牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究

牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物 与种植体周病变的相关性研究 目??录? 中文摘要1? 英文摘要3? 前?言5? 1.种植体周病变概况?5? 2.种植体周微生物学研究??6? 3.种植体周病变的检测方式?8? 材料和方法?10? 1.实验材料及设备??10? 2.实验方法?12? 结?果??17? 1.七种牙周可疑致病菌检测情况?17? 2 .牙周可疑致病菌与种植体周病变的关系18? 3.电泳图谱?19? 讨?论??30? 结?论??37? 附?图??38? 参考文献??41? 致?谢??47? 附?录??483暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 中 文 摘 要 目的:? 1. 检测健康及炎症种植体龈下菌斑中 7 种牙周可疑致病微生物的定殖情况;? 2. 探讨牙周可疑致病微生物与种植体周围炎症及骨吸收的关系;? 3. 探讨种植体周病变的微生物学病因, 寻找能早期反映种植体周病变的主要致病 微生物;? 4. 探索早期诊断及早期防治种植体周围炎的方法。 方法:? 1.?病例收集分组:?选择种植修复后 12个月以上的 88位患者的 89颗种植体, 分三组 ?种植体周围炎组 ?29 例 29 颗种植体周围炎患者、 ?种植体周粘膜炎组 ?29 例 30 颗种植体周粘膜炎患者、?并随机选取 30 例成功病例 30 颗健康种植体作对照 组。2.?临床检查:记录所有研究对象的种植体探诊深度并拍摄全口曲面体层片。侧的近中至远 (唇) 由同一名医师从每个种植体的颊 3.?龈下菌斑的采集及 处理: 中用无菌碳纤维刮治器收集龈下菌斑,标本立即置入1ml?PBS溶液中、-?20? 冻存。? 4龈下菌斑 DNA 的提取。5( 聚合酶链反应 PCR 检测临床标本中的 检测标本中的微生物: ) 7 种牙周可疑致 病微生物: 伴放线放线杆菌 A.a ? 、 中间普氏菌 ( P.i ) 、 牙龈卟啉单胞菌 ( P.g ) 、 齿垢密螺旋体 ( T.d ) 、 变黑普氏菌 ( P.n ) 、 直肠弯曲菌 C.r 、 福赛拟杆菌 ( B.f ) 的分布情况。? 结果:? 1. 三组中各种细菌的检出率各不相同 ?种植体周粘膜炎组T.d 、 P.i 和B.f 的检出率高于健康组,种植体周围炎组 P.g 、 B.f 、 T.d 、 P.n 种植体周围炎组的 的检出率高于健康组,P.g 、 T.d 、 P.n 高于种植体周粘膜炎组,差异均有统计学意义(P<0.05)。?A.a 和 C.r 的检出率在 3 组间差异无统计学意义(P>0.05)。 4暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 2 .进行 logistic , 发现 P.g 、 T.d 和P.n 三种细菌对种植体周围炎的 影响较为显著 OR 值分别为 5.830、 61.037和 3.672,均大于 1 。? 结论:? 1 与种植体周围软硬组织健康相关的微生物,主要集中在 P.g、 P.i 、 P.n 、 B.f 、 T.d ,这些菌种的协同作用很可能就是种植体周围炎的致病因素;当 P.g、 T.d 和 P.n 共同出现时对种植体周围骨吸收影响较为显著; P.i 、 T.d 、 B.f 增多时, 种植体龈沟有加深趋势; 种植体周围炎可能是引起种植体周粘膜炎的致病菌进 一步繁殖增生造成。3. 采用聚合酶链反应扩增 16SrRNA 基因 16SrDNA 片段的方法, 可以准确地检测 有助 这种方式有望早期发现种植体周围炎, 种植体周特定的可疑致病微生物, 于及时防治种植体周围炎的发生。 关键词:种植体周围炎 聚合酶链反应牙周可疑致病菌? 种植体周粘膜炎5 逐步回归分析暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 Abstract Objective: 1. To detect the colonization of 7 subgingival suspected pathogens in partial edentulous patients with and without peri-implantitis 2. To investigate the relationship of periodontal suspected pathogens, peri-implantitis and the bone loss 3. To investigate the microbiologic pathogeny of peri-implantitis, and to find the main pathogen of peri-implantitis in the early stage4. To find a method to diagnosis peri-implantitis with early prevention and treatment Methods:? 1. 88 patients with 89 implants were divided into 3 groups: 1 peri-implantitis group, 29 peri-implantitis-patients with 29 implants 2 peri-mucositis group, 29 peri-mucositis-patients with 30 implants 3 healthy group, 30 healthy patients with 30 implants by random2. Peri-implant pocket depth PPD and oral pan tomography was recorded as clinical parameters3. Buccal subgingival plaque was collected from mesial to distal by same dentist with non-bacterial carbonous fibred tool 4. DNA of subgingival plaque was distilled5. Colonization of 7 periodontal suspected pathogens was detected by polymerase chain reaction PCR: A. actinomyceremcomitans A. a 、 P. intermedia P. i 、 PgingivalisP. g 、 Treponema denticola T. d 、 P nigrescensP. n 、 Campylobacter rectus C. r 、 Bforsythus B. f Results:1. Prevalence of these 3 groups was different ? Higher detection of B.f 、 P.i and T.d was found in peri-mucositis group than in6暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变 的相关性研究 healthy group. Higher detection of P.g 、 B.f 、 T.d and P.n was found in peri-implantitis group than in healthy group. Higher detection of P.n 、 P.g and T.d was found in peri-implantitis group than in peri-mucositis group. There is significant difference among these 3 groups ? No significant difference existed among these 3 groups in detections of A.a and C.r (P>0.05) 2. Logistic analyze: P.g 、 T.d and P.n played an important role in peri-implantitis. OR 5.830、 61.037 and3.672Conclusion: 1P.g 、 P.i 、 P.n 、 B.f andT.dare major bacterium that relate with soft and hard tissue around the implant, especially with peri-implantitis. P.g cooperated with P.n and T.d ,? might cause bone loss around implant. When the detection of P.i 、 T.d and B.f increase, peri-implant pocket depth has deepened trend; The further reproduction of pathogens of peri-mucositis may be the reason for peri- implantitis 2 Suspected pathogens of peri-implantitis were detected by using 16SrRNA based PCR, which could be helpful with early diagnosis 、 prevention and cure of peri-implantitis Keywords: Peri ? implantitis ; Polymerase chain reaction ; suspected pathogens ; Peri ? mucositis7 (P<0.05)暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的 相关性研究?前?言 1种植 体周病变概况自20世纪60年代, Branemark教授创立的骨结合理论 奠定了现代口腔种植学的 生物学基础,40多年来,国内外学者进行了大量的基础研究和临床实践,口 腔种 植学已成为当今口腔医学领域中发展和普及速度很快的一门分支学科。种植修复 已逐渐成为临床上牙列缺损和缺失的常规修复方式,随着种植理论和应用技术的 日益完善,种植牙越来越被普通大众所接受。? 种植修复的一个重要问题,就是如何正确评价种植修复后种植体的状态,如 何判断种植修复的效果,但到目前为止,还没有一个公认的客观的 评价 标准。其 [1]中 Albrektsson 等 在 1986 年提出种植义齿成功的标准较为通用,包括?动度:临 种植 ?骨吸收程度: 种植体周围无透射影。 ?X线片: 床检查单个种植体无动度。 体植入后第一年内,骨吸收应小于2mm,一年以后平均每年骨吸收应小于0.2?mm。 ?无并发症:种植后无持续性和不可逆的下颌管、上颌窦、鼻底组织的损伤、疼 痛、感染、麻木,无感觉异常症状。?按上述检测指标,5年成功率达85?以上, 10年成功率达80?以上。随着口腔种植技术的快速发展,种植体结构本身的不断 改进,按以上种植成功的定义,现在很多种植系统的随访结果可达更高的10 年成 功率。但是即便如此,正如所有临床医疗活动一样,口腔种植治疗也存在着失败 现象,种植失败的原因可以是牙槽骨的局部条件欠佳、种植义齿的设计不合理, 或因患者的全身系统性疾病象糖尿病等造成,而患者的不良生活习惯如抽烟也会 增加种植失败的机率,但导致种植后失败的最主要原因是种植体周围的炎症。种 植体周围炎 Peri - implantitis [2] 统的发病率大约在 4% ~ 15% 之间 。目前在种植体周围炎症的诊断标准的制定上还存在分歧,种植修复后的种植 体不良预后可分为 ?有问题的成功种植体:成功骨结合的种植体周围粘膜有炎 症、增生或瘘管形成;?失败中的种植体:有进行性的骨吸收,但种植体仍能行 种植体松动, 种植体周围存在不可控制的感染, ?已失败的种植体: 使咬合功能; 由于 对于这种一般无法保留。 X线片显示种植体周围有透射区, 不能承受咬合力, 8 作为种植修复后的常见并发症之一,不同的种植系暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 种植体周围病变的复杂性和缺少有效的检测指标,对种植体周围组织的健康状况 的临床评价目前仍然没有完全统一的意见。根据炎症累及范围可将种植体周围组织病变分为两类:种植体周围炎peri -implantitis及种植体周粘膜炎peri-mucositis, 均为细菌感染引起的炎症 [3,4] 性疾病 。? 种植体周粘膜炎是指炎症局限于种植体周的龈粘膜,不累及骨组织,及时治 疗可使病变逆转,临床现为种植体周围粘膜红肿、探诊出血甚至溢脓,但不伴 骨吸收,主要是由于口腔卫生不良,菌斑刺激导致。? 种植体周围炎是发生在骨性结合种植体周围软组织和硬组织的炎症,导致种 植体周围骨丧失形成种植体周围袋,从而导致骨性结合失败。种植体周围炎作为 [5, 6] 种植修复常见并发症是造成种植义齿修复后失败的主要原因 。种植体与周围 软、硬组织的结合界面和天然牙的牙周组织有很大差别,种植体的穿龈部分被口 腔软组织环绕,称为种植体的袖口,该处的结合上皮附着形成了种植体周的生物 [7] 封闭,起屏障作用。但其结合上皮相对天然牙而言薄而窄 [8] 环形排列,成纤维细胞及血管较少,存在相对的无血管区 除了位于牙槽骨上方的胶原纤维, 种植体与骨之间没有牙周膜, 界面为骨性界面, 就没有其它任何结缔组织,周围软组织附着较天然牙更弱,容易被种植体周围致 病菌产生的内毒素及其代谢产物侵袭、破坏,导致炎症发生,且炎症进展较牙周 [9] 炎迅速,最终发生种植体周围骨吸收致使种植体脱落 发展就可能引起种植体周围炎,两者的主要区别在于病变是否累及骨组织及病变 的可逆性。 2.?种植体周微生物学研究 [10] 随着对种植体周围炎的病因学、微生物学等方面的逐步深入研究 ,细菌感 [11] 染被认为是造成种植体周围炎的重要因素 。 种植术后细菌黏附于种植体的 表面, 形成牙菌斑, 有研究认为细菌在金属材料表面上的附着和口内菌斑形成有所不同, [12] 受细菌自身的附着能力的影响 [13] 其表面黏附细菌的种类、数量的重要因素 9 。种植体龈下的微生态环境的变化对 ,并且种植体材料表面的化学成分被认为是决定 。种植体周粘膜炎若继续 ,骨内种植体硬组织 ,周围的胶原纤维呈暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 细菌附着产生了怎样的影响,目前国内少见报道。[14.15] 种植体周围炎和牙周炎的临床表现极为相似,也有相似的病理过程 ,细 菌是引发牙周病必不可少的始动因子,按 1996年世界牙周病研讨会上专家公认的 比如伴放线放线杆菌 牙周病有关致病微生物是革兰氏阴性菌和螺旋体, A.a 龈卟啉单胞菌 P.g 福赛拟杆菌 、 B.f 中间普氏菌 、 P.i 具 、 F.n ( 肠弯曲菌 C.r ( 齿垢密螺旋体 、 ) T.d ( 变黑普氏菌 、 ) P.n ( 及 中间链球菌 ) S.i ) 等。种植体周围炎症与牙菌斑聚集的因果关系在人类和动物模型上已经得到证实 [16] 。 1997年 Hanish 和 Eke 等的动物实验表明在种植体周围炎的种植体周可检测到与 牙周炎有关的牙周致病菌,如牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌,暗视野显微镜 观察发现: A.a 与 P.g 由丝线结扎前的 1%上升到 10%,链球菌由 40%~ 60%减少到 [17.18] 0.2%~ 0.5%,球菌减少,革兰氏阴性杆菌和螺旋体的数量增加 。一些学者通过对种植体周围炎龈下菌斑的检测认为,种植体周围炎与牙周炎 [19-21] 龈下菌斑的菌群较为类似 ,而种植体周粘膜炎的病变局限于龈粘膜,类似牙 [22] 龈炎。 Sanz 曾在 1990 年研究了骨内种植生物陶瓷种植体的微生物情况,比较了 - 种植体周健康与有炎症部位的菌斑成份, 也发现炎症部位为高比例的 G 厌氧杆菌, + [23] 而健康部位则只有少量的细菌且以兼性的 G 球菌为主。 Buser等 者的有种植体周围炎的种植体及成功种植体的龈下菌群构成,发现有显著差异, 患有种植体周围炎的种植体周标本微生物培养结果41%以上为革兰氏阴性杆菌, 兼 性厌氧杆菌及梭形杆菌明显增高,并有较高比例的螺旋体存在,而成功种植体周 的微生物表现为兼性厌氧球菌为主,?未发现螺旋体及牙龈卟啉单胞菌等革兰氏阴 性厌氧杆菌。? Mombelli研究认为,种植体周致病菌主要由革兰氏阴性厌氧菌、产黑色素厌 氧杆菌和螺旋体组成,如伴放线放线杆菌A.a、具核梭杆菌F.n、牙龈卟啉单 [24] 福赛斯拟杆菌B.f也可能为可疑致病菌 胞菌P.g及中间普氏菌P.i, 内 [25] 李梅等 定, 认为与种植牙周围软组织炎症和骨组织吸收密切相关的菌种是革兰氏阴性菌, [26] Quirynen等 P.i和F.n。 主要为P.g、 着情况,发现前者种植体表面的菌斑附着明显高于后者,其中P.g和P.i的检出率 尤为明显,认为部分缺牙患者种植义齿修复完成后,?其龈沟内细菌是种植体周围 10 对比了部分种植义齿和全口种植义齿菌斑附 对探诊出血和无探诊出血的种植牙进行了龈下菌斑标本的分离培养和鉴 。国 通过研究同一患 、直 核梭杆菌 、牙暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 [27] 余留天然牙龈沟内的细菌转移来的。 Leonhardt 种植体的龈下细菌进行了比较,发现两组细菌有很大的区别,种植体周围炎的龈 从而为治疗种 而健康种植体的龈下细菌与健康牙相同, 下细菌60%与牙周炎相同, 植体周围炎提供了微生物学基础。 3.?种植体周病变的检测方式??牙周病 学采用 的牙 周指数 可以 早期反 映牙 周炎症 ,但 还未发 现牙 周指数 与种 [28] 植体周病变之间存在显著或稳定的相关关系的研究报道。国内有学者 用种 植体 周围不同时间的龈沟液的量和检测其中的 天冬氨酸转氨酶及碱性磷酸酶含量水 平,来作为反映种植体周围组织健康状况的指标。国外也有推荐通过测量龈沟液 流速来定量评价种植体周围的炎症,但这一方法还只限于实验研究,未能在临床 常规使用。对种植体周围组织健康状况的判断,现在临床上一般通过肉眼观察和 X 线检查,但往往具有滞后性。为了提高种植体的长期成功率,需要一种有效且 适合临床使用的,能早期发现种植体周围炎的检测方式。? 通过检测种植体龈下微生物来对种植体周围病变进行监测时,可以采用多种 各种实验方法都可能导致主要致病菌检出的差异。 但因细菌的复杂性, 检测方法, 用微生物培养的方法对厌氧菌进行培养时,可以获得牙周可疑致病菌生理学方面 的信息,但无法确认人工环境中分离株的性状是否代表其在原栖息群落中的固有 生理状态。使用传统方法不但需要进行大量的培养工作,无法快速筛选检测,并 且牙周可疑致病菌多为厌氧菌,其分离培养困难重重,费时费力且准确性差,可 能无法真实反映致病微生物的状况。? 建立快速有效的检测方法,来研究细菌与种植体周病变的关系及作为种植? 体周病变预防和治疗的监测手段,具有非常重要的实际意义。随着分子生物学的 核酸探针、 如酶试验、 从分子水平鉴定口腔细菌已成为发展趋势, 进展, PCR 法 等,它们都具有易于操作、快速、准确、灵敏度高的特点。其中应用聚合酶链式 [29] 反应 polymerase chain reaction ,PCR 直接检测细菌 16S rDNA 来鉴别细菌 , 因为它的 近年来PCR法在口腔微生物的检测中应用较为广泛, 反应迅速。 作简单, 敏感性较培养法和间接免疫荧光法高许多,其它分子学技术要求样本中的细菌含 11 ?操 将37例种植体周围炎与57例健康暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 3 5 2 [30] 量至少要在 10 ~ 10 PCR 法能检测到 10 个以下的细菌 [31,32] 叉反应的机率较DNA探针杂交少,具有较高的特异性 。PCR法尤其适用于一些 [33] Leitao等 T.d?等。 较难培养的微生物比如?B.f、 种植体龈沟内A.a、P.g、P.i,认为即使没有明显的临床症状,但通过PCR定性发 现某些病原微生物仍可以预示种植体周围炎的发生。? 目前究竟哪些细菌与种植体周病变直接相 关还没有肯定的结论。发现引起种 植体周病变的特定病原微生物,早期诊断种植体周围炎从而进行有效防治,是当 前口腔种植学急需要解决的主要问题。 12 用PCR技术检测牙列缺损患者的 ,且出现交 个以上,而暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 材?料?和?方?法 1.?实验材料及设备? 1.1?实验设备 梯度 PCR 仪 PTC - 200?美国 BIO - RAD 公司? 凝胶成像系统 Gel - Doc2000?美国 BIO - RAD 公司? 凝胶 电泳 仪 PAC300?美国 BIO - RAD 公司? BioPhotometer EPPENDORF 公司? 高速冷冻离心机? 德国 HERMLE 公司? 紫外透射仪( GL - 31 )? 江苏海门仪器厂? 电子分析天平 BT2202S? 德国赛多利斯公司? 单道可调移液器 0.5- 10ul芬兰雷博 单道可调移液器 20-200ul芬兰雷博 单道可调移液器 100-1000ul芬兰雷博? 微波炉( D8017CTL-2H )? 广东格兰仕公司? 碳纤维刮治器 Goldman-Fox5 )? 北京福科斯公司? 高分子牙周探针( 9006106)? 北京福科斯公司? 净化工作台 SW-CJ-IFD 苏州安泰技术有限公司 旋涡混合器( XW-80 ) 上海第一医学院仪器厂 自封手提压力蒸汽灭菌器 广州华南医疗器械公司13 德国 蛋白核酸定量测定仪?暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物 与种植体周病变的相关性研究 1.2?实验材料和试剂 PCR 管( 50ul ) 美国 LABNET 公司 离心管( 1.5ml 美国 LABNET 公司 TIP 头( 200ul ) 美国 AXYGEN 公司 TIP 头( 20ul ) 美国 AXYGEN 公司 TIP 头( 1ml 美国 AXYGEN 公司 TagDNA聚合酶 大连宝生物工程有限公司 低熔点琼脂糖 西班牙 BIOWEST 公司 电泳缓冲液 TAE 大连宝生物工程有限公司 琼脂糖水平电泳槽 美国 LABNET 公司 溴化乙锭 青岛海泰生物技术有限公司 dNTP 大连宝生物工程有限公司 DNA Marker ( λ-Hind III digest ) 大连宝生物工程有限公司 DNA Marker ( DL2000 ) 大连宝生物工程有限公司 细菌基因组 DNA 小量试剂盒 美国 AXYGEN 公司 Extaq 酶 大连宝生物工程有限公司 寡核苷酸片段 美国 invitragen 公司 缓冲液: 242gTris,100ml10.5mol/LEDTA,57.1ml 充分搅拌溶解后定容至 冰乙酸, 1000ml, 临用时 稀释 100倍即为 0.5×应用液 14暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性 研究 2.?实验方法2.1??病例收集? 2005年1月至 2007 年 1 从到暨南大学第一附属医院口腔医疗中心 月间, 和中山大学第三附属医院口腔科复诊的临床资料完整的种植修复后 12 个 月以 上的患者中, 参考 Albrektsson 等在 1986 年提出的对种植体周围炎的诊 断指标, 收集 29 例患者 ?29 颗患种植体周围炎的种植体、 29 例患者 30 颗患种 植体周粘 并随机选 、 (其中一位患者有两颗患种植体周粘膜炎的种植体) 膜炎的种植体 取 30 例成功病例 30 颗健康种植体作对照,其男女比例分别为 17 ? 12 、 13 ? 16 、 16 ? 14 ,年龄分别在 36 ~ 65 、 31 ~ 64 、 30 ~ 59? 岁范围。种植系统有 Branemark 、 ITI 和 Frialit-2 种 系统。 植 :? ?全身无系统 性疾病,妇女非妊娠期,未服用避孕药;?近 3 个月内内未做过牙周治疗或 种植牙周的治疗, 2 个月内未服用过抗生素;?不吸烟;?无明显咬合关系 异常。? 2.2临床检查? 经患者知情同意后记录所有研究对象的种植体的探诊深度 PPD 状 况。在测量探诊深度时采用塑料牙周探针以 0. 2 N 的力量对每个种植体唇 颊 3个点的龈沟深度值进行检测。 用游标卡尺测量记录 拍摄全口曲面体层片, X 取 光片上植入体的长度, 植入体与基台的连接线距牙槽骨在植入体上附着的最冠方点的距离,矫 正了 X 光片的放大率后,计算出种植体周围实际牙槽骨吸收值。? 表 1周健康者和 种植体 种植体 周病变患者的一般情况及受检种植体的主要临床指标 分组 例数 男 : 女 平均年龄 点 取样位PPDmm 收值 骨吸 mm 30 16: 14 38.4 ? 3.230 2.06 ? 0.880.89 ? 0.34* * 29 17: 12 47.6 ? 4.829 4.48 ? 1.13 3.22 ? 1.27* * 29 13: 16 40.3 ? 6.530 3.42 ? 1.28 1.77 ? 1.05注 : PPD: 诊深度; 探 * : 健康对照组比较 与 , P 0.05 15 周粘膜炎组周围炎组? 健康组 侧的近中、正中及远中 患者共同的纳入条件是暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 2.3?龈下 菌斑的采集及处理? 以 89 侧的近中至远中为 (唇) 选择每个种植体的颊 颗种植体为采集对象, 先除去龈上菌斑并用气枪吹干牙 由同一名医师将取样位点隔湿后, 取样位点, ( 用无菌碳纤维刮治器 面, Goldman-Fox5 标本立即置入 收取龈下集合菌斑, ) 1ml PBS溶液中, - 20?冻存。 1M PBS: Nacl 18g, Na HPO .12H O 2.89g,KCL 2 4 2 0.2g,KH PO 0.2g加三蒸水至 1000ml ,用 HCL 调 PH 至 7.4 2 42.4 龈下菌斑 DNA 的提取 应用美国 AXYGEN 提供的小量细菌基因组 DNA 快速抽提纯化试剂盒进行 龈下菌斑 DNA 的提取 , 提取方法参照试剂盒操作手册。 操作步骤: 1. 用 1.5 ml 离心管收集 1.0× 109 ( 1 ml 菌液 OD600 为 1-1.5 的复合菌斑PBS ) 液, 12,000 × g 离心 30 s 用 , 150 μ l 已加入 RNase A 的 Buffer S 悬浮沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块,否则将影响溶菌效果。 2. 加入 20 μ l 溶菌酶贮存液,混合均匀,室温静置 5 min 。 3. 加入 30 μ l 0.25 M EDTA ( pH 8.0 ),混合均匀,冰浴 5 min 。 4. 加入 450 μ l Buffer G-A, 旋涡振荡 15 s , 65?水浴 10 min 。 5. 加入 400 μ l Buffer G-B 和 1 ml Buffer DV ( 4 用力混合, , ?预冷) 12,000 × g 离心 2 min 。 6. 尽可能丢弃上相,保留相间沉淀和下相。加入 1 ml 4 ?预冷 Buffer DV ,用 力混合, 12,000× g 离心 2 min 。 7. (滤器置于 将下相转移至滤器 丢弃上相, 1.5 ml 。 离心管中) 12,000× g 离 心 1 min 。 8. 弃滤器,在滤液中加入 400 μ l Buffer BV ,混合均匀。 9. 将制备管置于 1.5 ml 离心管中, 将步骤 8 中的混合液移入制备管中, 12,000 × g 离心 1 min 。 10. 弃滤液,将制备管置回到原 1.5 ml 离心管中,加入 500 μ l Buffer W1 , 12,000× g 离心 1 min 。 11. 弃滤液,将制备管置回到原 1.5 ml 离心管中,加入 700 μ l Buffer W2 , 16 弃尽上清。暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 12,000× g 离心 1 min 以同样的方法再用 。 700 μ l Buffer W2 确 洗涤一次。 保盐份被完全清除,消除对酶切反应的影响。 12. 弃滤液,将制备管置回到原 1.5 ml 离心管中, 12,000× g 离心 1 min 。 13. 将制备管置于另一洁净的 1.5 ml 离心管中,在 silica 100-200 μ l Eluent 1 min 。 12,000× g 离心 1 min 洗脱 DNA 去离子水或? Eluent 加热至 65 ?可以提高洗脱效率。 2.5 引物合成 [32] 根据 Ashimoto 等 的方法,七种微生物的引物均来自编码 16SrRNA 的基 - [34 38] 因 ,? 设计特异寡核苷酸引物及细菌通用引物 ,由 invitragen 基因序列号:C.r L04317 A.a X90833 P.g AF285870 P.i X73965 P.n X73963 T.d AY119692 B.f L16495 具体引物序列: Pg 上游 5’ CGTAGGTTGTTCGGTAAGTCAG3 ’ tm 57.1 gc 50 下游 3’ GGTATGACGCTGACTGTGACTT5 ’ tm 58.6 gc 50 产物长 181 bp tap 55 Pn 上游 5’ CCCACATTGGAACTGAGACAC3 ’ tm 57.4 gc 52.4 下游 3’ GGACCATCAGGCGTGACATTT5 ’ tm 58.0 gc 50 产物长 502 bp tap 55.2 Pi 上游 5’ CCCACATTGGAACTGAGACAC3 ’ tm 57.4 gc 52.4 下游 3’ CATCAGGCGTGCCATTTGCTA 5 ’ tm 58.4 gc 52.4产物长 507 bp tap 55.417 公司合成。 ,将 或去离子水, 室温静置 膜中央加暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 Aa 上游 5’ AAATACAGAAGAAGCGACGGC3 ’ tm 59.1 gc 47.6 下游 3’ GCACAACACTTTACAACCCAA5 ’ tm 58.2 gc 42.9产物长 601 bp tap 56.1 Cr 上游 5’ GTAGTCCACGCCCTAAACGAT3 ’ tm 58.6 gc 52.4 下游 3’ CTTCCACACCTGCTGCAGTT5 ’ tm 58.7 gc 55.0产物长 402 bp tap 54.8 Td 上游 5’ TTGGGCGTAAAGGGTATGTAG3 ’ tm 57.5 gc 47.6 下游 3’ GCACTCCACAACCCAATTCAG5 ’ tm 57.1 gc 52.4产物长 531 bp tap 55.4 Bf 上游 5 ’ TGAAGGATGACTGCCCTATGG3 ’ tm 59.9 gc 52.4 下游 3’ GCCCTAACTTTACATCTGCTG5 ’ tm 57.2gc 47.6 产物长 594 bp tap 54.1 通用引物上游 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG3 ’ tm 58.4 gc 52.4 下游 3’ CTAATCTATGGGACCATCAGGTGC5 ’ tm59.2gc 50产物长 797 bp tap 55.3 2.6? PCR 反应体系 缓冲液、引物、模版的浓度比例如下( 25μ l 反应体积): 表 2PCR 反应体系比例 组分 体积 去离子水 9μ l Primer 1 ( 10pmol/ μ l ) 1μ l Primer 2 ( 10pmol/ μ l ) 1μ l Template 1.5μ l Premix Ex Taq 酶 12.5μ l 共 25μ l 2.7 PCR 反应条件18暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 应用梯度 PCR 仪 PTC - 200 进行 PCR扩增: 表 3PCR 过程 反应扩增 94?预变性 1min 94?变性 30s 30 cycles 58?退火 30s72?延伸 60s72?延伸 10min 4?终止 10min 2.8? PCR 扩增产物的检测 取扩增产物 5μ l,0. 5μ g/mL 溴化乙锭的 1% 的琼脂糖凝胶,恒压 6 V / cm 电泳 40 min, 紫外灯下观察记录结果,看能否出现特异性扩增带。 质量控制采用通用细菌引物代替各种细菌的特异性引物作阳性对照,阴性 对照则采用同体积去离子水。 2.9 统计学分析2 应用 SPSS13.0 首先用χ 软件包, 检验三组中各种细菌的检出率是否存 在差异 , 然后经logistic 逐步回归分析不同的细菌与种植体周病变和临床 指标的关系。 19 使用含暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 结果? 1 七种牙周可疑致病菌检测情况七种细菌在三组样本中的检出率各不相同 如表 4 表 4? 7种牙周可疑致病微生物在三组中的检出情况 [ 例数 % ]微生物种 植体周围炎 种植体周粘膜炎 健康对照 n 29 n 30n 30 1758.6 2583.3 1240.0 中间普氏菌 P.i 牙龈卟啉单胞菌 P.g 2068.9 1240.0 5 16.6 福赛拟杆菌 B.f 2275.8 2376.6 4 13.3 齿垢密螺旋体 T.d 2379.3 1653.3 8 26.6 直肠弯曲菌 C.r 1137.9 1033.3 6 20.0 伴放线放线杆菌 A.a 2275.8 2480.0 1860.0 变黑普氏菌 P.n 18 62.0 1033.3 7 23.3 在种植体周粘膜炎组中检出率较高的是中间普氏菌 83.3% ,其次是伴放线 放线杆菌 80.0 % 76.6% 53.3 % 。 种植体周围炎组中检出率较高的是齿垢密螺旋体 79.3% ,及福赛拟杆菌 75.8% 75.8% ,除了直肠弯曲菌 37.9 % 种检出率均差别不大。健康对照组中检出率最高的是伴放线放线杆菌 60.0% 40.0% 也较高,检出率最低的是福赛拟杆菌 13.3% 仅 4例,牙龈卟啉单胞菌也仅 5例, 占 16.6% ,其余几种细菌检出率均差别不大。2 表 5 χ 检验 P 值表 P.iP.g //0>..rA.aP.n 12 组间0.001 0.045 0.000 0.035 0.243 0.091 0.390 13 组间0.153 0.000 0.000 0.000 0.128 0.192 0.003 23 组间0.036 0.026 0.942 0.035 0.712 0.701 0.027 注 : 1 健康对照组; 组为 2 植体周粘膜炎组; 组为种 3 为种植体周围炎组。? 组 20 ,中间普氏菌 检出率较低,其余三 和伴放线放线杆菌 ,以及齿垢密螺旋体 和福赛拟杆菌暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究2 经χ 检验 如表 5 ?种植体周粘膜炎组 T.d 、 P.i 和B.f 种植体周围炎组 的检出率高于健康组, P.g 、 B.f 、 T.d 、 P.n 的检出率高于健康组,种植体周围炎组的P.g 、 T.d 、 P.n 高于种植体周粘膜炎组,差异均有统计学意义(P<0.05);?A.a 和 C.r 的检出率在三组间差异无统计学意义(P>0.05)。? 2 牙周可疑致病菌与种植体周病变的关系 进一步 logistic 主要集中在 P.g、 P.i 、 P.n 、 B.f 、 T.d ,这些菌种的协同作用很可能就是种植体周 围炎的致病因素; P.g 、 T.d 和P.n 三种细菌对种植体周围炎的影响较为 显著OR 值分别为 5.830、 61.037和 3.672,均大于 1 ,即当 P.g、 T.d 和 P.n 共同出现时对种植 如将 体周围骨吸收影响较为显著; PPD ? 4 mm 为深袋, PPD 4 mm 为浅袋进一步 得到的细菌种类有 分析, T.d 9.895 、 B.f 3.534和 P.i 4.693 以认为这 可 , 3种 细菌对种植体的探诊深度有影响,即当 B.f 、 P.i 和 T.d 检出率高时 , 种植体龈沟 有加深趋势。21 逐步回归分析发现, 与种植体周围软硬组织健康相关的微生物,暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 3电泳图谱图 1 细菌基因组电泳图谱 M:λ -Hind III digest DNA Ladder ; 1~30: 为临床样本? TY 通用引物扩增龈下菌斑全细菌 16S rDNA 序列 , 琼脂糖凝胶电泳得到单一 的一条带 , 经 Marker PCR 产物片段长度约 797bp 图 2 图 2 通用引物 PCR 扩增产物电泳图 797 bp M:DNA 相对分子质量标准 DL2000 ; 1~30: 为临床样本 , 均扩增出细菌共有的以 16S rRNA 为的特异性片段 797bp ( 1- 10为健康种植体临床样本; 11- 20为种植体周粘膜炎临床样本; 21- 30为种 植体周围炎临床样本;图 2-图 9均如此) 22 指示暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 图 3 BF PCR 扩增产物电泳图 594 bp M:DNA 相对分子质量标准 DL2000;31:阴性对照 ;1~30: 临床样本 ; 其中 2、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 18、 19、 21、 23、 25、 26、 27、 29、 30 : B.f 阳性扩增出其特异性片段 594 bp1~30: 临床样本 ; 其中 3、 7、 12 、 13、 16、 17、 18、 19 、 20、 22、 23、 24、 26 、 27、 28、 29 : B.f 阳性扩增出其特异性片段 594 bp1~30: 临床样本 ; 其中 5、 11、 12、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 24、 25、 26、 28、 29、 30 : B.f 阳性扩增出其特异性片段 594 bp23暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 图 4TD PCR 扩增产物电泳图 531 bp M:DNA 相对分子质量标准 DL2000;31:阴性对照1~30: 临床样本 ; 其中 1、 4、 7、 12、 13、 17 、 18、 20、 22、 23、 24 、 25、 27、 28、 29、 30 : T.d 阳性扩增出其特异性片段 531 bp 1~30: 临床样本 ; 其中 3、 6、 8、 11、 14、 15 、 16、 17、 21、 22、 23 、 24、 25、 26、 27、 28、 29: T.d 阳性扩增出其特异性片段 531 bp1~30: 临床样本 ; 其 中 2 、 9 、 12、 14 、 16 、 18 、 19 、 20、 23 、 24 、 26 、 28 、 29、 30 : T.d 阳性扩增出其特异性片段 531 bp24暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 图 5? AaPCR 扩增产物电泳图 601 bp M:DNA 相对分子质量标准 DL2000;31:阴性对照1~30: 临床样本 ; 其中 2、 3、 5、 6、 8、 9、 11、 14、 15、 16、 18、 19、 20、 21、 22、 24、 25、 26、 28、 30: A.a 阳性扩增出其特异性片段 601 bp1~30: 临床样本 ; 其中 1、 2、 4、 7、 9、 10、 12、 14、 15 、 16、 17、 18、 19、 20 、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 30: A.a 阳性扩增出其特异性片段 601 bp1~30: 临床样本 ; 其中 3、 4、 5、 6、 8、 10、 11- 19、 22、 23、 24、 25、 26、 28 、 29、 30: A.a 阳性扩增出其特异性片段 601 bp25暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 图 6CR PCR 扩增产物电泳图 402 bp M:DNA 相对分子质量标准 DL2000;31:阴性对照1~30: 临床样本 ; 其中 1、 6、 10、 12、 19、 21、 27、 28: C.r 阳性扩增出其特 异性片段 402 bp1~30: 临床样本 ; 其中 2、 5、 11 、 15、 17、 22、 23、 26 、 29、 30: C.r 阳性 扩增出其特异性片段 402 bp1~30: 临床样本 ; 其中 7、 13、 14 、 15、 18、 20、 24、 25 、 27: C.r 阳性扩 增出其特异性片段 402 bp26暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病变的相关性研究 图 7Pi PCR 扩增产物电泳图 507 bp M:DNA 相对分子质量标准 DL2000;31:阴性对照1~30: 临床样本 ; 其中 3、 4、 7、 9、 11、 12、 13、 15、 16、 17、 19、 20、 23、 24、 26、 27、 29: P.i 阳性扩增出其特异性片段 507 bp1~30: 临床样本 ; 其中 1、 2、 7、 8、 11--20 、 21、 22、 25、 27、 29 : P.i 阳 性扩增出其特异性片段 507 bp1~30: 临床样本 ; 其中 4、 5、 6、 10、 12、 13 、 16、 17、 18、 19、 20 、 21、 24、 25、 26、 27、 28、 30: P.i 阳性扩增出其特异性片段 507 bp27暨南大学硕士学位论文 牙周可疑致病微生物与种植体周病