宫腔冲洗法寻找孕早期胎儿滋养细胞的免疫细胞化学研究

宫腔冲洗法寻找孕早期胎儿滋养细胞的免疫细胞化学研究 宫腔冲洗法寻找孕早期胎儿滋养细胞的免疫细胞化学 研究 2008 年暨南大学硕士学位论文 摘要 目的: 样的安全性和有效性,观察抗 HLA-G 、 CK-7 两种单克隆抗体对孕早期宫腔冲洗液中滋养 细胞的识别情况。 方法: 92 例在 6~10 以输卵管通液检查的 拟终止妊娠妇女进行宫腔冲洗, 孕周之间、 未孕妇女作对照,用抗 HLA-G 、 CK-7 抗体分别对回收的冲洗液涂片进行免疫细胞化学试 验,光镜下观察涂片中各种细胞形态及特异性染色情况。 结果: ( 1) 92 例早孕妇女收集到宫腔冲洗液者 86 例,取材成功率 93.5% ; ( 2)平均回收 液量 3.2ml ,其中可见血污染者 29 例,占 33.7% ; ( 3)宫腔冲洗样本获取滋养细胞阳性率 为 73.3% ,而滋养细胞数目占收集细胞样本中的 0.5%~7% ; ( 4)抗 HLA-G 、 CK-7 抗体识 别孕早期宫腔冲洗液涂片上滋养细胞的敏感度分别为 59.5% 、 88.5% 特异 度 , 92.3% 、 10% , 它们对孕早期滋养细胞的识别率差别有统计学意义。 结论: ( 1 经宫颈取 但该法并非完全无创, 孕早期宫腔冲洗可获取一定数量的滋养细胞, ) 样行产前诊断需采取更安全有效的取材方法。 ( 2)抗 HLA-G 抗体对滋养细胞有一定特异 性;抗 CK-7 抗体可识别各种滋养细胞亚群,但同时与子宫腺上皮细胞反应,两者联合应 用或结合其它特异性标记物,富集早孕宫腔脱落胎儿细胞的效率可能会更高。 关键词: 孕早期;经宫颈取样;宫腔冲洗;滋养细胞;免疫细胞化学染色;产前诊断I 选择 了解孕早期妇女宫腔下段脱落滋养细胞的存在情况, 探讨宫腔冲洗法用于经宫颈取2008 年暨南大学硕士学位论文 Abstract Objectives : To know the presence of fetal trophoblasts fell off the lower uterine pole in the first trimester of pregnancy, approach the safety and efficiency of transcervical sampling by the means of intrauterine lavage IUL . Using immunocytochemistry ( ICC ) assay with anti-HLA-G or anti-cytokeratin 7 monoclonal antibody ( Mab ) , observe their recognization status of trophoblasts from the samples recovered by transcervical lavage of the lower uterine pole Methods : A total of 92 transcervical cell samples were retrieved from pregnant women between 6 and 10 weeks of gestation by means of IUL, immediately before elective termination of pregnancy ( TOP ) , at which time the transcervical cell TCC samples from non-pregnant women who did hydrotubation were also obtained. Those samples were made into smears and tested with two Mabs anti-HLA-G and anti-CK-7 by immunocytochemistry staining. Observe the morph of all cells on slides and immunopositive cells Results : 1 There were 86 cases in 92 early pregnant women 93.5% successfully retrieved the intrauterine fluid. 2 The average quantity of TCC samples was 3.2 ml, 33.7% 29 cases of all samples were contaminated with blood. 3 The detection rate of trophoblasts from IUL specimens was 73.3%, the frequency of fetal trophoblasts recovered with IUL to range from 0.5% to 7%. 4 The sensitivity of anti-HLA-G or anti-CK-7 Mab recognised the trophoblasts in the TCC samples was 59.5% 、 88.5% , specificity was 92.3% 、 10%. There was significant difference between the two Mabs about the rate of recognition of trophoblasts in early pregnancy Conclusions : 1 We can collect a certain number of trophoblasts by IUL sampling , but it was not non-invasive completely method. For prenatal dignosis in early pregnancy using TCC samples, we need safer and more effective method of sampling. 2 The anti-HLA-G Mab can react specially to trophoblast. The anti-CK-7 Mab not only recognize all the subpopulations of trophoblast, but also react to uterine gland epithelial cell. When using the two Mabs together or combinating with other more special markers , it would be more effective to detect and enrich fetal cells shed down the lower uterine pole in early pregnancy , for the following study on prenatal diagnosisKey words: early pregnancy ; transcervical cell sampling ; intrauterine lavage ; trophoblast ; immunocytochemistry ; prenatal diagnosisII2008 年暨南大学硕士学位 论文 目??录? 摘要?? ABSTRACT?? 目录?? 前言1? 材料与方法7? 结果??10? 讨论??15? 结论??19? 展望??20? 参考文献21? 缩略词表25? 综述??26? 在学期间发表论文清单33? 致谢??33 III 2008 年暨南大学硕士学位论文 前言 感染性疾病和各种营 人口和疾病模式有了一定转变, 随着经济的发展和科 技的进步, 而出生缺陷则成为儿童死亡率居高不下和人均寿命不能提高的 养缺乏症得 到了有效控制, 诊断水平 出生缺陷监测对象偏重于城市地区、 鉴于我国人口众多、 遗传性或获得性异常。 估计我国出生缺陷的发生率在 还不高等原因, 40‰~ 50 ‰以上, 即我国每年实际发生的 出生缺陷至少有 80 万~ 120 万例。目前实行的自愿婚前检查 政策,更是增加了出生 人口的缺陷率。 自 2000 年起, 我 国在全国范围内开展出生缺陷干预工程, 而出 生缺陷干预的关键在于预防,对于绝大 部分染色体病,目前尚无有效的治疗方法。 世界卫生组织也提出了出生缺陷的 “三级预防” 策略: 一 级预防是防止出生缺陷儿 的发生,包括婚前检查、遗传咨询 、选择最佳的生育年龄、孕早期保健,包括合理 营养、预防感染、谨慎用药、 戒烟戒酒、避免接触放射线和有毒有害物质、 避免接 触高温环境等; 二级预防是减少出生缺陷儿的出 生, 主要是在孕期通过早发现、 早 诊断和早采取措施, 以防出生缺陷儿的 出生; 三级预防是对出生缺陷的治疗。 由于 大部分出生缺陷还缺乏特异的一级预防措施, 目前出生缺陷的干预在很大 程度上依 赖于产前筛查和产前诊断。 1产前诊断概述 目 包括相应筛查, 产前诊断是指对胚胎或胎儿进行先天性缺陷和遗传性疾病的诊断, 前产前诊断的疾病有染色体病、性连锁遗传病、遗传代谢缺陷病及非染色体性先天畸形, 从而使生育健 以防病残儿出生, 指导选择性流产, 对主要影响生存或生活质量的遗传病, 因此孕早期相关的无创或微创性 诊断的时间越早对母儿越有利, 康后代的理想成为现实。 产前诊断技术就成为国际围产医学和遗传学研究的热点之一。 1.1 侵袭性产前检查技术 [1] 目前应用于临床的产前诊断方法 主要包括有创性检查: ? 绒毛膜绒毛取样 ( chorionic villi sampling , CVS ) 在妊娠 : 9 经阴道或经腹取胎盘绒毛组织进行染色体核型 周后进行, 且有胎儿畸 但对嵌合体诊断可靠性不如羊水细胞学检查, 此检查有利于早期诊断, , 形、肢体残缺的报道; ? 羊水细胞学检查:妊娠 15 16~20 周为 1 周前禁做此项检查,妊娠 主要原因。 出生缺陷是指出生前的各种因素造成的, 存在于婴幼儿时期或儿童早期的一切2008 年暨南大学硕士学位论文 但由 为产前诊断最可靠的技术之一, 可诊断多种染色体疾病及基因疾病, 最佳检查时间, 于在孕中期进行而不利于早期的产前诊断; ? 胎儿脐血检查:在妊娠 17 周至足月进行, 胎儿脐血可行染色体检查及其他各种生化检查, 其结果也较为可靠, 但风险较前二者为高, [2] 难以被广大孕妇所接受,且不利于早期诊断。上述检查造成流产的风险达 0.5 2% , 故仅用于高风险妊娠妇女。 1.2 非侵袭性产前诊断 / 检查技术 非侵袭性产前诊断 / 检查技术有: ? B 可 是整个孕期皆可施行的无创性检查, 超检查: +6 发现多种胎儿畸形,并可对遗传病风险进行评估。在妊娠 11~13 周,用 B ( 项透明层厚度 nuchal translucency , NT 可对 的 检查, ) Down’s 作 综合征进行风险评估, 为是否进行产前诊断的依据,尤其是对多胎妊娠的 Down’s 风险评价较母亲血清生化检查 但 好。 B 最后确诊疾 只能对体表或结构的畸形进行诊断, 超检查仅是产 前遗传病的筛查, 病需胎儿染色体检查或待分娩后。 ?母血清生化检查: 母血清中甲胎蛋白 alphafetoprotein , AFP 、游离雌三醇 estriol , uE3 、游离人绒毛膜促性腺激素 beta - human chorionic gonadotrophin , β -HCG 、 pregnancy-associated alpha plasma proteins , PAPP-A 已能在孕中期筛查出 等多种检测指标, 85% 胎儿患 Down’s 但 综合征的高危孕妇。 [3] 血清学筛查尚有 5 %的假阳性问题 ,最终需染色体检查确诊,且不利于孕早期诊断。 ? 植入前诊断 preimplantation diagnosis , PGD :可用于染色体单基因 疾病的诊断,仅适用 于那些携带遗传病基因及染色体重组风险高、行试管内受精( in-vitro fertilization , IVF ) 国内仅有少数生殖中心能够开展 的妇女, PGD 且有降低 , IVF 限制了应用 妊娠率的可能, [4] 范围。?从母血中分离胎儿有核红细胞可进行产前诊断 ,但由于胎儿有核红细胞在母血 6 7 中存在量极少(胎儿细胞与母体细胞的比例约为 1: 10 ~ 10 ) ,分离困难,技术上存在不 ?从母血中寻找胎儿基因 限制了其应用。 且母血中胎儿细胞可持续存在至下次妊娠, 足, 片段:利用这些基因片段有进行产前诊断的可能,但利用游离胎儿 DNA 片段,不能获得 完整的遗传信息, 限制了多种遗传疾病的诊断, 而有关 Down’s 综合征妊娠中游离胎儿 DNA 的含量目前仍有互相矛盾的证据。 用这些滋养层细胞作为胎儿遗传 在孕早期宫腔下段寻找脱落的滋养层细胞, 近年来, 痛。 且经宫颈取样获取的胎儿细胞远较母血中的胎儿 胞进行产前诊断具有无创或微创性特点, 染色体非整倍体异常和部分单基因遗传病等多个小样本 目前已有诊断胎儿性别、 细胞多, 2 信息的来源, 进行遗传诊断或染色体病的产前诊断成为研究热点。 经宫颈取样收集胎儿细 产前诊断的最佳时期在孕早期, 发现疾病可及时终止妊娠, 减轻孕妇生理及心理的病 妊娠相关α血浆蛋白 超进行胎儿颈 %~2008 年暨南大学硕士学位论文 的文献报道,该方法逐渐发展成熟,有望成为孕早期产前诊断的一种新途径。 2孕早期经宫颈取样收集胎儿滋养细胞的可行性 [5] 1971年 Shettles 根据孕早期胚胎退化脱落的 绒毛可进入到母体子宫腔下段并到 达宫颈管内的假说,用棉拭子收集孕妇 宫颈粘液,利用阿的平荧光染色找到了 Y 小 [6] 体,验证了孕早期妇女宫颈管内的确存 在胎儿滋养细胞。这一论断先后被 Warren 、 [7] Rhine ( 最终形成绒毛滋养细胞 方向分化, villus trophoblast , VT 及绒毛外滋养细胞 ) extravillus [8] trophoblast , EVT 许多学者认为 。 细胞可从胎盘外绒毛退化脱落至孕妇子宫腔下段再到达宫颈管,并持续存在至 13~ 15孕 这些滋养细胞如何通过包蜕膜? 宫腔消失而羊膜腔形成。 包蜕膜与真蜕膜逐渐融合、 周, 孕妇 除胎儿来源的细胞外, 可能与滋养细胞侵袭的本性有关。 其确切机制目前尚不清楚, 但与母血 间质细胞和血细胞等, 如子宫内膜细胞、 宫颈管内可能存在多种母体衍生细胞, [9] 中存在多种类型的胎儿细胞不同 ,宫颈管内的胎儿细胞都是胎盘来源,绝大多数都是滋 可以用独特的标记以区别周围的母体 不受前次妊娠影响, 携带有胎儿遗传信息, 养细胞, 它们可以与多种抗滋养细胞成分的单克隆抗 且滋养细胞表现出一定的抗原异质性, 细胞, (简称单抗, 体 monoclonal antibody , Mab 因此利用一种或几种直接与滋养细 相互作用。 ) 胞特异性结合的单克隆抗体, 可以将样本中的胎儿滋养细胞筛选出来, 从孕妇宫颈管收集到滋养细胞的时间为 目前文献中运用不同方法, 到宫腔消失为止。 5~ 7 - 13~ 15孕周。 3国内外研究现状 自 20 世纪 70 年代, Shettles Y 小体,从此拉开了孕早期经宫 颈取样行产前诊断研究的序幕。但由于技术条件的限制,这方面的研究停滞了 10 多年, 直到 90 年代初,随着分子生物学技术的 发展,特别是聚合酶链反应( polymerase chain reaction , PCR ( 和荧光原位杂交 ) fluorescence in situ hybridization , FISH 技术的应用, ) 孕早期宫颈管内脱落滋养细胞的收集方法及实验室检 改变了传统的细胞遗传学分析方法, 并逐渐用 使宫颈管内滋养细胞检出率逐渐提高并趋于稳定, 测方法有了突飞猛进的发展, 于判断胎儿性别、检测胎儿非整倍体及部分单基因疾病的产前诊断研究。 3 从孕妇宫颈粘液中找到 从绒毛的发生可以推测, 经宫颈收集脱落滋养细胞的时间, 是从绒毛侵袭性生长进入宫腔 进行产前诊断研究。 在孕早期叶状绒毛膜变成平滑绒毛膜的过程中, 滋养 等人所证实。 晚期囊胚着床后, 滋养层细胞迅速分裂增殖, 并沿绒毛和绒毛外两个2008 年暨南大学硕士学位论文 3.1 取样方法 [10] 其中宫腔冲洗法 方法各有利弊, 通常使 研究早期, 收集到胎儿来源细胞的成功率最高。 [11] [12] 但收集的可供分析的细胞少 用棉拭子进行宫颈取样, 后来应用套管拭子 , 减少了精 , 吸取宫颈粘液法需要 但收集的细胞数量仍有限; 提高了合体滋养细胞获取率, 液的污染, [10,13,14] 将形态学鉴别和显微操作相结合, 以分离与滋养细胞相似的细胞团, 比较费时 ; 1977 [15] 年 Rhine 首先应用宫腔冲洗法来收集脱落滋养细胞 腔冲洗液可收集到较多的多核和 宫 , [16] 细胞滋养层细胞成分 有利于进一步试验 阴道上皮细胞和精液污染, 同时减少了宫颈、 , [17] 近来开始使用细胞刷收集宫颈粘液样本 分析; 该法可同时收集到细胞碎片和母体宫颈 , [18] [10,19] , 85 。 3.2 检测方法 第 包括免疫细胞化学技术; 第一类是细胞水平, 检测胎儿滋养细胞方法共有三大类, 二类是分子细胞水平,原位杂交技术 包括非同位素原位杂交( non-isotopic in situ hybridization , NISH FISH 第三类是基因 ; DNA 包括 水平, PCR 及在此基础上发展起 经过 来的新技术。 30 目前利用 余年的探索, PCR 、 FISH 技术检测胎儿 滋养细胞成分的方 尤其母体细胞相应降低了实验分析的效率。 回收了大量细胞母体和胎儿细胞, PCR 技术 较敏感, 可检测到样本中微量的男性胎儿细胞 DNA , 但无法排除一些退化的精子细胞 DNA [20] 的干扰,故有一定的假阳性 FISH 无需担心精子污染问题,但只能分析男性胎儿细 [21] 胞成分 假阳性是由于细胞污染或胎盘镶嵌 其结果出现假阴性是由于收集的细胞太少, , 因缺乏父源 等现象。 X 从母体细胞中区分女性胎儿细胞非常 染色体的特异性多态标记物, [22] 困难,这是目前 PCR 和 FISH 技术无法克服的障碍。为降低假阳性率, Adinolfi 等人 曾 用 X22 显微操作技术及激光显微 随着一些新技术如荧光免疫组化法、 来标记父源染色体。 [23,24,25] 解剖技术的联合应用,滋养细胞的检出率逐渐提高 。目前收集宫颈管内脱落滋养细 在研究水平上已成功地运用宫腔脱落滋养细胞判断胎儿 胞进行产前诊断的 技术日趋成熟, 性别、 RhD 并用于诊断 核型, 21 三体、 18 三体、 13 三体等非整倍体和部分单基因遗传病 [26] 如地中海贫血、镰状细胞贫血等 。 3.3 胎儿细胞标记物 ( 通过免疫细胞化学染色 选择特异性单克隆抗体, immunocytochemistry , ICC 以 4 )可 。而 法已成熟, 其敏感度依赖可供分析的细胞数目和胎儿细胞与母体细胞的比率。 经宫颈取样 )及 %的宫腔冲洗液可获得胎儿细胞 细胞。 收集宫颈粘液与宫腔冲洗两种方法比较而言, 后者更能持续可靠地收集到胎儿细胞 目前经宫颈取样方法有拭子法、细胞刷、抽吸宫颈粘液、宫颈管或宫腔冲洗,这几种2008 年暨南大学硕士学位论文 对滋养细胞进行阳性筛选,但现在还没找到只针对滋养细胞的高敏感度及高特异性抗体。 国外文献中曾经用于收集宫腔脱落滋养细胞的特异性单克隆抗体有 GB25 、 G233 、 PLAP 、 NDOG5 、 340、 NDOG1 、 FT141.1 等。 1999 年 Miller [27] 进行了比较 其中对滋养细胞的识别率分别为 , 340 73 16/22 PLAP 58 14/24 FT141.1 33% 。而 1996 年 Durrant 利用抗体 340 结合磁珠分选孕妇血液 中的滋养细胞,检 [28] [29] 测男性胎儿的有效率仅为 39% ; GB25 为绒毛滋养细胞的特异性抗体, Chang 在利用 GB25 进行免疫组化染色阳性的宫腔冲洗样本中都检测到了胎儿细胞; G233 与在绒毛外滋 养细胞表达的组织相容性抗原 G (人类白细胞抗原 G , human leucocyte antigen G , HLA-G ) 结合, 2003 年 Bulmer 运用它在大约 50 12/23 宫腔冲洗样本中检测到细 胞滋养细胞 的 ) [23] [30] 成分 ; 2005 年 Fang CN 等人 采用抗细胞角蛋白 7( cytokeratin 7 , CK-7 )抗体检测 孕早期妇女宫颈粘液的脱落滋养细胞,成功率达 59.2%;而 Mantzaris 体 NDOG-1 ( 荧光聚合酶链反应 、 fluorescent polymerase chain reaction , F-PCR 和激光显微解剖 ) [31] 技术在 22 例抽吸宫颈粘液样本中都成功检测到了胎儿来源的细胞 。 4 我们的研究目的与主要内容 综合国内外文献报道,经宫颈收集胎儿细胞行孕早期产前诊断研究有着巨大的潜力, 然 分离胎儿滋养细胞, 从经宫颈细胞样本中富集、 向于利用胎儿滋养细胞特异性标记物, 后进行产前诊断研究。当前经宫颈取样方法中,宫腔冲洗法回收滋养细胞阳性率为最高, 但可能对胎儿有一定风险,故现未在临床开展。 包被胎儿细胞特异性单克隆 适于宫颈管形状的微栓, 我们旨在应用自行研究的、 抗体磁珠,放置于拟行人工流产的早孕妇女宫颈管内,待反应 6~8 小时后取出,以富集、 替代当前的有创性产 并能成功应用于临床, 如这种方法可行, 前诊断的可行性和安全性。 儿出生缺陷的发生率,带来极大的经济效益和良好的社会效益。 价格低 且安全无毒、 大小与滋养细胞相仿, 目前我们已经成功研制出理想的微磁球, 们从国内外文献报道中筛选出两种抗滋养细胞抗体,即抗 HLA-G 、 CK-7 单克隆抗体, HLA-G 特异性作用于母胎界面的滋养层细胞,而 CK-7 对三种类型滋养层细胞均有表达。 5 廉,正在进行微磁球与单抗的有效交联实验,宫颈管微栓也在制备过程中。与 此同时,我 前诊断技术,则必将使未来的产前诊断方法更加简便、安全、快捷和普及,从而降低新生 分离脱落的胎儿细胞, 进行遗传学分析, 从而探讨应用宫腔脱落滋养层细胞进行无创性产 但因取样及检测方法效率等各方面的限制, 目前仍处于临床实验阶段, 越来越多的学者倾 等人联合单克隆抗 %( ), %( ), %( 等人通过免疫组化对多个单克隆抗体2008 年暨南大学硕士学位论文 采用获取滋养细胞阳性率最高的宫腔冲洗法进行经宫颈 本研究属于整个课题的前期部分, 结合滋养细胞的自身 利用上述两种抗体对所收集细胞样本进行免疫细胞化学染色, 取样, 形态学特点,将收集到的滋养细胞与其它细胞鉴别开来,并观察抗 HLA-G 、 CK-7 抗体对 早孕滋养细胞的识别情况。 目的在于: ?了解孕早期宫腔下段脱落滋养细胞的存在情况; ?重新探讨宫腔冲洗法用于产前诊断研究的安全性及有效性; ?计算抗 HLA-G 、 CK-7 单克隆抗体各自识别宫腔冲洗标本中滋养细胞的 敏感度和特 异性,比较这两种抗体对滋养细胞的识别率差别有无统计学意义; 富集胎儿细胞行 包被于宫颈微磁栓、 ?探讨这两种抗体用作胎儿细胞特异性标记物, 孕早期产前诊断研究的可行性。 62008 年暨南大学硕士学位论文 材料与方法 1 ?受试对象? 选择深圳市人民医院 200 7年6月 ~2008 年 3 月间,在生育科门诊手术室自愿要 求终止妊娠( termination of pregnancy ?, TOP )的健康早孕妇女。病例纳入标准:?6~10 4 征象;?未服用子宫收缩药物或前列腺素类似物促宫颈成熟。? 孕周的确定:月经规则者依靠停经天数而定;月经不规则者依靠 B 超纠正孕周?[7 周 以内:孕囊最大径线(cm)+3;7~12 周:头臀长(cm)+6.5]。? 阳性对照:人流术后新鲜的绒毛组织。? 阴性对照:同时在计生科门诊手术室做输卵管通液检查的未孕妇女。 2实验方法? 2.1??实验材料? 实验用品: 阴道窥器、 宫颈钳、 卵圆钳、 碘伏棉球及棉签、 无菌纱布、 无菌注射器 (10 ml 、 20 ml ) 、人工受精导管、离心管(2 ml 、14 ml ) 、烧杯、匀浆机(天津欧诺仪器仪表有限公 司) ( 微量移液枪 盖玻片、 硅化防脱载玻片、 、 Eppendorf 公司) 免疫组化染 移 液枪吸头、 、 色孵育盒、免疫组化油笔、塑料洗瓶、定时器、低速离心机( Labnet International, Inc. ) 、 倒置显微镜(日本 Olympus ) 、光学显微镜(日本 Olympus ) 。? 标本固定液(由本院检 验科刘瑜医生惠赠) 、中性树胶, Monoclonal Antibody to HLA-G Purified Antibody Exbio 购得),鼠抗人细胞角蛋白 7 免 疫组化单克 隆抗体 ( Mouse Anti-Human Cytokeratin 7 Monoclonal Antibody , 克隆号: OV-TL 12/30+72.2 ) 、 TM 即用型快捷免疫组化 Vision 试剂盒(鼠) 、DAB 显色试剂盒、 0.01M 磷酸盐缓冲液 ( phosphate buffer saline , PBS )等(均由福州迈新生物技术开发有限公司购得) 。? 2.2??宫腔冲洗法取样? 纱布擦净宫颈外口处粘液, 将连接 10 ml 规格注射器的人工受精导管 (长 10 cm , 直径约 2 mm ) 伸入宫腔,超过宫颈内口约 2~3cm(距宫颈外口约 6~7cm) ,缓慢注入 10ml 无菌生理盐 7 暴露并消毒阴道、宫颈,用无菌 实验组妇女排空膀胱后,取截石位,常规消毒铺巾, (克隆号:4H84,由捷克 去离子水、30%过氧化氢溶液、细胞 实验试剂:无菌生理盐水、无水酒精、二甲苯、 天无性生活;?无先兆流产 ?近 孕周之间;?无明显妇科炎症,如宫颈炎、阴道炎等;2008 年暨南大学硕士学位论文 14ml (0~8ml 同时记录回收液量 的无菌离心管中备用。 不等) 并按照回收液颜色和性质 , 分为淡黄色混浊和可见血污染两种情况。TOP 妇女遂行负压吸宫术终止妊娠。在整个操作 过程中,受试对象均吸入了笑气(N 2 宫腔冲洗液,作为阴性对照)亦放入无菌离心管中备用。? 2.3??宫腔冲洗液样本处理? 将收集到的宫腔冲洗液进行离心,1000 转/分×5 分钟(1000r/min×5min) ,倒去上 清液后加入 PBS 再次离心 1000r/min×5min,弃去上清液后将底液混匀,用 1ml 移液枪吸 头转移到 2ml 加入适量 的离心管内, 再次离心 PBS, 用移液枪吸头吸去 500g/min×5min, 部分上清液,保留细胞底液备用。样本可见明显血细胞污染者,加低渗处理。? 2.4??绒毛组织制作细胞悬液? 放入匀浆机样本 生理盐水冲洗数遍, 用烧杯收集负压吸宫术后的部分新鲜绒毛组织, 加入适量 槽内, 匀浆 PBS, 2 用 分钟后, 20ml 用无菌纱 注射器吸取部分绒毛组织匀浆液, 转移至 布过滤两次, 14ml 加入 离心 弃去上清液, 无菌离心管中, PBS 1000r/5min×5min, 再次离心,1000r/min×5min,弃去上清液,保留细胞底液备用。? 2.5?涂片固定用移液枪吸头将上述底液吹打混匀后, 吸取适量底液, 然后放置室温下风干, 必要时在酒精灯外焰瞬间高温烤干, 减少细胞脱片。待涂片完全干燥后,加入适量细胞标本固定液,室温下固定 90~120 秒, 遂由 PBS 冲洗 3 每次 次, 3 进入下面的免疫细 并用油笔圈定细胞样本的反应区域, 分钟, 胞化学试验(以后的步骤一定要避免载玻片上的细胞样本干燥) 。? 2.6?免疫细胞化学实验? 进行免疫细??将上述绒毛组织制作的细胞悬液及通液术中收集的标本离心涂片固定后, 胞化学染色,通过方阵滴定摸索出第一抗体的最适反应浓度( Anti-HLA-G Mab 浓度为 1: 100; Anti-CK-7 Mab 浓度为 1: 400) 及 DAB 的显色时间, 确保有抗原表达的细胞显阳性 (阳 染色明显 胞核呈浅蓝色, 胞浆及胞膜内有棕黄色颗粒沉着, 性细胞即镜下 组织结构清晰, 高于背景) ,同时避免非特异性染色。然后根据摸索的最佳反应条件进行如下实验。 8 以增加细胞与载玻片的粘合力, 张, 并在倒置显微镜下调节细胞浓度, 避免细胞层过厚导致细胞重叠。 1~3 每个样本涂片 在硅化防脱载玻片上进行涂片, 选择同时在人流室做输卵管通液检查的未孕妇女, 通液术后回抽收集到的液体 (类似 O)以麻醉镇痛,无主诉腹痛、腹胀等不适。? 射器,导管边旋转边退出。如有反流者,将流至窥器后叶上的冲洗液回收,将回收液放入 水,然后让患者抬高臀部,稍停片刻后,使注射器低于宫颈口水平,即用适当力量回抽注2008 年暨南大学硕士学位论文 2.6.1?甩干载玻片上的 PBS,在油笔圈定的反应区内加入 3%过氧化氢溶液(由 30%过氧 化氢加去离子水配制) 室温孵育 , 30 然后由 以阻断内源性过氧化物酶的活性, 分钟以上, PBS 冲洗 3 次,每次 3 分钟。? 2.6.2?除去 每张涂片加入适量一抗 PBS, Anti-HLA-G Mab 或 Anti-CK-7 Mab (保证细胞样 避免出现气泡) 本完全覆盖, 在免疫组化孵育盒内室温孵育 , 1 PBS 小时。 冲洗 3 每次 次, 3 分钟。? TM 2.6.3?除去 PBS,每张涂片加入适量二抗,即即用型 Vision 分 钟。PBS 冲洗 3 次,每次 3 分钟。? 2.6.4?除去 PBS,每张涂片加入 DAB 显色液 (根据 DAB 试剂盒说明现配制) , 1~ 3min,并在显微镜下掌握显色程度。去离子水冲洗。? 2.6.5?苏木素复染数秒,自来水充分冲洗。? 2.6.6?梯度酒精脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封片。? 2.6.7 在光学显微镜下观察每张细胞涂片的染色情况(包括总体细胞形态及分类,阳性染 色细胞数量及形态) ,并做好记录,拍照存档。 3??统计学处理? 分别计 计算宫腔冲洗法获取滋养细胞的阳性率及滋养细胞占收集细胞样本的百分比; 算抗 HLA-G 、 CK-7 单克隆抗体识别孕早期宫腔冲洗样本中滋养细胞的敏感度和特异度, 2 并通过 χ SPSS11.5 统计软件包) 的识别率差别有无统计学意义。9 ,观察这两种抗体对宫腔冲洗样本中滋养细胞 检验(采用 室温下显色 15 试剂,室温下孵育2008 年暨南大学硕士学位论文 结果 1 ?宫腔冲洗收集细胞标本中主要细胞类型及形态学特点? 1.1?滋养细胞主要分为合体滋养细胞 ( syntrophoblast , ST ) 和细胞滋养细胞 cytotrophoblast , CT CT 核圆浅染或呈小泡 微嗜碱, 呈颗粒状, 胞浆透明, 细胞界清, 多角或卵圆形, 呈立方、 而 状; ST 染色质聚集在 内有多个小而深染的核, 毛玻璃样或细颗粒状, 胞浆丰富嗜双色, ( 中间型滋养细胞 无核分裂相活动。 核的周边如钟面, intermediate trophoblastic cell , IT )是滋养细胞分化过程中的一个过渡阶段,多表现为 EVT ,尤以胚泡植入部位的蜕膜中多见, 多分布于内膜螺旋动脉周围。形态学上,? IT ?介于 CT ?和 ST ?之间,光镜下表现为 IT ?胞体较 大,卵圆形、多边形或梭形,细胞边界不清,胞浆嗜伊红或嗜双色,比 ST ?浅染,多数为单核, 极少数为双核或多核,核卵圆或分叶,?但大小形状常不甚一致。 当 IT 的核很大,染色质丰富 易和蜕膜细胞及螺旋动脉的血管平滑肌细胞 深染,核形扭曲不规则,有多个较深的核裂时, 鉴别。? 1.2??子宫内膜细胞? 有时 常常呈裂隙状, 致密层腺体较少且分散,??晚期分泌期内膜逐渐向早孕内膜改变, 细胞逐渐变成蜕膜细胞,呈多边形,相嵌成砖砌状排列,胞浆丰富,其中 RNA、糖原及各 又称 如鞋钉样, 突出于细胞的顶部, 形状不一, 大深染, A-S ( 反应 Arias-Stella reaction ) 。1.3?子宫颈内膜细胞? 形或卵圆形,染色质分布均匀,胞浆易分解而留下裸核;带纤毛细胞呈立方形或矮柱状, 带有纤毛,核为圆形或卵圆形,位于细胞底部。 1.4??鳞状上皮细胞阴道及宫颈阴道部上皮细胞分为表层、 中层及底层, 10 逐渐成熟,鳞状细胞由小逐渐变大;细胞形态由圆形变为舟形、多边形;胞浆染色由蓝染 女性一生中不同时期及月经周期中不同时间, 各种细胞比例均不相同。 细胞由底层向表层 其生长与成熟受卵巢雌激素影响, 根据其细胞形态,分为粘液细胞和带纤毛细胞。粘液细胞呈高柱状,核在底部,呈圆 呈簇状向腔内突起,胞核不在一个平面上,核 旺盛,腔内有分泌物,上皮细胞胞浆透亮, 腺体扩大、弯曲、分泌 种酶的活性均增加,血管腔扩大、壁薄。海绵层腺体比致密层多, 腺体逐渐消失,而后成为血窦。间质蜕膜样 腔扩张,内衬立方或偏平上皮,随孕周增加, 。2008 年暨南大学硕士学位论文 多边形,胞浆薄,透明;胞浆粉染或淡蓝,核小固缩。 1.5??血细胞包括母体红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等,形态学上与其它细胞易区别。? 1.6??光镜下各种细胞形态学鉴别? 部分子宫腺上皮尚保存腺体 宫腔冲洗液涂片中各种细胞散在分布, 与组织切片不同, 但其散在的各种细胞形态与非孕 胞核大小及核浆比等方面亦可鉴别, 从细胞形态、 结构, 故特请深圳市人民医院病理科具有多年临床经验的细 期宫颈液基细胞学检查又有所不同, 中的细胞学 《妇产科诊断病理学》 并结合2002年陈乐真主编的 胞学专家彭树松老师阅片, [32] 诊断标准 ,以明确各种细胞类型。 2 ?宫腔冲洗液涂片的免疫细胞化学染色结果统计以抗 HLA-G 、 CK-7 单克隆抗体作为特异性指标对 86 例宫腔冲洗液标本进行随机的 ICC 研究,其中 50 HLA-G 抗体染色,36 例进行了抗 CK-7 抗体染色。根据滋 养细胞形态学鉴定标准,86 例宫腔冲洗液标本中共有 63 例收集到了滋养 细胞(每例出现 滋养细胞的数目?1 个) ,阳性率 73.3%。阳性细胞为镜下组织结构清晰,胞浆及胞膜内 结果宫腔冲洗液涂片中抗 染色明显高于背景。 胞核呈浅蓝色, 有棕黄色颗粒沉着, HLA-G 抗体可见滋养细胞特异性染色,而抗 CK-7 抗体对滋养细胞及子宫腺上皮细胞均呈阳性染 色,如图示 1-2。2.1 Anti-HLA-G Mab 作为一抗的宫腔冲洗液涂片的免疫细胞化学结果分析? 50 例抗 HLA-G 37 根据细胞形态学鉴定标准, 抗体染色的宫腔冲洗液涂片标本中, 例 而仅有 收集到了滋养细胞, 22 其余 例呈滋养细胞特异性染色; 13 例未收集到滋养细胞标 本,只有 1 例呈假阳性染色。具体数据如表 1。 表 1??抗 HLA-G 单抗鉴定宫腔冲洗液涂片免疫细胞化学试验中滋养细胞情况 形态学观察有无滋养细胞病例数? Anti-HLA-G Mab合计+?-? ICC 病例数? + 22 123 - 151227 合计? 371350 11 例进行了抗 其中表层细胞:细胞大,为 变为粉染;胞浆由厚变薄;胞浆由大变小,由疏松变成致密。2008 年暨南大学硕士学位论文 由表 1 的数据可以求得:? 抗 HLA-G 抗体识别滋养细胞的敏感度为:22/37×100%=59.5%;? 抗 HLA-G 抗体识别滋养细胞的特异度为:12/13×100%=92.3%。? 2.2 Anti-CK-7 Mab 作为一抗的宫腔冲洗液涂片的免疫细胞化学结果分析? 36 例抗 CK-7 26 根据细胞形态学鉴定标准, 抗体染色的宫腔冲洗液涂片标本中,例收 有 集到了滋养细胞, 23 其余 例出现滋养细胞阳性染色; 10 其 例未收集到滋养细胞标本, 中 9 例子宫腺上皮细胞呈阳性染色。具体数据如表 2。 表 2??抗 CK-7 单抗鉴定宫腔冲洗液涂片免疫细胞化学试验中滋养细胞情况 形态学观察有无滋养细胞病例数? Anti-CK-7 Mab合计+-? ICC 病例数? +?23??9?32? -??3??1??4? 合计??26?10?36 由表 2 的数据可以求得:? 抗 CK-7 抗体识别滋养细胞的敏感度为: 23/26×100 %= 88.5%;? 抗 CK-7 抗体识别滋养细胞的特异度为: 1/10×100 %= 10%。? 2.3??抗 HLA-G 、 CK-7 抗体对宫腔冲洗液涂片中滋养细胞识别率比较63 抗 例收集到滋养细胞的宫腔冲洗液标本, HLA-G 、 CK-7 单抗识别滋养细胞的情况 如表 3 示。 表 3??抗 HLA-G 、 CK-7 单抗对宫腔冲洗液涂片中滋养细胞识别率的比较? 单抗?有效??无效?合计?识别率(%)? 抗 HLA-G?22?15??3759.5? 抗 CK-7?23??3??2688.5? 合计??45?18??6371.4 2 2经四格表资料 χ 检验( Pearson Chi-Square ) , χ = 6.29 , P0.012。按 α = 0.05 水准, 122008 年暨南大学硕士学位论文 可以认为这两种单克隆抗体对宫腔冲洗液涂片中滋养细胞的识别率差别有统计学意义。 3 宫腔冲洗液样本中滋养细胞出现比例? 随机抽取已收集到滋养细胞的宫腔冲洗液样本 20 例,分别在光镜下计数涂片中 200 核细胞数的 0.5%~7%。 4 ?收集样本质量的统计分析? 4.1?宫腔冲洗回收液量? 92 例 TOP 妇女均采用 10ml 无菌生理盐水进行宫腔冲洗,由于子宫位置(前位子宫易 6 集到任何冲洗液,无法进行后续实验) ,取材成功者共 86 例,取材成功率 93.5%,平均回 收液量 3.2ml。? 4.2?血细胞污染程度? 86 例取材成功标本中, 占取材成功标本的 33.7%。 13 例, 29 而可见血细胞污染的标本 例, 57 回收到淡黄色混浊液有 例未收 不等(其中 0~8ml 、宫颈口松弛度不同,所回收液量 反流,后位子宫不易回收) 个有核细胞, 根据形态学鉴定标准, 每例宫腔冲洗液标本中出现滋养细胞的数目占总体有2008 年暨南大学硕士学位论文 图 1腔冲洗液涂片 早孕宫 ICC 病例( Anti-HLA-G Mab 光镜× 200 倍: “ ? ” 示 单 个滋养 细胞 染色 + , “ ? ” 示成 团出 现的子宫腺上皮细胞染色( - )图 2腔冲洗液涂片 早孕宫 ICC 病例 Anti-CK-7 Mab ) 光镜× 200 倍: “ ? ” 示滋 养细胞 + ,而 “ ? ” 示 母 体腺上 皮细胞也呈染色 + 142008 年暨南大学硕士学位论文 讨论 1 ?孕早期宫腔下部胎儿细胞的存在情况? 我们在孕5~7- 并达宫颈部位的设想, 根据孕早期胚胎绒毛可退化脱落至宫腔下段, [30] 究。多数学者认为经宫颈取样获取滋养细胞最佳时机为 6~ 10周。只有Fang等人 对不同 孕周收集滋养细胞进行了统计分析, 得出了孕周越大, 本文作者赞同大多数学者的观点,在妊娠 6周时,胚胎被周围的胚膜包绕,而胚膜被三级 绒毛覆盖,在孕 12~14 周,仅剩下叶状绒毛膜,胚极外的绒毛已退化成平滑绒毛膜。经子 孕 脱落细胞较多的时候。 应选择在绒毛完全退化之前, 宫腔下部取样行产前诊断, 40天前 取样,宫颈内口紧,不易操作,而孕 70天后取样,若需终止妊娠,则对母亲有较大损伤。 本研究中所选病例均在 6~ 10孕周之间,故未再对孕周进行分层分析。 其中脱落滋养细胞占所收集细胞的比例 混有大量母体细胞。 经宫颈收集细胞样本中, 故目前没有统一意见。 检测方法的不同而有所不同, 可随取样方法、 大小, Zhao 在 2005年 对 30名继续妊娠妇女进行宫腔冲洗,回收的胎儿滋养细胞数目变化不一,波动在 0.53%~ [33] [34] 63% ; Kingdom 等人 报道宫颈管冲洗样本中回收的胎儿细胞(利用了 FISH 的 XY 双色 频数为 探针) 2%~ 8 滋养细胞占有核细胞总 而本研究成功收集到滋养细胞的病例中, %; 相比,经宫颈取样对孕妇心理及生理上的影响极小,如果首次取样失败,可在 1周后重复 取样。? 一步研究。 2宫腔冲洗法 样本收集到滋养细胞的成功率不等( 40%~ 90%) ,主要取决于孕周、收集方法、术者的 距宫颈外 (导管越过宫颈内口、 本实验采用了宫腔冲洗法 熟练程度和检验方法的敏感度。 口约 6~7cm 注入无菌生理盐水 , 10ml 即用适当力量边旋转导管边回抽) 稍停片刻, , 材 15 ,取 经宫颈取样有拭子法、吸取宫颈粘液、细胞刷、宫颈管或宫腔冲洗等五种方法,细胞 学分析, 但退化脱落的滋养细胞是否具有活性、 其用于产前诊断的敏感性及可靠性尚需进 较之母血中极少的胎儿细胞, 经宫颈取样收集到滋养细胞的数量, 足以进行胎儿遗传 数的百分比则为0.5%~7%。在取样过程中,孕妇均无腹痛、腹胀等不适。与羊膜腔穿刺 样本中的胎儿滋养细胞越少的结论。 13~15周之间经宫颈取样, 均应收集到携带有胎儿遗传信息的滋养细胞, 进行产前诊断研2008 年暨南大学硕士学位论文 成功率达 93.5%,平均回收液量 3.2ml ,但仅有 73.3%的病例收集到滋养细胞,而可见血细 胞污染标本占取材成功病例的 33.7%。为减少操作的有创性,本研究采用了长约 10cm ,直 径约 2mm 的人工受精软管,因条件限制,没有在 B 超引导下进行宫腔冲洗,相应减少了回 收冲洗液量,从而使本实验中收集到滋养细胞的阳性率低于文献报道。 冲洗液量及回抽力量不 子宫位置、 导管进入宫腔深度、 因不同术者的操作熟练程度、 同,使用宫腔冲洗法所收集到的细胞标本液量不同,实验的可比性差,若无 B 超引导,操 [35] [16] 一例少见的胎儿肢体缺陷联系起来 , 而 Rodeck 等人 ?对130例孕早期妇女在进行经宫颈 与只进行 CVS之前抽吸宫颈粘液, CVS 该法没有增加 并观察影响妊娠情况, 的对照组相比, 流产和死产; Zhao 等人观察了 30 随访研 例进行宫腔冲洗收集滋养细胞并继续妊娠的妇女, [36] 究中未见母亲和胎儿出现