【精品文献】免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌

【精品文献】免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 论文范文 题目:免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶 中的金黄色葡萄球菌 编辑:司马小 作者:周义正 李向阳 杨锦红 【关键词】 阳性 金黄色葡萄球菌,S.aureus,是引发社区感染和院内感染的重要致病菌～其所致感染常以急性、化脓性为特征。以其引发菌血症而致的脓毒血症最为严重。作者采用免疫捕获PCR法,Immunocaptured PCR～icPCR,检测S.aureus～即应用抗体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.aureus～再用PCR法快速检测ssa基因和mecA基因～以期建立一种快速准确地检测阳性血培养瓶中S.aureus的方法。 1 材料与方法 1.1 材料 本实验所用的菌株均购自卫生部临床检验中心～其它非标准菌株是本实验室保存的临床菌株～均分离自患者的血培养标 本并得到Vitek-32全自动细菌鉴定仪的鉴定。引物:(1)ssa基因:ssa-F:5'-TCGGTACACGATATTCTTCAC-3'～ssa-R:5'- ACTCTC GTATGACCAGCTTC-3',,,。(2)mecA基因:mecA-F:5'-GCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGC -3' mecA-R:5'- GATTGAAAGGATCTGTACTGGGT -3'。 1.2 方法 (1)抗体包被微量PCR管:人IgG以0.1mol/L的Na2CO3缓冲液,pH=9.6,稀释至20μg/ml～取500μl加至0.6ml的PCR管中37?孵育3h～再放臵4?过夜～然后倒掉包被液～加入500μl 10%小牛血清在37?孵育1h～最后以PBST洗3次～包被好的PCR管臵4?冰箱备用,,,。(2)免疫捕获和DNA制备:以无菌方式抽取阳性血培养瓶中的带血球菌液臵无菌试管以2～000r/5min离心～取500μl上层菌液加入包被有人IgG的PCR管中在37?孵育30min～然后倒掉菌液以PBST洗涤6次～每次2min～最后在吸水纸上扣干残液～以上完成免疫捕获～接着在捕获完后的PCR管中加入100μl双蒸水并在PCR仪上以99.9?裂解10min～然后参照《精编分子生物学实验指南》上的醋酸钠-异丙醇法,3,沉淀DNA并用70%乙醇洗涤～待自然干燥后加入10μl双蒸水即得到PCR反应所用的模板DNA。(3)PCR扩增反应体系和参数:反应体系包括10×Buffer 5μl～2.5mmol/L dNTP 4μl～ Taq酶1U～20μmol/L正反向引物各 1μl ～25mmol/L MgCl2 3μl～ 模板DNA 10μl～最后补ddH2O至50μl。ssa基因和mecA 基因的PCR扩增参数如下:先94?预变性5min～再按94?～30s?53?～30s?72?～1min～共35个循环,最后72?～10min。目的基因片段大小分别为180bp和210bp。(4)最低检测限检测:先将在绵羊血琼脂平板上生长24h的S.aureus,菌株ATCC43300,纯菌落用无菌蒸馏水调臵成1McFarland的菌液～然后以无菌操作方式将调好的1ml菌液加入血培养瓶中～再以无菌操作方式将5ml正常人无菌血加入同一血培养瓶中～最后将血培养瓶放入BacT/Alert全自动血培养仪直至阳性报警～接着以无菌操作方式从阳性血培养瓶中抽取5ml臵无菌试管中2～000r/5min离心,再取上层菌液3ml作原始菌液并以新血培养瓶中的无菌培养液10倍系列稀释观察icPCR的最低检测限～每个稀释度做5管～重复试验3次～原始菌液和各稀释菌液均以琼脂倾注法作活菌记数。(5)特异性试验:按照与最低检测限检测中相同的方法用1中1-20号菌株制作模拟标本～分别用icPCR法检测ssa基因和mecA基因以鉴定S.aureus和MRSA～重复试验3次。(6)临床标本检测:以本实验 室2006年7至8月收到的血培养标本中的106例阳性报警瓶为检测对象～分别采用传统方法和icPCR法进行检测S.aureus和MRSA。 2 结果 以菌株ATCC43300为试验菌株的最低检测限检测显示～icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的ssa基因和mecA基因的检测限均在4.3×104cfu/ml左右。icPCR法在10例由S.aureus模拟的阳性标本中检测到ssa基因～其中有6例还检测到mecA基因,其它10例非S.aureus模拟的阳性标本中均未检测到ssa基因和mecA基因。传统方法在106例阳性报警瓶中检测到9例S.aureus～ 其中3例S.aureus的苯唑西林MIC?4μg/ml,icPCR法检测到的S.aureus与传统方法的结果相同～但在1例苯唑西林MIC仅为2μg/ml的S.aureus中也检测到mecA基因。若以传统方法为金标准～icPCR法检测阳性血培养瓶中S.aureus的灵敏度和特异度均达100%。此外～用传统方法检测阳性报警瓶中S.aureus的时间约为48，72h～而免疫捕获PCR法的检测时间仅为5h左右。 3 讨论 免疫捕获PCR法是一种快速检测病原菌的方法～其根据特异性抗体与与病原菌菌体特异性结合的免疫学原理～将特异性抗体包被于磁珠或PCR管壁上～富集或捕获菌悬液和标本中的病原菌～再进行PCR反应检测目的病原菌。 icPCR的检测灵敏度取决于抗体的捕获效率和PCR扩增效率等因素。抗体的亲和力及纯化程度直接影响包被后的捕获效率～在本实验中由于采用IgG的Fab段能与S.aureus表面的SPA蛋白非特异结合的原理来捕获S.aureus～故其捕获效率不高～这直接导致本实验中icPCR的检测灵敏度仅为104cfu/ml～这远低于牛建军等,4,运用icPCR检测E.coli O157:H7的最低检测限10 cfu/ml～但由于在阳性血培养瓶中的菌液浓度已达108 cfu/ml～因此灵敏度并不影响icPCR在检测阳性血培养瓶中S.aureus的应用。在本实验中对icPCR检测S.aureus的特异度的保证依靠两个因素:一是IgG捕获S.aureus～二是采用ssa基因来鉴定S.aureus。ssa基因是Martineau等,1,采用大规模的基因比对在S.aureus中发现的一种特异基因～其较过去用来 鉴定S.aureus的fem基因和nuc基因具有更高的种特异性和基因的保 守性～因此更适合用来鉴定S.aureus。另外～在本实验中还采用检测 mecA基因来判断MRSA～这是目前公认的检测MRSA的最可靠方法～它 能避免传统表型法筛查MRSA因S.aureus的异质性表达而造成的漏 检。但是～本组采用的icPCR也存在一些不足～首先是灵敏度还有待 提高～其次是不能检测临床日益增多的凝固酶阴性葡萄球菌引起的菌 血症～其实这两点都与包被用的抗体有关～在接下来的研究中作者将 致力于开发一种针对葡萄球菌属共有菌体抗原的单克隆抗体。 【参考文献】 1 Martineau F～Picard FJ～Roy PH～et al. Species-specific and ubiquitous- DNA -based assays for rapid identification of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol～ 1998 ,36:618，623. 2 黄留玉. PCR最新技术原理、方法及应用.北京:化学工业出版 社～2005. 181，187. 3 Ausubel FM～Kingston RE～Seidman JG～et al. 精编分子生 物学实验指南 .马学军～舒跃龙～颜子颖～等编译. 北京:科学出版 社～2005.46，47. 4 牛建军～黄健炜～李莉～等.免疫捕获PCR法快速检测大肠埃希 O157:H7的研究.中国人兽共患病杂志～2004～20(11):896，897. 5 Luo W～Wang S～Peng X. Identification of shiga toxin-producing bacteria by a new immuno-capture toxin gene PCR. FEMS Microbiol Lett～ 2002～216: 39，42.