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不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究(可编辑)

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不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究(可编辑)不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究(可编辑) 不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 复旦大学 博士学位论文 不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关 性研究 姓名:吴靖宇 申请学位级别:博士 专业:临床医学八年制 指导教师:黄峰平 2012-04-13中文摘要 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 不同杂合缺失特性少枝胶质瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 中文摘要 胶质瘤是中枢神经系统最常见...
不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究(可编辑)
不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究(可编辑) 不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 复旦大学 博士学位论文 不同1p杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关 性研究 姓名:吴靖宇 申请学位级别:博士 专业:临床医学八年制 指导教师:黄峰平 2012-04-13中文摘要 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 不同杂合缺失特性少枝胶质瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 中文摘要 胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤,发病率高,但治愈率低。尽管外科新 技术的发展以及化疗、放疗的广泛应用使得胶质瘤的预后有所改善,但是大 多数 胶质瘤的预后仍然较差。少枝胶质细胞瘤,占胶质瘤 的.%,占所有原发脑肿瘤的%,是常见的成人神经系统恶性肿瘤之一, 也是第一个经临床试验证实其预后与肿瘤的基因特征有关联的中枢神经系统肿 瘤。研究发现这些对化疗敏感的少枝胶质瘤大都具有/的杂合性缺失 ,。进一步的研究显示具有不同/ 或 特征的这两类肿瘤在很多方面还有差异,如好发部位、肿瘤对放疗的敏感性及最 终的预后等等。这些都说明在光镜下无法区分的这两种肿瘤可能是两类分子生物 学特征不同的肿瘤,对它们的分型可能有助于临床的治疗和预后的判断。目前除 了/染色体的差异以外,人们已经在两类肿瘤中找到了表达差异的蛋白, 但是对差异蛋白与患者雨后的关联及最终的分子生物学机制仍然知之不多,所以 有必要对此进一步的研究。 免疫组化是临床上常用的对病理进行辅助诊断的方法,操作简单,费用便宜, 它可以通过对细胞内染色的有无进行定性,通过染色的位置进行蛋白的定位,并 根据染色的深浅程度进行半定量的检测。我们此次使用免疫组化的方法对已确定 分型的患者的肿瘤标本切片进行半定量的蛋白检测,并探讨差异蛋白与少 枝胶质瘤患者预后情况的相关性。 胶质瘤病人的身体状况、活动能力及医疗需求等情况常用行为评 分来评估,将患者按照自己的身体状况分为个等级,从无症状 及体征到死亡依次递减。自从年问世以来,已经成为应用最 广泛的评估患者身体状况的方法。一般认为分值大于分的患者方可以耐受常 规的癌症治疗或者可纳入临床试验。我们对已进行少枝胶质细胞瘤切除 的患 者进行随访,通过评分对患者的术后身体情况进行评估,并与差异蛋白进 行相关性的探讨。复旦人学博士学位论文不同口杂台缺失特性少枝胶质细胞 瘤患者预后与砉 第一部分、、、 特征的少枝胶质瘤中的表达差: 不同 目的:验证、、、等 特征的少枝胶质瘤中的表达并分析其意义。 方法:用免疫组化的方法验证、、 差异蛋白在例杂合性缺失和例正常的少枝尾 异性 结果:免疫组化对例少枝胶质细胞瘤标本的 组中的表达较 的半定量分析结果显示在 组高。 在正常组中较 结论:、、、在不 质瘤中的表达具有差异性,这些特异蛋白都有望用于免垂 分子分型,并进一步用于的预后判断和指导治疗。 第二部分、蛋白与少枝胶质瘤患 目的:探讨和两种差异蛋白与型 的相关性 方法:随访例少枝胶质细胞瘤患者术后年的《 和两种差异蛋白的免疫组化评分进行 结果:及两种蛋白与少枝胶质瘤 有着显著地相关性,将两种蛋白的评分整合后,这 结论:及与少枝胶质瘤的化疗敏复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少 枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 英文摘要. 。 .. % % , . . , . , , . . . / , , ,, ,. . ,, . . ,. ,. , . . 复旦大学博士学位论文不同口杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差 异蛋白相关性研究 英文摘要. .,英文摘要 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 : ,,, ’ ,,, : . : ,,, .. :,. : . ,. :,, : .: , .,: ..: , .. ;; ; :; 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 缩略语 主要英文缩略语 英文缩写 英文全称 中文全称 少枝胶质细胞瘤 杂合性缺失 行为评分 世界卫生组织 , 甲基苄肼,环己亚硝脲和 长春新碱? 荧光原位杂交 同位素标记相对和绝对 帘量磷酸盐缓冲液.二氨基联苯胺 免疫组织化学 ? 微管相关蛋白 无疾病进展生存期 ?健康相关生活质量 序论 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 序论 胶质瘤是成年人中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其发病率大约占中枢神经 系统肿瘤的%。而其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤又占了所有胶质瘤的大约 一半。尽管目前在胶质瘤分子病理方面的研究有了较大的进展,但对胶质瘤仍然 缺乏行之有效的治疗方法,以至于无法显著提高胶质瘤患者的预后,这部分是由 于胶质瘤本身所具有的异质性所造成的【?。目前临床上最常用的胶质瘤的组织病 理分型及分级仍以分型为主,这个分型主要是依据胶质瘤在传统光学显微 镜下的形态学表现基础上再辅以免疫组化技术,并假定肿瘤细胞的起源为星形细 胞、少枝胶质细胞、室管膜细胞以及它们各自的前体细胞,而这些观察需要依赖 于病理科医生的主观判断,包括核异型、有丝分裂情况、微血管增生以及局部坏 死等,所以其诊断受观察者的主观因素影响较大。胶质瘤的分级是目前临 床医生用于判断肿瘤患者预后的最常用指标之一,但其对于每一个个体预后的准 确判断及合适的指导治疗仍然帮助不大。 目前,分子生物学的巨大进步大大提高了我们对于中枢神经系统肿瘤的认识, 许多致癌基因及抑癌基因的发现已经被证明在肿瘤的形成及发展中起到了 关键 的作用,某些分子基因信号通路的改变,如细胞周期循环及生长因子信号转导通 路等与中枢神经系统肿瘤的发生、发展密切相关。因此,利用新的分子生物学技 术来对中枢神经系统肿瘤进行分型将有助于改善目前常用的组织学分型。并且, 这种新的分子分型也能使我们更好地用于指导治疗及改善胶质瘤患者的预后情 况。 少枝胶质瘤占整个原发中枢神经系统肿瘤的%,占胶质瘤的.%,是 胶质瘤的主要类型之一。在十多年前,少枝胶质瘤的治疗与星形细胞瘤相似,都 是先以手术治疗为主,再辅以放疗及化疗,而对于化疗药物的选择则没有确定性。 所以总体上来说,少枝胶质瘤与星形细胞瘤在治疗上无明显差别,而且同一级别 的两类肿瘤在预后上也几乎一致。然而到了年,首次发现部分复发的间变 少枝胶质瘤对的联合化疗方案洛莫司汀甲基苄肼长春新碱异常敏感。 而在年又发现对新诊断为间变少枝胶质瘤的患者实行化疗也常取得令 人欣喜的效果。因此对于少枝胶质瘤及星形细胞瘤的区别已经不再像以前那样 无关紧要。有效的化疗可以使少枝胶质瘤患者的预后有明显的改善,但是仍有相 当一部分少枝胶质瘤患者对化疗的效果不佳,而我们却无法从肿瘤的影像学及病 理学上对两种患者加以识别,所以对少枝胶质瘤的分型诊断需要进一步细化, 以便于指导治疗。目前少枝胶质瘤的诊断仍以光学显微镜下的形态学观察为主, 有时与星形细胞瘤也难以完全区分,己知的一些免疫组化标志物如、、复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 序论 等也不足以诊断,对于少枝胶质瘤诊断的进一步分型更为不可能。这使得 一部分对化疗不够敏感的少枝胶质瘤患者如果采用化疗方案可能会给他们 带来过分治疗的副作用,影响患者的生活质量;但对于大部分对化疗敏感 的少枝胶质瘤患者如果不予以化疗将丧失可能的提高预后和延长生存时间的机 会。所以对于临床医生来说迫切需要找到可以用来区分这两类肿瘤的标志【】。 近十年来这种努力取得了一定的结果。在年,等人发现伴或 、等位基因缺失的间变少枝胶质瘤患者对化疗敏感并且能长期生存,以 后又有多名学者的研究证实了这一结果】。这说明这两类少枝胶质瘤可能有着不 同的分子生物学特性。而后又有日本学者等采用基因组学分析方法对 的肿瘤标本用基因 例少枝胶质瘤患者其中例有 ,例不伴 组中有个基因表达下调,个基因表达上调, 芯片进行分析,发现 并用方法验证了其中的个基因,与基因芯片分析的结果一致,通过 肿瘤细胞与正常脑组织 聚类分析后能明显区分出这两类肿瘤,并且发现 细胞更为相似,但该研究未能发现与化疗敏感有关的差异基因】。由于微卫星分 析 、、基因芯片等用于检测染色体及基因差异的 方法较为繁琐而且昂贵,距离临床的广泛应用尚有距离。而基因的功能活动最终 要靠蛋白质来体现,如果能直接找到这两类肿瘤之问的差异蛋白,可能对临床应 用更为有用。而蛋白质组学方法的出现为这种研究提供了可能。 蛋白质组学分析是研究细胞内蛋白质的存在于行为方式的学科,是一种能同 时研究大量蛋白质及其表达变化的方法,目前下逐渐应用于从基础科学到临床实 践科学的广泛领域中,受到前所未有的重视。在人类基因组计划的推动下,人们 从基因水平对肿瘤进行了广泛的研究,发现了许多与肿瘤的发生发展相关联 的基 因,包括一些与肿瘤治疗有关的致癌基因和抑癌基因,但基因的功能活动最终要 靠蛋白质来体现】。众所周知,从?一蛋白质的过程中存在着转录 后剪切和后的修饰加工,以及蛋白质合成后的转移定位等多种变化,所以 和的水平和状况并不能完全代表蛋白质的水平和状况。蛋白质组学 的问世及其理论与技术的不断完善与发展,使人们从蛋白质整体水平来研究肿瘤 的少枝胶质瘤之间蛋白质 成为现实?。应用蛋白质组学技术比较不同的 的差异,不仅可以发现具有不同分子生物学特征的少枝胶质瘤的肿瘤标志物,而 且可能进一步揭示少枝胶质瘤的分子生物学机制,为少枝胶质瘤的分子诊断、分 型和治疗提供新的思路.】。 在年,学者等就采用蛋白质组学方法对例少枝胶质瘤 的蛋白表达进行分析,通过凝胶电泳结合 例有 ,例不伴 质谱分析的方法发现不伴 的肿瘤中有两个蛋白表达增加,为序论 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究和 ,并认为其可能与化疗耐药性有关。而在伴有 的肿瘤中则发现个能诱导化疗敏感的高表达蛋白】。年,杨柳松 特征 等通过使用技术为基础的定量蛋白质组学技术对具有不同 、 的两组少枝胶质瘤组织进行分析,得到个差异蛋白质,并通过 免疫组化方法对部分蛋白质成功进行了验证。这些研究一方面进一步证实了两类 不同的少枝胶质瘤可能与肿瘤化疗耐药有关,另外一方面也说明了这些不同可能 更多与基因表达后的蛋白质差异有关。 胶质瘤病人的身体状况、活动能力及医疗需求等情况常用行为评 分来评估,将患者按照自己的身体状况分为个等级,从无症状 及体征到死亡依次递减表。虽然由于治疗医生及治疗环境的不同, 同一名患者的评分可能有主观上的差别,但自从年问世以来,依 然是应用最广泛的评估患者身体状况的方法。一般认为分值大于分的患者方 可以耐受常规的癌症治疗方案或者可纳入临床试验。 免疫组化是临床上常用的对病理进行辅助诊断的方法,操作简单,费用便宜, 它可以通过对细胞内染色的有无进行定性,通过染色的位置进行蛋白的定位,并 根据染色的深浅程度进行半定量的检测。我们此次使用免疫组化的方法对已确定 分型的患者的肿瘤标本切片进行半定量的蛋白检测,并探讨差异蛋白与少 枝胶质瘤患者预后情况的相关性。序论 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 评分表 表 分数 描述 正常,无症状及体征 能进行正常活动,有轻微症状和体征 勉强可进行正常活动,有一定的症状和体征 生活町自理,但不能维持正常的生活工作 生活大部分可自理,但有时需要别人帮助 常需要人照料 生活不能自理,需要特别的照顾和帮助 生活严重不能自理 病重,需要住院和积极的支持治疗 重危,接近死亡 死亡 序论 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 参考文献 .杨柳松,胡锦.胶质瘤侵袭性的分子生物学机制.中国神经肿瘤,, :. . .: , , ,,:. 】. . . , , , . ,:. . , .: . .,: , , , .: .. ,,: 【. . .巧 。: :. 】. ,,. ., , , ,, :. ,, 【. . . , , ,., ,:. . . , , ,.,,:.. . , , , . 】.,,: . . , , .,,:?. ., , ,. ., ,:. . . . , , .】.,,: . . : 序论 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 . 【】. ,,:? . . , , , 】., . ,:. . , , , 】.,:. . . , , , , . . ,:第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 第一部分、、、蛋白在不同 特征的少枝胶质瘤中的表达差异性前言 少枝胶质瘤是胶质瘤的主要类型之一,约占所有胶质瘤的.%。按照 分型又可分为少枝胶质瘤级和少枝胶质瘤级即间变型少枝胶质瘤 。由于其对化疗较为敏感和预后较好,因此越来越受到学者和临床医生们的 注 意,逐渐成为胶质瘤研究的热点之一,并有望成为胶质瘤治疗的突破口。研究发 现/的杂合性缺失不仅是少枝胶质瘤中常见的分子生物学改变,也与其不 的金标准,不论是 同的化疗敏感性和预后有关。然而作为目前检测/ 还是都较为复杂和昂贵,在大部分临床单位都难以开展;并且对于少 枝胶质瘤中其它的分子生物学特征如基因、蛋白的改变也知之甚少,不同 特征的少枝胶质瘤的分子生物学机制究竟有何不同,这些都需要我们进一步的研 究。 免疫组化是临床上常用的对病理进行辅助诊断的方法,操作简单,费用便宜, 它可以通过对细胞内染色的有无进行定性,通过染色的位置进行蛋白的定位,并 根据染色的深浅程度进行半定量的检测。在已经进行的研究中,杨柳松等以 技术结合../的比较蛋白质组学研究,获得了个差异蛋白 质。结合生物信息学分析和已有的文献结果,确定了四个可能与不同的分子 生物学机制相关、有进一步研究价值的蛋白质、、、。 我们此次使用免疫组化的方法对已确定分型的患者的肿瘤标本切片进行 特征的少枝胶质瘤 四种蛋白质的半定量检测,以了解这些蛋白质在不同 中的表达并分析其意义。第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 一、和方法 .实验标本:免疫组化所用的标本均取自年月至年月在华山医院 标 神经病理科已有 结果的的存档蜡块,我们挑选其中符合 准的标本例,正常的标本例用于免疫组化检测标本的临床 资料见表。 .免疫组化实验: .试剂:. 浓缩液,.% 工作液,工作液,%,?% 山羊血清。一抗:..、.一、 .,、 ?一蛋白多克隆抗体均购自美国 工作浓度为:,工作浓度为:;一蛋白单克 隆抗体购自上海长岛抗体诊断试剂有限公司,工作浓度为:。 检测试剂盒/,兔/鼠单标型公司。 .免疫组化实验步骤 ..所有标本蜡块均做连续切片,每例连续切片张,厚,一张作染 色,另外四张分别用做、、、的免疫组化标记。 ..石蜡切片脱蜡和水化后,用冲洗三次,每次分钟。 ..去内源性过氧化物酶:%室温孵育~分钟,以消除内源性过氧 化物酶的活性。 ..石蜡切片微波炉抗原修复:蒸馏水洗分钟×。将切片放入盛有枸橼酸盐 缓冲液的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在??之间并持 续 分钟。取出容器,室温冷却分钟,洗遍,每次分钟。 ..%常山羊血清稀释封闭,室温孵育分钟。倾去血清,勿洗, 滴加工作浓度稀释的一抗、、、,代替一抗 作为阴性对照,。孵育,过夜。 ..冲洗三次,每次分钟。滴加二步法 孵育分钟。 第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 ..冲洗三次,每次分钟。甩去液,每张切片滴加新鲜配制的 显色液,显微镜下观察,阳性信号为棕黄色或棕褐色。一般显色时间为分钟左 右,终止反应,自来水充分冲洗。 ..苏木素复染,.%盐酸酒精分化,氨水返兰或自来水返兰自来水返兰时 间要稍长些,应该在显微镜下看以下苏木素复染情况,自来水冲洗。 ..梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,阅片并总结染色结果。 ..免疫组化结果判断标准:根据染色范围及程度评分。两个评分者 结果均不知情,评分标准参考 事先对每张切片的病例资料和 评分,即切片在显微镜下任选个区域,染色细胞数%为分,.%为 分,.%为分,.%为分,%为分;染色强度无为分,弱为 分,中为分,强为分,总分为.分。、蛋白主要定位于细 胞核,细胞阳性结果以胞核出现棕黄色为准;、蛋白主要定位 于细胞浆或膜,细胞阳性结果以胞浆出现棕黄色为准。.软件,将每组标本、 ..数据统计:应用 , 、、的免疫组化分值进行双样本. 值.具有统计意义,并计算每组平均分值;对各个抗体在两组不同组 织中的分值绘制箱线图。复旦大学博:学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质 细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 第一部分 表:免疫组化所用标本临床资料表 编号 性别 年龄 级别 部位左枕左额颞右枕右岛左颢左颞枕左额右颞左顶 枕右额左额右额颞 右小脑 左颞 右额 左额域额左颞左岛右颞左额左三角区右额左岛左额右额右额 第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 捣 钙 右颞岛 钳凹 左额 如 甜右额” ? 左颞 弛 弘 右顶 弱 弘右枕 弘 卯 左额颞 弱 卯 右额 弘 弛 左额颞 卯 乾 右额 粥 拍 左顶 扣 甜右额 们 如 左顶枕 甜 粥 右额 铊 铊左颞 钙 酡右额 甜 躯 左三角区 。 注:【男性,女性, , 第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 二、结果 主要定位于细胞核,阳性细胞细胞核呈棕黄色,胞浆、胞膜一般 不染色见图。主要定位于胞浆和胞膜,阳性细胞胞浆和 胞膜呈棕黄色,胞核不染色见图。主要定位于胞浆,阳性细胞 胞浆呈棕黄色,在细胞中阳性细胞常呈现特征性的环核胞浆的阳性染色见 图。是核蛋白,主要定位于细胞核,阳性细胞胞核呈棕黄染色 见图。 我们对、、、四种蛋白的免疫组化结果进行评 分,并对半定量结果行非参数双样本. 显示在正常和 两组标本中存在明显差异,各组平均免疫组化分值见表,各组免疫组化分 值分布箱线图见图。 表:、、、的免疫组化平均分值组间比较? . .?. .?, .?. .?. . .?, .?. . .. ,?. .复大学博学位论文同杂合缺失特件少技胶质细胞瘸患煮预后与差 异蛋白十火性研究 第一部分 口 》 免 疫 组 化 评 分 图:阳性细胞主要表现为胞核染色上左;阴性细胞上右。放大倍数 加;在两组中的免疫组化分值箱线图下。.‘.巨镬哆茹、.??.篁. 吣零.? . 二 ~?,。 。,?.一 ,乏卜卜免疫组化评分 图;阳性细胞主要表现为胞浆、胞膜染色上左:阴性细胞上右。 ;在两组中的免疫组化分值箱线圈? 放大倍数复大学博十学位论文小同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤忠着预后 与差异蚩白柏火性研究 第?部分 一 ,, 可鼯 ’? 、?‘ .????? .’’? .善拳 ‘ ? ?,。? , ? 免 疫 组 化 评 分 图.阳性细胞表现为特征性的环核胞浆染色上左;阴性细胞上右。 放大倍数;在两组中的免疫组化分值箱线图。 复大学博十学位论文小同杂合缺失特件少枝胶质细胞瘤患者后与差异蚩白 牛天性研究 第‘部分互 田 免 疫 组 化 评 分 图:强阳性细胞表现为胞核染色上左;弱阳性细胞上右。放大倍 数 在两组中的免疫组化分值箱线图。 第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 三、讨论: 在先期研究中,杨柳松等以技术结合../的比较蛋白质组 学研究,获得了个差异蛋白质。结合生物信息学分析和已有的文献结果,确 定了四个可能与不同的分子生物学机制相关、有进一步研究价值的蛋白质 、、、。我们此次使用免疫组化的方法对已确定 分型的患者的肿瘤标本切片进行四种蛋白质的半定量检测。 是目前实验室中检测蛋白质的最常用的手段,通过对电泳条带 与标准蛋白的比较可以知晓蛋白的分子量,而通过对电泳条带吸光度的分析可以 对蛋白质进行相对定量,因此是目前对蛋白质进行定量的较为理想的方法;免疫 组化是临床上常用的对病理进行辅助诊断的方法,操作简单,费用便宜,它可以 通过对细胞内染色的有无进行定性,通过染色的位置进行蛋白的定位,但是它的 缺点是最多只能是半定量分析。因此, 和免疫组化这两种对蛋白质 检测的方法是各有优劣、相辅相成的。 本次研究中,由于时间及实验条件的限制,我们选取了免疫组化的方法对四 种差异蛋白进行半定量检测,并与金标准结果进行对比,均存在统计学差异,其 中及的差异尤其明显,这两种蛋白可以在今后的研究中进一步 深入研究。下面我们对这四种蛋白进行逐个分析。 ,是指泛素活化酶,也称 ?,其基因定位于.,是泛素.蛋白酶体途径的主要蛋白酶之一,是 依赖性蛋白降解途径的起动酶。其主要功能有:、作为温度感受基因参与期 调控,保证细胞周期中各个时段正常、有序地完成并依次交替。、参与 选择性降解的调控,维持细胞正常生长、分化、凋亡等一系列过程。、参与抑 癌基因等的蛋白水解过程【】。主要存在于细胞核。已经发现的表 达与非霍奇金淋巴瘤的恶性程度有关【;基因表达增高与胃癌转移有关【】; 使用蛋白酶体抑制剂可以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性,可能与调控耐药基因、 凋亡基因的表达有关【】。尚未有与胶质瘤相关的报导。而在本研究中发现正 常组的中表达较高,这是否也与胶质瘤的化疗敏感性有关,泛素蛋白 酶系统在胶质瘤中的机制等都值得进一步的研究。 . ,基因定位于.,是真核细胞内 酶的组成和催化亚单位,位于胞浆和胞膜。其功能与内涵体、溶酶体酸化的调节 有关。有研究提示与二磷酸果糖酶相作用,参与糖酵解【】。最近的很多重大发现 都提示代谢酶的改变与疾病、肿瘤的关系密切,如琥珀酸脱氢酶与副神经节瘤、 延胡索酸水化酶与平滑肌瘤、与胶质瘤等【西】,而是否也因代谢酶 的改变而参与肿瘤的发生、发展尚需进一步的研究。复旦大学博士学位论文不同口杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 第一部分 . ,属于高迁移率蛋白家族,它是一种与 结合的核蛋白,通过与受体、、等作用,参与细胞凋亡、修 复、血管生成、炎症及肿瘤等。然而在肿瘤中的作用机制仍有颇多争议, 有研究认为参与肿瘤的侵袭、转移及进展等,如在黑色素瘤、胰腺癌、 前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等:但在肺癌中却发现低表达的肿瘤可能恶 性程度及侵袭性更强。所以,在肿瘤中的作用可能是多样化的,可能与 蛋白本身的浓度、不同的受体都有关系【叭。而在胶质瘤中发现,可以通 过介导内源性受体的激活导致胶母细胞瘤的肿瘤衰退【。另外,可 能与化疗药物的作用也有关系,研究发现蛋白能抑制化疗药物顺铂作用区 域的修复,从而增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,可能 与化疗药物的疗效有关【。而在本次研究中发现,在两组肿瘤中都有表 组中的表达大都呈强阳性,在正常组的中其染色强 达,但在 度及范围都明显减少,大都为弱阳性表达,两组的评分比较也有明显差别, 的对化疗较为敏感的原因值得进一步的研究。 这是否是 ? 属于结构性微管相关蛋白家族,主 要在中枢神经系统神经元胞体和树突中表达,在神经再生的关键步骤??微管 装 配中起着重要作用,通过交联微管与其他显微结构来稳定微管的生长,并在 树突 神经元的形成与发展过程中起着稳定树突形状的作用。目前多数研究集中于 对神经元结构和功能方面的研究,而在胶质瘤中的表达情况、功能 及调控等研究较少。有研究显示,的表达在低级别胶质瘤中较高级别胶质 瘤中明显增高。而在中枢神经系统以外,在黑色素瘤细胞中,的表达增高 能抑制肿瘤细胞的侵袭、增殖和生长。在少枝胶质瘤细胞中,的表达大都 呈阳性,且呈现环核胞浆的阳性染色,这一特征也可用来与星形细胞瘤相鉴别。 的中增高,这是否与其恶性程度相关有待进一 本研究中发现 步的证实。复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相差丝婴窒 箜二塑坌 四、结论 、在不同杂合性缺失特性少枝胶质瘤标本中,四种差异蛋白、、 、的免疫组化结果具有统计学差异,其中及的差 异更为显著。 、、可能与化疗药物敏感性有关;可能与代谢酶的调节 关;与神经元发育成熟相关。这些抗体都有希望用于临床对于胶质瘤的预 后判断、分子分型和指导治疗,并进一步探讨少枝胶质瘤的发病机制。第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 参考文献:. , . . .: ,:?. . . 】. , ,, :. .龙捷,刘勇,苏祖兰等.表达值在非霍奇金淋巴瘤中的临床意义 .中国肿瘤临床,,:.. ’ , . .】. ,;:?. . , , , . , 】. ,:?. ., , , . . . ,,:. . . , , , 】. ,,:.. .【. . ,,:? 。? ,巧彤 . .,,:?. . , , , .: 一 ,, . :?.. . , ,.】 ,,: . , , . ? . , 】. ,: . .? , , , 一 : 】. :?. ,, .. ,, , 第一部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究,,:?. 】. . . , , , . ,. , . . , , , .,,:. 第二部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 第二部分及与不同杂合缺失特性少枝胶质瘤患 者预后的相关性研究 前言 少枝胶质瘤占整个原发中枢神经系统肿瘤的%,占胶质瘤的.%,是 胶质瘤的主要类型之一。在十多年前,少枝胶质瘤的治疗与星形细胞瘤相似,都 是先以手术治疗为主,再辅以放疗及化疗,而对于化疗药物的选择则没有确定性, 几乎每一个临床医生都有自己的一套化疗方案。到了年,首次发现部分复 发的间变少枝胶质瘤对的联合化疗方案异常敏感。而在年又发现对新 诊断为问变少枝胶质瘤的患者实行化疗也常取得令人欣喜的效果。因此对 于少枝胶质瘤及星形细胞瘤的区别已经不再像以前那样无关紧要。有效的化疗可 以使少枝胶质瘤患者的预后有明显的改善,但对于部分对化疗不够敏感的少枝胶 质瘤患者如果采用化疗治疗可能会给他们带来过分治疗的副作用,影响患者的生 质量。所以对于临床医生来说迫切需要找到可以用来区分这两类肿瘤的标志。 在年,等人发现伴或、等位基因缺失的间变少枝 胶质瘤患者对化疗敏感并且能长期生存,以后又有多名学者的研究证实了这一结 果,并通过蛋白质组学的方法找到了两种不同分子类型的少枝胶质瘤之问的差异 蛋白。 在前一部分研究中,我们已经证实,在不同杂合性缺失特性少枝胶质瘤 标本中,四种差异蛋白、、、的免疫组化结果具有 统计学差异,其中及的差异更为显著。在本部分研究中,我们 通过对第一部分的少枝胶质瘤患者的术后化疗情况进行随访,寻找少枝胶质瘤患 者预后与和两种蛋白之问的相关性。第二部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 一、材料和方法 .病人:纳入术后随访的病人均为第一部分研究中所用到的肿瘤标本的来源,即 年月.年月年在华山医院神经外科进行开颅肿瘤切除手术、并已在 神经病理科进行分型的患者,并排除患有严重基础疾病及出院时评 分低于分的患者,共有人。 .随访方法:对纳入术后随访的患者,在他们出院时,术后年以及术后年时 分别应用进行评估,记录每名患者的分值。.数据统计:应用 .软件,对随访病人在术后年、术后 年评分的下降情况以及每组标本、的免疫组化分值进行 统计,分别计算种差异蛋白的分值和评分的相关度,并将者的 分值进行整合,再次计算其与评分的相关度并绘制相应的散点图。复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 第二部分 二、结果 .随访病人情况:纳入随访的患者共人,其中因无法耐受化疗反应而自行 停止化疗的患者人,因经济等非医学原因停止化疗的患者人,因通讯原因失 访人,最终完成年随访的患者共人,失访率.%。其中男性患者 名.%,女性患者名.%;正常患者人.%,患 者人.%;正常患者平均年龄.岁,患者平均年龄岁; 正常患者基线评分的平均分为.分,患者基线评分的平 均分为.分。以上各项均无统计学差异表。每名患者在术后年及术后 年的评分情况见,为了排除不同的基线评分对统计结果产生的影响, 我们采用术后年及术后年评分相对于基线的下降分数作为相关性 的数据表。 .免疫组化评分与评分的相关性:我们对和两种蛋白 的免疫组化结果进行评分,并分别计算两种蛋白评分与术后年及术后 年的评分下降分数的相关性。可以见到:的相关性较高, 术后年及术后年的相关系数分别达到..和..;次之,术 后年及术后年的相关系数分别达到..和..图。 我们两种蛋白及的免疫组化评分相加,计算得到的新的评 分与术后年及术后年评分下降分数的相关性,可以得到:术后一年的 相关性为..,术后年的相关性为..,两者在.的置信区间内有显 著差异图。复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预 后与差异蛋白相关性研窒 箜三塑坌 。 , 注:男性,女性, 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 第二部分 表.随访病人情况 项目 总计 正常值 幸. . 第二部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 相关系数..料 第年?减少 免疫组化评分 相关系数一. 第年?减少 免疫组化评分 图:免疫组化分数与第年减少的相关散点图上,与第 年减少的相关散点图下 幸. 第二部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 相关系数. 第年?减少 免疫组化评分 相关系数一. 第年?减少 免疫组化评分 图:免疫组化分数与第年减少的相关散点图上,与第 年减少的相关散点图下 ?丰.第二部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 相关系数..料 第 年 天 勺 ? 减 少 免疫组化评分 相关系数.. 第年?减少 图:免疫组化分数与第年减少的相关散点图上, 与第年减少的相关散点图下 宰宰. 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异 蛋白相关性研究 第二部分 三、讨论: 少枝胶质细胞瘤占脑部胶质瘤的%一%,是常见的成人神经系统恶性肿瘤 之一,也是第一个经临床试验证实其预后与肿瘤的基因特征有关联的中枢神 经系 统肿瘤。 非对照研究发现,在成人少枝胶质细胞瘤患者中,约有%伴有染色体、 的杂合性缺失,而另一方面,儿童患者中的、缺失却很少见‘”。在 成人患者中,、的杂合缺失率在纯少枝胶质细胞瘤中高达%以上,在间 变少枝胶质细胞瘤中为%,在混合低级别少枝星形细胞瘤中为%,间变混合 少枝星形细胞瘤中为%】。对于低级别少枝胶质细胞瘤患者来说,不论是在 年生存率方面% %还是在总生存时间月 月方面,伴 、 杂合性缺失的患者均有明显的优势。这说明在这些染色体上存在目前尚未知 晓的肿瘤抑制基因,在少枝胶质细胞瘤的发生与发展过程中起着重要的作用 【】。 在一些非对照或回顾性研究中,伴有、杂合性缺失的少枝胶质细胞瘤 对化疗治疗更加敏感,并有更长的生存时间】。在个大型三级回顾性研究 中 和 ,研究者以 、 的杂合性 缺失情况同时缺失,单一缺失或不缺失为分类标准,对接收术后放疗及 方案洛莫司汀甲基苄肼长春新碱化疗的问变少枝胶质瘤和问变少枝星形细 胞瘤患者进行统计。在中,不论是还是的杂合性缺失都是与 预后相关的、显著的独立变量;而在中,伴有 、杂合性缺 失的患者在生存率上与不伴杂合性缺失的患者相比明显不同.【。 在复发少枝胶质瘤患者中,伴有杂合性缺失的患者的平均无疾病进展生存期 为个月,明显优于不伴杂合性缺失的患者的.个月.】。 自年发现杂合缺失的少枝胶质瘤患者对替莫哗胺化疗更加敏感 且能较长期生存这一现象以来,各种研究分别应用生存率、平均生存年限、 无疾 ,以及生活质量. 病进展生存期 ,等数据验证了这一观点,并利用同位素标记相对和绝对定量 技术及多维液相色谱串联质谱? /的定量蛋白质组学等方 法找到了两种不同分子类型的少枝胶质瘤表达的差异蛋白。本研究通过 ,的方法再一次验证了少 行为评分 枝胶质瘤的两种分子类型与术后化疗敏感度的关系,并通过对不同杂合缺失 特性的少枝胶质瘤的差异蛋白进行免疫组化分析,采用标准进行半定 量评分,并、与病人的术后随访评分情况进行相关度分析。 等人及 , ..等人分别应通过无疾病进展生存期 第二部分 复旦大学博士学位论文不同杂合缺失特性少枝胶质细胞瘤患者预后与差异蛋白相关性研究 及生活质量. ,等数据验证了对于不同 杂合缺失特性的少枝胶质瘤,术后.个月的差异性最为显著,同时为 了排除患者出院时的基线评分可能对试验结果造成的影响,我们采取术后 年及术后年评分下降分数作为计算数据,发现及两种蛋 白具有较高的相关度,并将两种蛋白的评分进行整合,进一步提高了与预后 评分的相关度卜引。 是目前实验室中检测蛋白质的最常用的手段,通过对电泳条带 与标准蛋白的比较可以知晓蛋白的分子量,而通过对电泳条带吸光度的分析可以 对蛋白质进行相对定量,因此是目前对蛋白质进行定量的较为理想的方法;免疫 组化是临床上常用的对病理进行辅助诊断的方法,操作简单,费用便宜,它可以 通过对细胞内染色的有无进行定性,通过染色的位置进行蛋白的定位,但是它的 缺点是最多只能是半定量分析。因此, 和免疫组化这两种对蛋白质 检测的方法是各有优劣、相辅相成的。由于差异蛋白质主要是量的差别,所 以对 此的研究最好是使用 的方法。由于实验时间及条件的限制,本研究 并没有采用 的方法,而是用免疫组化对已存档的石蜡标本进行半定 量分析,一定程度上影响了试验的精确性。在今后,我们将通过对新鲜肿瘤标本 采样进行 检测,进一步验证两种差异蛋白与肿瘤预后的关系。复旦大学博士学位论文不同口杂合缺失特性少枝胶质细胞瘸患者预后与差异蛋白相关性研究 第二部分 四、结论 .不同杂合缺失特性的少枝胶质瘤在经过正规的替莫唑胺化疗后,其术后 年及术后年的评分有显著差异,少枝胶质瘤具有更好的 评分以及更缓慢的评分下降趋势。 .及两种蛋白与少枝胶质瘤患者术后评分下降有着显著地 相关性,将两种蛋白的评分整合后,这一相关性进一步加强。 .及与少枝胶质瘤的化疗敏感性及预后有关,有望用于临床对 于胶质瘤的预后判断、分子分型和指导治疗,并进一步探讨少枝胶质瘤的发 病机制。
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