牛初乳生物因子提取物对人体肠道细胞CaCO-2生长性能的影响

牛初乳生物因子提取物对人体肠道细胞CaCO-2生长性能的影响 牛初乳生物因子提取物对人体肠道细胞 CaCO-2生长性能的影响 第40卷第8期 2009年8月 东北农业大学学报 JournalofNortheastAculturalUniversity 4O(8):91-96 Aug.2009 牛初乳生物因子提取物对人体肠道细胞 CaCO一2生长性能的影响 张立钢,霍贵成 (乳品科学教育部重点实验室,东北农业大学食品学院,哈尔滨150030) 摘要:初乳是自然界中唯一含有两类主要生长因子(类胰岛素生长因子和转化生长因子)的天然产物.乳源 生长因子对人体肠道具有显着的生理功能,可使新生幼体完成从胎盘营养到肠道营养的转变.本研究以CaCO一2 细胞系作为人体肠道细胞模型,测定初乳乳清,乳清超滤物和乳清阳离子交换提取物对人体肠道细胞代谢活性和 DNA复制能力的影响.结果表明,初乳乳清超滤物(截留分子质量990ku)0.01g?mL-条件下,具有最高的促细 胞代谢活?{生.为l0%胎牛血清的1.70倍.乳清阳离子交换提取物在更低的浓度下具有活性.酸乳清100ku超滤 滤出物在0.0l?mL--质量浓度下,具有10%胎牛血清2.57倍促DNA复制活性. 关键词:类胰岛素生长因子;转化生长因子;肠道细胞 中图分类号:Q5l1;TS252.1文献标识码:A文章编号:1005—9369(2009)08-0091--06 Effectofbovinecolostrumgrowth OfhumanintestinaICaCO-2celI DairySciences,MinistryofEducation,Food 150030,China) factorsextractionongrowthfunction line/ZHANGLigang,HUOGuicheng(KeyLabof College,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin Abstract:Colostrumistheonlynaturalsourceinnaturewhichcontainstwokindsofimportantgro- wthfactorsinsulin-likegrowthfactors(IGFs)andtransforminggrowthfactor-/3s(TGF一/3s).Milk-borne growthfactorshavesignificantbioactiveeffectsonhumanintestinal;thesegrowthfactorscontributethe transformationfromplacentanutritiontointestinalnutrition.Inthisresearch.CaCO-2calllinewaschoos en asamodelofhumanintestinal,growthfactorsextractwasinvestigatedtheirfunctionofgrowthpromotio n. bovineserumwasusedasreference.ThemetabolismactivityandDNAreplicationwereusedas indicators.TheresultsshowedthatdifferentextractsshoweddifferenteffectsoncelIgrowthcapability. Colostrumwheyultrefiltrationfiltrates(MolecularWeightCuttingOff990ku)showedhighestactivityi n O.01g’m,itwasabout1.70timesactivityof10%fetalbovineserum.Wheyionicexchangeextractions hadhigheractivity,andcouldbeagoodsourceforcellmetabolismactivitystimulatoragent.Acidwhey ultrafiltrationfiltrate(MolecularWeightCuttingOff100ku)showedthehighestDNAduplicationstimu lating activityin0.01g?mL..,itwasabout2.57timesactivityof10%fetalbovineserum. Keywords:insulin?-likegrowthfactors;transforminggrowthfactor;intestin~!cell 初乳是哺乳动物在生产之后3d内产生的乳. 初乳富含多种生物活性成分,包括免疫球蛋白, 乳铁蛋白,乳过氧化物酶,富含脯氨酸多肽和生 长因子等,作为新生哺乳动物幼体的唯一食物,初 乳辅助新生幼体完成胎盘营养到肠道营养的转变. 初乳是唯一提供两类主要生长因子,类胰岛素 收稿日期:2009—03—26 基金项目:东北农业大学创新团队项目(CXT007) 作者简介:张立钢(1973一),男,黑龙江人,博士,研究方向为乳品科学.E-mail: 通讯作者:霍贵成,教授,博士生导师,研究方向为营养与乳品加 工.E-mail:gchuo@vip.0451.corn 92?东北农业大学学报第4|D卷 生长因子(Insulin—likeGrowthFactors,IGFs)和转 化生长因子a(TransformingGrowthFact0rO/.TGF一 仅)和/3(TransformingGrowthFactor,TGF-/3)的天 然来源l.IGFs由类胰岛素生长因子1(Insulin— likeGrowthFactor1,IGF—I),类胰岛素生长因子 2(Insulin—likeGrowthFactor2,IGF一11)和松弛素 组成.IGF—I和IGF一11对热,酸稳定,是广泛分布 的细胞生长,发育和分化调节剂[31.牛初乳中IGF—I 在含量上要多于IGF一11.IGF—I被称为是生长调节 素C,分子质量为7.6ku,由70个氨基酸组成的 多肽,参与调节生长激素的行为[41.牛初乳中纯化 得到IGF—I,IGF—II和截断型的IGF—I(Truncated IGF—I,一3N:IGF—I). 初乳和常乳中存在的IGFs的功能是多方面 的.IGFs可以刺激乳腺细胞的有丝分裂和乳汁的 生成『5l,也可以直接对胃肠道上皮细胞发挥作用, 或经吸收进人到循环途径,从而发挥系统功能. IGF—I对哺乳动物肠道功能具有重要作用.日粮 IGF—I可以刺激新生仔猪胃肠道细胞的增殖[61,也 可以刺激牛肠道细胞的增殖171,增强新生小牛的D一 木糖的吸收[81.牛的IGF—I氨基酸序列与人的IGF— I氨基酸序列一致?,人体补充富含IGF—I的初乳 制品具有显着的生理功能. TGFs是牛初乳中一种多功能生长因子, TGF-/32是牛乳中TGF-/3s主要形式,具有高度多 向性.牛TGF-/T2的全部氨基酸序列与人体一致『ll1, TGF-/3能刺激某些细胞的增殖,尤其是连接组织; 但是对于某些细胞是抑制剂,如淋巴细胞和上皮 细胞.TGF在胚胎发生,组织修复,骨骼和软 骨生成,免疫系统控制方面具有重要作用.据推 断,TGF--/3是新生幼仔黏膜免疫和肠道上皮细胞分 化的调节物.肠道上皮细胞本身也产生TGF-..~t21. TGF-/31诱导体外培养的肠道上皮细胞终端分化可 以支持TGF-/3参与肠道上皮的发育的推断【l3】. 初乳及其制品在人体肠迫功能方面具有重要 作用.初乳的作用不可能归结为单一生长因子的 作用,而可能是在初乳中存在的多种生长因子共 同协同作用的结果【l41.乳清蛋白质商业水平分离分 为4类,分别是选择性沉淀,膜过滤,选择性吸 附和选择性洗脱[151,所生产的产品包括初乳粉,免 疫球蛋白,初乳乳清,离子交换提取物等.每一 种产品都有其主要功能.对于人体肠道功能的促 进作用,不同制备物的效果有所差异.针对组织, 细胞和身体整体对乳源生长因子的反应机理研究, 需要建立在研究多种因子交互作用的基础之上. 本研究以细胞系作为人体肠道细胞模型,比较 初乳及制备物对人体肠道细胞生长性能的影响.初 乳制备物包括初乳乳清,初乳乳清超滤物和阳离子 交换提取物,人体肠道细胞生长性能以代谢活性和 DNA复制活性为指标. 1与 1.1材料 牛初乳,胎次2,5,榨乳时间为分娩后24h; 人体肠道细胞CaCO一2,凝乳酶;IGF—IELISA检 测试剂盒(DSL一10—2800);TGF-/ff2ELISA检测试 剂盒(DB250);细胞代谢活性测定试剂wsT—l;细 胞DNA复制活性测定试剂BrdU;蛋白纯化仪;超 滤仪;层析柱;酶标仪. 1.2方法 1.2.1初乳乳清制备方法 制备酶凝乳清,以990ku超滤截留液作为 细胞测试物.酸乳清经初乳酸沉淀去除酪蛋白,以 990ku超滤截留液作为细胞测试物. 1.2.2Bradford法测定蛋白质含量 .染料考马斯亮蓝与蛋白质结合形成有色产物, 最大吸收波长在595nm,在0,100I.Lg?mL一范围 内,可定量测定【l7】. 1.2.3IGF—I质量浓度测定方法 测定用酶标板预先包被抗IGF—I抗体,抗体 与加人的样品,品和对照物孵育,反应, 经清洗,加入辣根过氧化物酶标记的抗IGF—I检 测抗体,再次孵育反应.添加底物TMB,生成 有色产物,可用比色法测定样品中IGF—I质量浓 度. 1.2.4TGF--/32质量浓度测定方法 抗TGF]82的单克隆抗体预先包被在微孑L板 上.标准和样品加人到微孔中,与抗原与抗体结 合.经清洗,酶联多克隆抗体与抗原结合.在清洗 之后,加人底物,生成有色物质的量与结合到单抗 上的抗原量成正比,可以用比色法测定样品中 TGF-/32的质量浓度. 1.2.5生长因子阳离子交换(IEX)提取物制备方法 使用强IEX树脂SPFF进行层析【61. 第8期张立钢等:牛初乳生物因子提取物对人体肠道细胞CaCO一2生长性能的影响?93? 1.2.6CaCO一2细胞系培养方法 标准DMEM培养基,10%FBS,双抗,5% CO:,37?,培养瓶中培养,2,3d传代一次,镜 下观察,在细胞达到50%融合时,传代. 1.2.7细胞代谢活性测定 活细胞可以将四唑盐转变成甲躜形式.活细 胞数量增加导致整体线粒体脱氢酶活力增加,酶 活性增加可使甲躜染料形成增加,最终染料生成 量直接相关于培养物中进行代谢的活细胞数.在 一 定浓度范围内,可用分光光度计测定.细胞培 养(浓度10,?100trL?孑L,,添加测试物,孵育 48h),1:10比例添加试剂WST一1,孵育4h,以 背景对照做空白,450nm波长测定吸光度值,参 考波长630nm. 1.2.8DNA复制活性测定 细胞在增殖过程中,DNA进行复制,嘧啶的 类似物BrdU可代替胸苷掺人DNA,因此可利用 BrdU的高特异性抗体,基于酶联免疫方式测定细 胞的DNA复制.细胞培养(浓度llY?100IJ-孔,, 添加测试物,孵育48h),BrdU标记(终浓度lO I~mol?L,,孵育24h),固定,添加酶标抗体工作 液,添加底物,以背景对照做空白,450nm波长 测定吸光度值,参考波长630am. 1.2.9细胞测试物 以细胞培养基溶解牛初乳制备物冻干粉,配 制成质量浓度为0.0001,100mg?mL-’的培养液. 1.2.10数据分析方法 数据分析采用SPSS软件. 2结果与分析 细胞测试样品蛋白质质量浓度,IGF—I和 TGF--132质量浓度见表1. 表1细胞测试样品蛋白质,IGF-I和TGF—2质量浓度 Table1Concentrationofprotein,IGF-IandTGF--fl2ofcelltestsamples 由表1可知,初乳,乳清和各种初乳乳清制备 物具有不同模式的IGF—I和TGF-ff2质量浓度.两 种乳清的生长因子模式有所不同,在同质量浓度 下,酸乳清相比酶凝乳清IGF—I所占比例高,而 TGF-/32稍低.胎牛血清与牛初乳具有相近的蛋白 质浓度,但初乳中IGF—I含量高于胎牛血清1倍, 而TGF-/~2则高于10倍以上. 不同质量浓度酸乳清和酶凝乳清对CaCO一2细 胞代谢活性影响测定结果见图1.由图1可知.不 同质量浓度两种乳清促CaCO一2细胞代谢活性具有 相似的规律,在0.01mg?mL质量浓度条件下,促 细胞代谢活性最高,超过此浓度,活性有所降低, 在此条件下,IGF-I的质量浓度为25.2ng?mL一(酶 凝乳清),90.0ng?mL(酸乳清),TGF-ff2质量浓 度为30.1Pg?mL(酶凝乳清),26.1Pg?mL(酸乳 清). 乳清100ku超滤(截留分子质量100ku)制备 物(酸乳清超滤截留物,滤出物)对细胞代谢活性的 影响见图2.由图2可见,不同浓度的滤出液与截 留液具有不同的促细胞代谢活性趋势,相比之下, 滤出物在低于0.O1mg?mL-质量浓度条件下,具有 较高的促细胞代谢活性,超过这一浓度,截留物表 现出更高的活性.滤出物在O.01mg?mL-t时,IGF—I 和TGF-7~2的质量浓度分别为91.5ng?mL.和14.7 Pg?mL一.超滤截留物在lOmg?mL-一条件下,促细 胞代谢活性最高,这可能是由于在截留液中其他成 ? 94?东北农业大学学报第4J0卷 分影响造成的结果. 乳清阳离子交换制备物对细胞代谢活性影响结 果见图3. 迥{ 吕 0.000l0.O0l0.0l0.1110100 乳清制品质量浓度(rag?mL-)对数值 Logofconcentrationofwhey 图1酸乳清与酶凝乳清添加量对CaCO-2 细胞代谢活性的影响 Fig.1Effectsofacidwheyandcheesewheyonthe metabolismactivityofCaCO-2cellline Oj 0.000l0.OOl0.0l0.11l0l0O 乳清制品添加量(mg?mL)对数值 Logofconcentrationofwhey 图2乳清超滤物对CaCO-2代谢活性的影响 Fig.2Effectsofwheyultrafiltrationextractionson metabolismactivityofCaCO-2cellline j四{一》 .80.1 『tI黧EXextractionofchieesewhq 乳清提取物质量浓度(mg?mL’)对数值 Logofconcen, trationofIEXextractionofwhey 图3乳清离子交换提取物对CaCO-2细胞系代谢活性的影响 Fig.3EffectsoftwokindsofwheyIEXextractionson metabolismactivityofCaCO-2cellline 由图3可知,酸乳清IEX提取物具有高于酶 凝乳清IEX提取物的促细胞代谢活性.两种提取 物在不同质量浓度下促细胞代谢活性具有相似的规 律.两种乳清在0.OOlmg?mL--质量浓度条件下, 具有最高的促细胞代谢活性,低于此质量浓度,活 性有所降低.最高促代谢活性时,IGF—I和TGF一 质量浓度分别为1.23ng?mL,,7.29Pg?mL(酶 凝乳清IEX提取物)和2.38ng?mL,,11.4Pg?mL一1 (酸乳清IEX提取物).酸乳清和酶凝乳清制备物 对CaCO一2细胞DNA复制活性影响见图4. j粤{ 8考 乳清制品添加量(mg?mL)对数值 Logofconcentrationofwhey 图4酸乳清和酶凝乳清对于CaCO一2 细胞DNA复制活性的影响 Fig.4EffectsofacidwheyandcheesewheyonDNA duplicationactivityofCaCO-2cellline 由图4可见,两种乳清促细胞DNA复制活性 存在差异,两种制备物在1,100mg?mL质量浓度 范围内具有相似的促DNA复制活性趋势.在0.1 mg?mL质量浓度条件下,酶凝乳清具有最高的活 性,此时IGF—I和TGF质量浓度分别为252.4 ng?mL和301.2Pg?mL,.在0.0lmg?mL添加量 下,酸乳清具有最高的活性,IGF—I和TGF-fl2质 量浓度分别为90.0ng?mL和26.1Pg?mL-. 乳清超滤物(截留分子质量100ku)对CaCO一 2细胞DNA复制活性的影响结果见图5.由图5 可见,酸乳清超滤物具有不同的促DNA复制活 性.在0.001,100mg?mL质量浓度范围内,截 留物比滤出物具有更高的活性.在0.01mg?mL 质量浓度下具有最高的活性,此时截留物的IGF— I和TGF质量浓度分别为20.0ng?mL和8.4 Pg?mL;滤出物的IGF—I和TGF质量浓度分 别为91.5ng?mL和l4.7pg?mL一.对于DNA复 制活性的促进,两种生长因子的含量高的滤出物 具有更高的活性. OO ;IB口0 口0 第8期张立钢等:牛初乳生物因子提取物对人体肠道细胞CaCO-2生长性能的影响 { 凸 0 .|乳清100ku截留100kuretentateofwhey 乳清制品质量浓度(mg?mL-)对数值 Logofconcentrationofwhey 图5乳清超滤物对CaCO-2DNA复制活性的影晌 Fig.5EffectsofwheyultrafiltrationextractionsonDNA duplicationactivityofCaCO-2cellline 两种乳清阳离子交换制备物对CaCO一2细胞 DNA复制活性的影响见图6.酶凝乳清在1mg?mL- 质量浓度条件下,具有最高的促CaCO一2细胞 DNA复制活性,IGF—I和TGF-fl2质量浓度分别为 1234.9ng?mL和7294.4Pg?mL,,酸乳清在0.1 mg?mL质量浓度条件下,具有最高的促CaCO一2 细胞DNA复制活性,IGF—I和TGF--~2质量浓度分 别为238.1ng?mL一’和ll44.7pg?mL一.两种制备 物对细胞DNA复制活性的影响有不同的趋势. j雩{ 宕考 _?I酶凝乳清IEX提取物IEXextractionofcheesewhey 0.0oOlO.o010.0l0.11l0l00 乳清制品添加量(mg?mL-’)对数值 LoSofconcentrationofwhey 图6酸乳清,酶凝乳清IEX提取物对CaCO-2细胞系 DNA复制活性的影响 Fig.6EffectsoftwokindsofwheyIEXextractionson DNAduplicationactivityofCaCO-2cellline 各种制备物对CaCO一2细胞代谢活性和DNA 复制活性影响的比较见表2.相对促细胞代谢活性 和相对促细胞DNA复制活性均以10%胎牛血清作 为对照,以样品反应体系OD值与添加10%胎牛血 清的标准培养方法反应体系OD值之比作为相对促 进活性. 表2初乳乳清制备物对CaCO-2细胞生长性能的影响(以10%牛血清为对照) Table2EffectsofcolostnnnwheyextractionongrowthactivityofCaCO-2cellline(FetalBovineSerun/a scontrast) 样品 Sample 由表2可知,各种制备物对于CaCO一2细胞代 谢活性和DNA复制活性上的效能不同,酶凝乳清 和酸乳清质量浓度为0.Olg?mL-时具有最高的促 细胞代谢活性,是10%牛血清的1.70倍.酸乳清 100ku超滤滤出液在0.0lg?mL质量浓度下,具 有最高的促DNA复制活性,相当于10%的2.57 倍. 3讨论 牛初乳的加工处理方式影响制备物的生长因子 组成模式,乳清制备方式,超滤和阳离子交换产物 中两种生长因子含量,比例有所不同,三种方法都 可以有效提高两种生长因子的纯度.这三种方法的 合理组合应用,可制备,生产乳源生长因子制品. 一一一一, 性.甜m, 高凰屣 ,哪 肘 性.啊活m_三-暑 -:,一一 96’东北农业大学学报第4O卷 两种牛初乳乳清(酶凝乳清和酸乳清)对CaCO-2 细胞的代谢活性促进作用模式相近,虽然酸乳清具 有更高浓度的IGF—I,但TGF-fl2浓度低,促细胞 代谢活性与酶凝乳清没有显着区别.乳清超滤截留 物和滤出物促CaCO一2细胞代谢活性的不同趋势可 能是由于两种生长因子在乳中复杂形式和其他成分 的影响造成的.两种乳清IEX提取物对于CaCO一2 细胞代谢活性影响趋势一致.酸乳清IEX提取物 虽然具有近2倍质量浓度的生长因子,但活性与酶 凝乳清没有显着区别.在促CaCO一2细胞DNA复 制方面,两种乳清表现出不同的趋势,酸乳清在更 低的浓度上具有最高促DNA复制活性.两种超滤 制备物对CaCO一2细胞的DNA复制活性表现出相 同的趋势,生长因子浓度高的滤出液具有更高的活 性.两种IEX提取物的促DNA复制活性趋势不 同,酸乳清的IEX提取物在更低的浓度上具有较 高活性.具有不同的生长因子构成模式牛初乳加工 制备物对人体肠道细胞生长性能的影响不同.酶凝 乳清,酸乳清超滤截留物和离子交换提取物最高促 细胞代谢活性浓度与最高促DNA复制活性浓度不 一 致,具有不同的作用模式.阳离子交换提取物促 细胞代谢活性在测试条件下并不是最高,但在更低 的浓度下,具有较高的活性.如果以同等质量浓度 比较,其具有更高的促代谢活性. 4结论 牛初乳的各种制备物生长因子构成模式不同, 对CaCO一2细胞系的生长性能有不同的影响.酶凝 乳清和酸乳清在O.01lig?mL-质量浓度下,表现出 最高的促细胞代谢活性.乳清IEX提取物在低浓 度(0.001lig?mL)具有活性,可以用于生产促细胞 代谢活性和DNA复制的制品. 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