相思子毒素抗原、抗体制备及两种免疫学检测方法的建立

相思子毒素抗原、抗体制备及两种免疫学检测方法的建立 ,,,,,,,,分类号:—— 密级:——, , ;:—— 编号:—— 相思子毒素抗原、抗体制备及两种 免疫学检测方法的建立 ,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,;,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,学位授予单位及代码:篮壹堡王盔堂 ,～～～??,学科专业名称及代码:生塑匡堂王握 ，,,, ,,, ,研究方向:生物丝牡 申请学位级别:亟 ?指导教师:王逦堡熬援 研 究 生:基 聪论文起止时间 ,,,,(,—,,,,(, 摘 要 相思了毒素(,,,,,)，类似于蓖麻毒素(,,;,,)，是一种植物蛋白毒素，具有极强的细胞毒性作用，也是一种对公共安全存在潜在威胁的牛物恐怖剂，因此，发展和建立特异、灵敏的检测相思了毒素方法是十分急需、重要的。 本文经对相思(了毒素的传统提取纯化方法的优化、改进，建立了相思了毒素新的提纯制备技术，获取的天然毒素作为建立相应检测方法的参考物质。利用大肠杆菌表达的重组相思了毒素,链蛋白制备了,种动物来源的多克隆抗体，建立了基于胶体金免疫层析、双抗体夹心牛物素(亲和素,,，,,的相思予毒素快速、特异和灵敏的检测鉴定方法。 首先，根据相思予毒素对半乳糖的特异性结合能力，采用亲和层析技术将相思了种了中大部分杂质除去;由于在植物种了中蛋白毒素总是与凝集素并存，根据二者分(了量的差异进行了凝胶过滤层析，去除凝集素，最终获得天然相思予毒素纯品，电泳纯度为,,,。 然后，利用大肠杆菌表达重组相思了毒素,链蛋白，经金属螫合层析法纯化后，将重组相思了毒素,链蛋白抗原免疫大耳白兔、昆明小鼠，分别采集、纯化兔血清多抗和鼠腹水多抗。接着利用兔抗重组相思了毒素,链和鼠抗重组相思了毒素,链多克隆抗体，结合标记技术，分别建立基于双抗体夹心法的胶体金免疫层析检测卡和基于牛物素(亲和素,,，,,的定量检测相思子毒素方法。胶体金与,,，,,法的检测灵敏度分别达到,,,,,,,,、,(,,,,,,,;线性范围分别为:,,,,,,,’,,,,,, ,,,,,、,(,,,,,,,’,,,,,,,,,,回收率分别,,,”,’,,,,，,,(,,’,,’,,,,;变异系数均小于,,,。 最后，采用动物血清及几种常见食品模拟环境样品，蓖麻毒素及其他常见毒素评价显示两法特异性良好，模拟环境试验的样品检测敏感性相同。关键词:相思子毒素;重组相思子毒素,链;多克隆抗体;胶体金免疫层析;生物素(亲和素 ,,，,,定量检测 ,,,,,,,, ,,,,,，,,,;, ,, ,,,,,,, 簦?,,;,,，,, ,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,(，, ,,,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,; ,,,,;,，,,, ,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,;, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,; ,,;,,,,,(,,,,,,,,,，,, ,, ,,,,,,,,, ,,, ,,;,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,,,;, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,;,,,;,,, ,,, ,,,,,,,,,,,( ，, ,,,, ,,,,,’,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,(,, , ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,,;, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,;,,,,,,,,,,, ,,,,, ,—;,,,, ,,,,,,, ,, , ;,,,(,,, ,,,,;,,,, ,,,,,, ,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,,,;, ,,,,,,(,,,,,, ,,，,, ,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,, ,,,;,,,; ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,( ,,,,, ,, ,,,，,,,, 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,，,，,’，,’一,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,—,,,,,,, 四甲摹乙二胺 ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,,—,,,,,;,,,,,,,,十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝,,,(,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 胶电泳 ，,,, ，,,,,,,,, ,,,?,?,,,,,,,,;,,,,, 异丙基硫代,,,,一半乳糖苷 ,(,,,, ,,;,,,(,,,,,,,,,,,;,,,; ,;,, 镍离子(次氨基三乙酸 ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, 牛血清白蛋白 ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 辣根过氧化物酶 ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,;,,,,,,, 二氨基联苯胺 ,,，,, ,,,,,,(,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, 酶联免疫,吸附实验 ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, 二甲基亚砜 ,,,, ,,,,,,,,, ,,,, 半数致死量 ,,,, ,,,,(,,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,, 二羟甲基氨罐甲烷 ,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烷基磺酸钠 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的硕士学位论文， 《相思子毒素抗原抗体制备及两种免疫 ，学方法的建立》是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名: 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版权使用规定’’，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名: ——年——月——同 指导导师签名: ——年——月——同 第一章绪论 ,(,相思子毒素概述 ,(,(,相思子毒素的毒性 相思子毒素的毒性相思予毒素是从豆科藤本植物相思予(,,,,,,,,;,,,,,,,)的种子中 提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子,(,,’,,’,(,,。相思予毒素存在,种 同族毒素(,,,,,,,,,)，即,,,,,,,、,,,,,(,、,,,,,(;、和,,,,,(,，相对分子质最介于,,,,,”,,, ,,,,,之间，它们由不同的基冈所编码，但同属于一个多基因家族;其中,,,,,—,、,,,,,—; 由于其,链凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用;而,,,,,(,、,,,,,(,则有极强的细胞 毒性，小鼠的,,,,为,(,,,，,,,,，成年人摄入的致死剂量为,(,,,,,,’,,(,，，,,,,，其毒性强 度是蓖麻毒素(小鼠,,,,,(,,,,,,)的,,多倍，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖 病原物质之一。相思子毒素中毒后，通常要经数小时至数天的潜伏期才出现综合征。可表 现为口腔灼烧感、吞咽闲难、恶心、呕吐、血痢、腹部痉挛性疼痛、昏睡、定向障碍、惊 厥、黏膜发绀、昏迷、循环衰竭、视网膜出血、血尿和少尿等症状。经静脉注射或皮下给 药，临床症状与经消化道给药相似，但胃肠道症状较轻，而注射部位通常会发生严重的炎症【,,。 ,(,(,相思子毒素的物理性质 纯化后的相思子毒素为微黄白色无定形粉末，无味，易溶于水、氯化钠和甘油溶液，不耐热。,,?经,, ,,,,部分失活，,,?经,, ,,,则大部分失活，,,,”,经,, ,,,,毒性及抗肿痛活性完全消失，印度安达曼岛上居民将相思子种子煮熟后作为食物食用。完整的相思予毒素经反复冰冻和融化对其毒性影响很小。在,(, ,,,,,半乳糖溶液中，毒素可在冰箱中储存数月而不会失活。分离开的链要比完整毒素更不稳定【,,。,(,(,相思子毒素的作用机理 在相思予毒素的,、,链中，,链是一种对半乳糖具有特殊亲和力的凝集素，可以与细胞表面含半乳糖残基的受体结合。进入细胞后，,链具有,糖苷酶活性，可以专一水解核糖体,,,第, ,,,位腺苷酸的,(,糖苷键而使核糖体失活，进而影响蛋白质的合成,,,。相思予毒素的吸收途径类似蓖麻毒素，即通过,链连接在细胞表而含有半乳糖末端的糖蛋白和脂蛋白上进入细胞，每个细胞可以结合近,,,个相思予毒素分子。相思予毒素对真核细胞的作用包括:?,链结合于细胞膜上的受体;?完整相思予毒素或片段跨膜转运进入胞质;?通过,链催化失活核糖体，抑制蛋白质的合成。无论通过何种途径入胞，相思子毒素进入细胞内可能定位于南单位膜形成的小泡和管状结构内。毒素内化后具有逆行转运的特点，即通过膜泡将毒素运输到高尔摹堆，形成分泌囊泡进一步转运到内质网，其中有极少最的毒素到达胞质。,链被运至核糖体后，发挥其,糖苷酶的作用，可催化真核细胞核糖体,, ,大亚基的,, , ,,,,的第, ,,,何脱腺嘌岭，使之不与延长因子(,结合，从 而抑制蛋白质合成过程中多肽链的移位，最终冈蛋白质合成障碍导致细胞死亡【,’,】。相思 予毒紊对细菌核糖体无效，植物细胞的核糖体比 动物细胞的核糖体对相思子毒素的敏感性 弱。 ,(,建立相思子植物类生物毒素检测方法的必要性 自美国遭受,(,,恐怖袭击和炭疽芽孢事件发生后，世界各国开始高度关注生物恐怖袭 击。特别是近年多名恐怖分了携蓖麻毒素惊现英国首都伦敦之后，这种致命的、毒性极强 的牛物毒素，已被美国疾病预防控制中心(,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,)列为最有可 能作为生物恐怖袭击的生物战剂,,】;在《禁止化学武器公约》中，蓖麻毒素也被列为最为 严格的控制对象之一。相思予毒素与蓖麻毒素类似，毒性都在斗,,,,级，相思子毒素的毒 性还稍高于蓖麻毒素,,’,】。自蓖麻毒素被列入禁控化学毒剂清单之后，许多国家对于把相 思子毒素用作生化战剂的兴趣明显增长了。 但直到目前，对蓖麻毒素、相思子毒素等生物毒素的榆测鉴定方法仍以,,世纪中期 建立起来的动物效应试验、免疫试验等技术为主，由于剧毒毒素抗体制备难度大、存在交 叉反应等自身技术限制，无法实现对未知复杂样本的鉴定，并且不能给出确切的结构鉴定 信息。因此，在当前国内外严峻的反恐形势下，寻求新的对蓖麻毒素、相思予毒素快速,有效的鉴定方法，具有十分现实的军事和民防价值。 ,(,相思子类植物毒素的检测鉴定方法 针对蓖麻毒素中毒，目前国内外还没有适用于人的解毒药和特异抗毒素等专用特效药。针对这一现状，对蓖麻类毒素等生物战剂医学防护领域的研究，重点应集中在侦榆、治疗和疫苗预防等方面。目前免疫技术,,,,,，是检测蓖麻毒素中毒的最常用技术手段，主要有放射性免疫法(,,,,,,,,,,,,,,,,，,，,)和酶联免疫吸附法(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,, ,,,,,，,,，,,)。 ,，,技术主要是通过使用放射性元素,,,，对毒素进行标记，实现对蓖麻毒素中毒的检测和监控。这一方法非常适宜应用于对中毒患者血液中蓖麻毒素的含量检查以及法医学攀定，最低检测限可达,,,,,,,,,,,〔,,,〕。其缺点是放射性元素的处理比较麻烦，且耗时较长。,,，,,技术现已被广泛的应用于生物样本中蓖麻毒素的检测,,,？,,，最低检测限可以达到,,,,幽,,。基于免疫技术的生物传感器,,,，,,,也被应用于榆测毒素和生物战剂，利用毒素不同的响应元件作为传感器的敏感组件，可以同时测定多种毒素毒剂，小巧轻便，适于野外及现场的使用。 上述方法虽然灵敏度高，侗对于样品的检测有很大的局限性:首先，剧毒毒素的抗体获得比较困难，放射性免疫检定还要求至少知道分析物的部分一级结构;另外，,,，,,法孵育时间长，不适合作为现场检测。上述方法已经满足不了当代防恐需要，迫切需要可以现场、快速、定最检测相思子毒素的方法。 ,(,，,现场快速揎测—胶体金免疫层析技术 ,(, ,(,胶体盒免痉层析试验描述 胶体金免疫层析试验(,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,)是以微孔膜为周相载体，借助毛 细管虹吸引力(层析作用)使液体样品在条状膜上泳动。免疫层析试验又被称为侧向流动 试验(,,,,,,, ,,,,和,,,?,,,,, ,,,,)，其原理是将已知的特异性抗原(或抗体)周定于膜 卜作为检翘，带(,,,,,,,,)(捕获线(;,,,,,,,,,,)，标记物，,‘燥在玻璃纤维的结合释放垫上， 其一端与膜相连，另一端与样品垫相连，膜的另一端连有吸水垫(图,,)。当加入液体样 品(全血、血清、尿或其他体液),舌(样品通过毛细管的扩散作用向前移动，并通过舍标 记物的玻璃纤维膜，使胺体金标记物重新水化(并与胶体象标记物结台，然后一起延膜向 前泳动，至检测线(周 定有特异性抗体)，这样标记物与待检物的复台物会被检测线截获， 聚集在检测带上而出现明显而直观的红色结果。如果样品叶,不含特授物，则会和游氡昙?物一同越过检测线，到达质控线(;,,,,,,,,,,)或试验终,,线(,,,,,,,,,,,,,,)(来判定试 验的中止时间)。试验多采用夹心法检测抗原或抗体，也有采用双孔问接法或反流免疫层 析法检测，,,和,,,，对于小分子抗原来说则宜采用竞争抑制法(如，药物滥用、类同醇 的测定等)。 黜,,。,。,, , , ,眢。 ,,,，跚, ,,上一 ,?,一，黼” ? 固, ,层析实骑示意罔上图为俯视罔，,罔为侧视图 免疫层析试验叉称为一步法”试验，由丁其更加简便、快速，特异性币,敏感忭都可以和,【一，,,方法柑媲美，因此得到根快的发展，并投入犬规模的商业牛产。试验装胄的形式可以多种多样有的是独立浸入式试纸条，有的是将试纸条附着在硬纸卡或塑料外壳里面，其外壳形式也很多。浸入式试纸条的使用更期，方便。现在临床检验、环境保护、农业生产、兽医检验和优生优育中都有广泛应用。,(,(,(,免疫层析装置 免疫层析试验常见的有试纸条式、乍式和盒式。其基本形式为试纸条，一般由样品垫 (,,,,,,,,,)、结合垫(;,,,,,,,,,,,或结合物释放垫;,,,,,,,, ,,,,,,,,,,)、硝酸纤维素膜(,;)、吸水垫(,,,,,,,,,,,,)和带有枯合剂(胶)的底衬卡(,,;,,,,;,,,或,,,,,,,,;,,,)五个部分组成。不同的试验可能有稍许变化(如果使用全血为样本，常在样品垫一卜附着一层血液过滤垫，或直接用该材料代替样品垫。龠式形式也多种多样，但是一般为一长扁型塑料小盒，顶部有一个加样孔，一个观察〔,，外壳还有一些产品和试验标识，试纸条固定在底部的凹槽中。书状,式则较为复杂，常为捕获法或逆流免疫层析试验,『，采用。如陶, ,。 陡眨 ,一、((，,,墨 丽 , 墼篁童二’,夏豆匦 出 她皿 〕互蛋沁,沁) 叮,,,,,,,, 赫台参 一口囱: 圈,(,各种免疫层析试验装置,(,(,(,使用方法 免疫层析试验使用非常简便，只要按照说明将试纸条浸入样品中，或将一定量的样品加入加样孔中。然后平放数分钟后观察结果，对于一般试验(双抗体夹心法)阳性结果为两条红色线，阴性结果只有质控线为红色，如果质控线没有出现则示为失效。, , ,(,反应原理和模式 以膜为固相的快速试验的反应模式基本与,,，,,相似，但是困其固相载体的不同，在试验方式上也有不同，几种常见的反应模式为:双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。本实验所用的方法采用职抗体夹心法，下面简单介绍下双抗体夹心法: 双抗体夹心法是用于检测病睬微生物性大分子抗原常采用的方法，应用非常广泛。免疫渗滤试验的基本原理就是将特异性抗体固定到固相膜上，干燥封闭后，加入待测标本，使其中的抗原与特异性抗体发生抗原抗体免疫反应，再加入金标记特异性抗体。如果存在待测抗原就会出现红色斑点。 免疫层析试验中原理是将液体样品加入样品垫，它们快速地通过结合释放垫时溶解指示剂(金标记抗体)，指示剂和样品一起延膜向前移动;如果样品中含有待检物，会形成金标抗体一待检物复合物，继续向前泳动，当复合物通过固定有捕获线的区域时，待检物一金标抗体复台物被捕获，形成金标抗体一待检物抗原一捕获抗体夹心复合物，出现红色的阳性结果:没有被结合的金标抗体则会被质控线(一般为抗一抗体)捕获，形成红色的指示信号。样品中存在检测物的量与最后出现的颜色成正比。使用此法检测的抗原必需是大分子抗原(要求至少有两个或两个以上的抗原决定簇;故不可以用此 法检测半抗原或小分子抗原。抗体可以使用特异性多克隆抗体同时作为捕获抗体和标记抗体，也可使用与抗原不同位点反应的一对单克隆抗体(双位点)，其中一组作为捕获抗体，一组作为标记抗体。在多克隆和单克隆抗体复合体系中，最好使用多克隆抗体作为捕获抗体，单克隆抗体作为标记抗体。例如乙肝表面抗原(,,,,,)、乙肝,抗原?,,,由、淋球菌(,,哪的检测都可采用双抗体夹心法。 反应景建 图,(,职抗体灭心法币意图, , ,生物素一亲合素放大技术 ,,世纪,,年代后期在免疫酵技术中利用生物素,亲和素系(,,,,,,—,,,,,,,,,,,,，,,,)标记抗体发腥了又一种新型生物反应放大技术，巳, ,,,(,,，,,技术，它使用牛物素,亲和素一过氧化物酶复合物作为指乐剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。生物素(,,,,,,)是广泛分布于动植物体内的一种牛长因了，又称辅酶,或维生素,。亲和素,,,,,,,,是卵白及某些微牛物中的一种蚩白质，由,个亚学位组成。二者有高度亲和力(且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。 在生物素(亲手?素系统中，借助所形成的亲和素一牛物素一酶复台物，追踪生物紊标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应的抗体或抗原。由于抗原或抗体分了可偶联多个牛物素，且,个亲和素分了可结台,个生物素分子，组成新的生物放大系统，进一步提高检测的灵敏度。由于,,,亲和力高，所以具有高灵敏度、高特异性和稳定性等优点，在现代生物免疫学领域中已得到广泛应用，并显示出明恩的优越性。已撒道有用于放射免疫、免疫荧光和免疫电镜等技术叶,，但应用更多的,,,是在酶免疫技术中。 ,,,用于椅测的基本方法可分为三大类:第一类是标记亲和素连接生物素化大分了反应体系，称,,法，或标记亲和索生物素法(,,,);第一类以亲和素两端分,?连接牛物素化大分子反应体系和标记牛物索，称为,,,法，或桥联亲和素一生物素法(,,,,):第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素一牛物素一过氧化物酶复合物，再与牛物素化的抗抗体接触时(将抗原一抗体反应体系与,,,标记体系连成一体，称为,,,法。,,,(,生物素(,,,,,,，, , 生物索广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(,型)和肝组织(,型)，提取,,两型的生物活性基本相同，现已,,工合成。牛物翥扯机体内以辅酶形式参与吾种援化酶反应，故义称为辅酶,或维牛素,。分子量为,,, ,,，分予中有两个环状结构，其中，环为眯唑酮环，是与亲台紊结台的主要部位;，，环为噻唑环(上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。 利用生物素的羧基加以化学修饰町制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以 适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素,(羟基丁二酰 亚胺酯(,,,,)和生物素对硝基酚酯(,,,,)，其中以,,,,最常用。近年来，应用活化长 臂生物素(,,,,,)标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼(,,,)及肼化生物素(,,,,)。,(,(,(,亲合素(,,,,,,，,) 亲合素亦称抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白:等电点(,,为,,,,,(,，含糖约,,,，分子量为,,,,,。纯品为白.