板进行准确定量. Farideh等_】抽取73例包括47例男胎,23例 女胎和3例多胎的妊娠妇女外周血提取胎儿游离 DNA进行FQ—PCR,以DYS1和GAPDH基因序列做 对照,发现其中4例染色体异常,包括1例18三 体,结果被后来的羊水染色体核型分析证实.该技 术不仅实现了对DNA模板的定量,重复性好,无污 染性,并且具实时性和准确性等特点,目前已广泛 应用于分子生物学研究和医学研究等领域. 3.多连接依赖性探针扩增(multiplexligation—de— pendentprobeamplification,MLPA)MPLA是一种 灵敏度极高的定量技术,利用简单的杂交,连接及 PCR扩增反应,可同时检测最多40个不同的核苷 酸序列的拷贝数变化_】.MLPA通过设计专一的探 针组,可以杂交至目标序列,若完全杂交,则两条探 针可被连接,可利用引物对连接后的探针进行扩 增,以进行片段分析. Hochstenbach等_】]为评价MLPA技术是否可用 于羊水样本染色体异常的诊断,选取527例妊娠 15-37周的羊水样本进行MLPA反应,其中517例 扩增成功,并发现了其中的7例18三体.Dan等_l6] 对517例自然流产胎儿进行染色体核型分析,发现 其中7例表现为2条染色体三体,对这7例样本进 行MLPA,准确的诊断了这7例样本的核型,发现 1例48,XXX,+18和1例48,XY,+18+22. ? 343? 这种方法每次反应只需大约20ng的DNA;由 于探针具有非常短的识别序列,因此MPLA可以用 于局部降解的DNA并可用于分析大量混合样本.但 是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制, 而且要考虑到所用酶的反应最适温度l7]. 三,引物原位标记(primedinsitulabelling,PRINS) PRINS是由细胞遗传学,分子生物学以及免疫 学技术相结合形成的一种新技术,该技术将FISH 与PCR结合起来,其基本原理是应用寡核苷酸引物 与变性后的染色体DNA特异结合,然后用非同位素 标记的脱氧核苷酸(dUTP)参与延伸反应,标记了的 dUTP将以碱基配对的形式掺入新合成的DNA单链 中,最后用相应的荧光抗体与标记物结合可以显示 检测结果. Kirsten等_18_对262例未培养的羊水样本进行 PRINS,成功诊断其中的2例18三体,无假阳性及 假阴性结果.与荧光原位杂交技术相比,PRINS更为 快速简捷.最主要的是用PRINS技术检测18三体 时,采用的寡核苷酸引物不像FISH那样需进行复 杂的探针制备,并且价格低廉,更适宜推广应用.与 QF—PCR相比,PRINS基因定位更为准确,并提高了 特异性与敏感性_l9]. 综上所述,应用分子生物学技术进行产前诊断, 快速,准确,所需样本量少,并且便于自动化操作.各 种技术各有其优缺点,随着分子生物学技术的发展, 为达到准确,快速的诊断将其与传统的细胞遗传学 方法结合起来进行18三体综合征的产前诊断将是 必然的发展趋势[. 参考文献 [1]Huh6nMA,DhanjalS,PertlB,eta1.Rapidandsimpleprenatal diagnosisofcommonchromosomedisorders:advantagesand disadvantagesofthemolecularmethodsFISHandQF—PCR[J]. Reproduction,2003,126(3):279—297. [2]KarenS,Andr6VS,IngeL_Preimplantationgeneticdiagnosis[J]. Lancet,2004,363(9421):1633—1641. [3]PrabhakaraK,WyandtHE,HuangXL,eta1.Recurrentproximal 18pmonosomyand18qtrisomyinafamilywithamaternal pericentricinversionofchromosome18[J].AnnalesdeG6n6tique, 2004,47(3):297—303. [4]MichelB,ChoueiriNJ,Makhou1.TheconsanguinityeffectonQF— PCRdiagnosisofautosomalAnomalies[J].PrenatDiagn,2006,26 (5):409-414. 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