高效氯氰菊酯抗雄激素效应及机制研究

高效氯氰菊酯抗雄激素效应及机制研究 目 录 缩略词表中文摘要英文摘要序言 第一部分高效氯氰菊酯对成年雄性大鼠生殖系统的影响””?”” 前言刖吾??“‘ 材料和方法? .材料? .方法结果? 讨论? 论文图片第二部分高效氯氰菊酯的雄激素受体基因试验研究 前言刖舌”??“?”材料和方法? .材料? .方法?” 结果?“?“”??”?””“? 讨论 论文图片??结论 参考 综述 攻读 致谢 论文 论文 雄激素效应元件 拮抗剂 双酚高效氯氰菊酯 半乳糖苷酶 氯霉素乙酰转移酶 结合域内分泌干扰物 内分泌干扰物筛选和鉴定咨询委员会 食品质量保护法 基因转染 糖皮质激素元件 配体结合域 利谷隆多溴联苯醚 ’一 ’ ’二氯二苯二氯乙 烯拟除虫菊酯类农药 ? 双氢睾酮 ? 高效氯氰菊酯抗雄激素效应及机制研究 摘要 高效氯氰菊酯.属于拟除虫菊酯类农药,现被广泛使用于农业生产中。 动物研究表明该农药对精子数量、形态和运动能力有损伤作用,人群资料也 进一 步显示其对男性生殖系统存在潜在性危害。高效氯氰菊酯是重要的环境内分泌干 扰物,其致雄男性生殖毒性的毒作用机制较为复杂,可能与雄激素受体 介导的信号通路有关。受体报告基因实验也称受体转录激活试验,是推荐的 用于环境内分泌干扰物筛选的 方法之一。研究表明,这种方法即 可检测化学物与受体结合的能力,又可检测结合后引起的生物学效应,而且能够 区分激动剂和拮抗剂,与受体结合试验相比可提供更多的信息,因此成为 筛选的有力工具。本研究将动物实验和受体报告基因试验结合,阐明的抗雄 激素效应及其作用机制,为揭示拟除虫菊酯类农药的抗雄激素效应机制提供重要 依据,并为其他化学物质的研究提供新的思路和技术平台。 第一部分 高效氯氰菊酯对成年雄性大鼠生殖系统的影响 目的选择高效氯氰菊酯为研究对象,研究其对雄性生殖系统的损 伤作用及机制。 方法选择成年雄性啮齿类动物天染毒试验,按体重将只成年雄性 大鼠随机分为中、低剂量和对照共三组,每组只。中、低剂量组灌胃量分别按 灌胃天,对照组则每天给与同体积玉米油。 和 / 天后称大鼠终重并处死,将睾丸、附睾和精囊取出分别称重。一侧睾丸用于 精子 头计数实验,另一侧睾丸通过对其做免疫组化实验来观测雄激素受体的表 达。 结果 与对照组相比,给药组的精子头计数和每日精子生成量明显减少 .,且水平也显著降低,三个组的灰度值分别为.?.、. ?.和. .,差异有统计学意义.。 结论对雄性生殖系统是有损伤作用的,抑制的表达可能是其引起 精子数下降的重要机制之一。 关键词环境内分泌干扰物;高效氯氰菊酯;雄激素受体;精子生成;农药 第二部分 高效氯氰菊酯的雄激素受体报告基因试验研究 目的通过报告基因试验检测是否是拮抗剂。 方法建立以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的雄激素受体报 盆刿匡堂堕塑?堂焦迨塞 告基因试验。将表达的质粒/.、重组报告基因质粒 和阳性对照质粒.共转染非洲猴肾细胞株.,以.双氢争酮. 为阳性对照。转染后用高效氯氰菊酯染毒,通过检测该物质作用下 的蛋白表达水平,间接反应内源性基因的表达情况,进一步确定与内 源性雄激素竞争结合的能力。 .一的浓度范围内能拮抗 的.诱导的 结果在一 的表达,并且在浓度为 时对.的拮抗作用较明显,其 一。 为.:. 结论属于拮抗剂,是通过抑制的正常功能产生抗雄激素效应。 关键词雄激素受体报告基因试验;氯霉素乙酰转移酶;.双氢争酮;内源 性基因 金幽匡鲎瞳塑?鲎焦迨塞? . , /, ., . . , . . .,?. , / . 一 , ,. ,../ ,, / . . . .,. .,. .一 . /. 凡 ?.. . . ?. ~... . ; ; ;; 序 言 年《寂静的春天》一的发表,引发了公众对环境中存在的大量化学物 质及相关污染问题的高度关注】。这本书将环境保护问题提到了各国政府面 前, 各种环境保护组织纷纷成立,并于年月在威斯康星州拉辛温斯普里德 会议中心召开会议,共同评估环境化学物对人类和野生动物的性发 育造成的影响。研究人员意识到内分泌干扰可能是导致野生动物种群数量下 降的 原因.。人类健康也受到了影响。在这次会议上,名科学家发表了一份书面警 告,即著名的《温斯普里德共识声明》,呼吁科学家对这些化学物质进行研究, 并且提出了内分泌干扰物的概念【。自此有关环境内分泌干扰物的研究 成为一个专门的研究领域。年,美国国会通过食品质量保护法 ,修正 ,和安全饮用水法 案,督促成立内分泌干扰物筛选和鉴定咨询委员会 ,。年,将定义为以科学原理、数据、重量证据和预防原则为基础,能够改变 内分泌系统的 正常功能,对生物体的后代、数量或亚群产生有害效应的外源性化学物质或 混合 物【。 以前的文献对环境雌激素的报道较多,着重对环境雌激素筛检和作用机制进 行研究,近年来环境抗雄激素也日益受到重视。生物体在产前或围产期暴露于这一 ??????????,?????????? 类物质,可导致雄性后代生殖系统发育和功能异常,表现为精子数量降低,尿道 下裂,隐睾及睾丸肿瘤等症状【,如资料所显示,近年来人的精液量和精子数目 减少了一半左右【引,从早期认为人精液中含×个/精子是正常标准,到后来 此标准降低为×个/,据年标准:人类精液中含×个/ 精子即认为是正常的。男性生殖系统发育异常主要是隐睾和尿道下裂和睾丸肿 瘤的发病率几乎增加了一倍】,流行病学研究数据显示,隐睾的发病率从年的 %上升至年的%【们,同期尿道下裂的发病率在欧洲和美国均有所上升?】。 因此这一类物质被怀疑可能是造成上述现象的最主要原因【?。一些国家和国际组 织相继筛选出危害极大、亟需控制的名单。全球野生生物基金会于 盆刿匡堂瞳塑?生焦迨童 年列出了种,其中农药及其代谢产物占种。 农药被广泛用于防治病、虫、草害,目前传统的农业生产普遍依赖农药的使 用。国家质检总局数据显示,目前我国农药年生产量万吨左右,每年施用农药 达.万吨,其中约%的农药直接进入环境。农药可能自行流失或在环境介质 如空气,土壤和水中循环,最终进入周围环境中。同时在家庭环境中也存在接触 农药的风险,如食用含有农药残余的谷物、水果和蔬菜等【.?】。人类因为处于食 物链的最高端有可能导致体内积聚有较高浓度的农药。 随着研究的发展,越来越多的证据表明,许多农药具有类雌激素或抗雄激素 的作用,对人类和动物的生育率及发展已构成潜在的威胁【 .?。有些农 药已被证实与某些人类和动物的雄性生殖和发育的损伤有关,如发育不良、雄激 素依赖组织和睾丸异常、精子数量减少、精子运动能力变化、精子形态异常和遗 传毒性效应【.’?’,?】。苏丹等也发现具有抗雄激素活性的化合物可能会导 致野生动物繁殖退化和如精子质量下降一类的人类男性生殖系统的异常扪。因此, 农药造成的雄性生殖损害可能与内分泌干扰有关,迫切需要对这一类物质的内分 泌干扰作用开展进一步的研究。 目前对雄激素干扰物的研究主要集中在建立拥和订阳试验对抗雄 激素活性进行识别和评价。 试验考虑到化学物在体内的吸收、分布、代谢 和排泄等生物转运和生物转化过程,可以全面反映化学物的内分泌干扰作用,具 有相对的准确性和权威性【’?。成年雄性啮齿类动物天染毒试验 阳筛选试验 . 是美国环境保护署推荐的的 【。在一定的控制条件下对已分组的实验大鼠给予不同剂量农药,天后处死并 解剖,取生殖系统相关脏器进行检测,评价受试物对雄性大鼠生殖系统的影 响。而 试验因为其快速、方便、经济的特点,在筛选中获得快速发 展。由于介导是某些抗雄激素物质作用的主要机制,以此为理论依据而建立的 报告基因实验则成为重要的 加研究手段。报告基因实验是将表达 质粒和受雄激素效应元件调控的报告基因质粒共转染哺乳动物细胞株, 毒理学教研室报道建立了报告基因实验【。我们在前期工作中,也不展了相 关的研究。主要将受调控的报告基因质粒.与表达质粒 /.共转染非洲猴肾细胞株.,研究表明这一方法具有较高的灵敏度、 重复性和特异性【。报告基因实验为抗雄激素物质的研究提供了技术手段,可 以在种类繁多的物质中初步筛选出具有抗雄激素活性的化学物,是开展抗雄激素 效应研究的起始步骤,为下一步的研究提供研究方向。在建立报告基因实验 的 基础上,前期我们对一些物质的抗雄激素活性进行了检测。研究表明,某些拟除 虫菊酯类农药是拮抗剂’柏,这一结果与等的结论一致【】。 本研究选取拟除虫菊酯类农药高效氯氰菊酯为研究对象,采用成年 雄性啮齿类动物天染毒试验研究一的生殖毒性,并探讨在生殖危害发生中 的作用;进一步应用报告基因实验研究.抗雄激素作用的分子机制。 农药被广泛应用于农作物病、虫害的防治,我国是农药生产和使用大国,每 年防治农作物病虫害面积多亿亩次,年全国农药需求总量有效成分预 计为.万吨,超过美国而成为全球第一用药大国。在一些高产地区,过量使用 的问题十分严重。中国农业科学院的一项研究结果显示,我国农药的过量使用在 水稻生产中达%,在棉花生产中超过%。拟除虫菊酯类农药是在天然除虫菊 酯研究的基础上发展起来的具有高效、广谱、快速击倒等特性的杀虫剂,其使用 量仅次于有机磷农药。自年月同起,我国全面禁止了甲胺磷等种高毒有机 磷农药在农业上使用,因此拟除虫菊酯类农药的需求量还将有所上升,目前主要 用于防治棉花、蔬菜、果树等多种作物上的害虫,有些还作为卫生杀虫剂在室内 灭蝇灭蚊而被广泛使用。随着拟除虫菊酯类农药使用范围的不断扩大和使用量的 不断增加,人类的接触机会和接触量逐渐增多。 目前,已有很多资料报道某些拟除虫菊酯类农药具有雄性生殖毒性。 等研究认为氯氰菊酯可引起雄性大鼠生育力明显下降、附睾及睾丸精子总数和每 日精子生成量明显减少?。等发现氰戊菊酯可引起工人精子质量的变化【】。 动物试验发现氰戊菊酯和辛硫磷可致雄性大鼠睾丸病变 和精子活力改变【。研究数据表明,研究对象出现的精子形态异常和遗传毒性缺 陷可能与氰戊菊酯暴露有关【?。等也报道了氯菊酯、氯氰菊酯和氰戊菊酯 三种拟除虫菊酯类农药均表现出抗雄激素活性【柏。另外,人群调查结果显示拟除 虫菊酯农药暴露可引起工人精液质量下降,造成精子损伤【】。 盆刿匡生睦塑?堂焦缝塞 雄激素是诱导性分化、形成雄性第二性征和维持精子发生的重要配体,抗雄 激素的最终效应是导致生物体的生殖障碍。雄激素与结合后发挥正常功能,启 动后续靶基因转录。睾丸中缺乏或异常可导致雄激素功能异常,对男性生殖系 统产生不良影响,因此化学物抗雄激素作用可能与干扰的正常表达或介导的信 号通路有关。 自世纪年代以来,作为一种拟除虫菊酯类农药,一因其高效、安全、 广谱及对人类和牲畜低毒等特性,被国内广泛应用于农业害虫控制,其市场 数量 占拟除虫菊酯类农药的一半以上【。人群暴露于.的风险很高,已经有资 料显示.对男性生殖和发育有类似抗雄激素的作用【蛔。因此进一步研究. 对雄性生殖系统的不良效应及其机制是非常必要的,可以为的安全性评价和 农药的危险度评估提供一定的科学依据。 美国环境保护署推荐成年雄性啮齿类动物天染毒试验作为筛选 的订试验【。本项研究采用此种试验方法评价.对雄性生殖系统的影响, 通过比较脏器系数、每日精子生成量来检测其抗雄激素作用。为进一步研究 的作用机制,我们采用了免疫组织化学检测的表达,根据的水平分析 是否通过降低表达来产生内分泌干扰作用。 材料和方法 主要试剂材料与设备 . 药品试剂 南京农药厂 高效氯氰菊酯,含量不少于.%。 金龙鱼谷物调和油.升,生产日期年月 徐州家乐福超市 即用型免疫组化染色试剂盒 武汉博士德生物技术有限公司 枸橼酸盐固体 武汉博士德生物技术有限公司 酶底物显色剂 武汉博士德生物技术有限公司 抗体稀释液 武汉博士德生物技术有限公司 多聚赖氨酸处理过的载玻片 武汉博士德生物技术有限公司 . 北京中杉生物科技有限公司 .实验用溶液 硫柳汞曲拉通:氯化钠.,硫柳汞,曲拉通 ..溶于蒸馏水中,保存。 实验中所用到的双蒸水、去离子水、缓冲液 ...、苏木素、 盐酸酸化酒精、染蓝试剂、%乙醇、%乙醇、二甲苯、封闭油、盖玻片等 都由徐州医学院病理实验室提供。 .主要仪器设备 电子天平 上海良平仪器仪表有限公司 调速式高速分散器. 中国厦门其林贝尔仪器制造有限公司 生物显微? 日本公司 图像拍摄系统 同本公司 电热恒温培养干燥两用箱 中国厦门电子医疗仪器厂 方法剂量分别为 , 和/ ,.溶解在油中 / 另外一组为对照组,给予等量的油 / 。采用灌胃法染毒,每天一次, 连续天,每三天称重一次,根据体重调整灌胃剂量。 .脏器系数 天染毒结束后,所有实验大鼠称终重、记录,以断头方式处死并解剖。分 离睾丸、附睾和精囊,并分别称重、记录。称重后,一侧睾丸保存于,用于 精子头计数,另一侧保存于%的福尔马林溶液用于免疫组织化学检测。脏器系 数的计算公式如下:脏器重量/终重×%。 .精子头计数 采用等【】建立的方法,进行适当改进,具体操作如下: 睾丸匀浆的制备取冰冻的睾丸,将睾丸纵行切开实质等分,用 镊子撕去被膜将这一半睾丸组织精确称重。睾丸实质剪碎后转移到匀浆管中, 定 容到。应用高速分散器以第档的速度匀浆分钟,放置分钟以消除泡沫。 精子头计数:将匀浆充分混匀,吸取约到血球计数板的两个样品槽中。为 便于计数,将计数板置于铺有湿布的培养皿中分钟以使所有的精子头计数都 固 定于计数板的同一焦面上。在倍物镜的显微镜下进行精子头计数。首先聚焦 于 中心格左上角的方格中方格,计数该格中的精子头数。然后,计数、、 和格中的精子头数,并计算两个孔计数的平均值,即可表示个格精子头数量 的平均水平。 计算:每克组织中精子头的数量用以下公式计算:精子头计数的平均值 方格系数×血细胞计数板系数×稀释系数?组织重量。此 捡刿匡鲎堕塑?堂垡迨塞 处方格系数为计数了中心方格的/,血细胞计数板系数为中心方格的 体积为.,稀释系数是的总体积以计。精子头计数值除以产 生抗匀浆的细胞所需的时间以天数计,大鼠.天,即可得到每克睾丸每日精 子生成量。 .免疫组织化学 按照武汉博士德生物技术有限公司提供的即用型免疫组化染色试剂盒 使用说明书操作,具体步骤如下: 切片常规脱蜡至水一% 份蒸馏水份混合,室温分钟灭火内源 性酶,蒸馏水洗次一将切片浸入.枸橼酸盐缓冲液.,微波炉加热 ...洗涤次一滴 至沸腾后断电,间隔分钟后,反复次冷却后 加%封闭液,室温分钟,甩去多于液体,不洗一滴加适当稀释的一抗 分钟,洗分钟次一滴加试剂 过夜一滴加生物素化山羊抗兔,。 , 分钟,洗分钟次一显色一苏木素轻度复染一脱水 一透明一封片一镜下观察。 利用. .图像分析软件测定阳性表达水平,将图像转 化为灰图,根据计算机计算出的狄度值来间接反映以细胞核和或细胞浆内阳 性表达的强弱。 数据统计分析方法 实验数据用.统计软件,以均数士标准差:的形式记录, 经方差齐性检验,采用单因素方差分析和’多重比较来处理数 据。检验水准.,双侧。结 果 染毒后各组大鼠脏器系数的变化 .染毒后对大鼠睾丸、附睾和精囊腺脏器系数的影响表现为:两个染毒组 与对照组均无统计学差异表。 睾丸精子头计数及每日精子生成量的变化 由表可见,两个染毒组的精子头计数和每日精子生成量明显降低,与对照 组相比差异均有统计学意义。 ?/ 剂量组和 ?/ 剂量组相比,精子头计数和每日精子生成量减少,两组间也有统计学差异。 睾丸中免疫组织化学检测 计算机辅助分析照片灰度值可以间接反映表达的水平。由图可见,两个 染毒组数值明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义。 讨 论 目前学者关于环境污染物中具有抗雄激素作用的一类物质做了大量研究【 ,引,已证实这些环境抗雄激素和发病率逐渐升高的男性性分化异常有关,如 尿道 下裂、隐睾症、精子数量和质量降低等【。其中介导已成为研究的焦点 ,,】。相继有研究认为.,双酚等农药都表现为对的 拮抗作用,它们能够与结合并抑制后续的基因转录【.??。等研究发现 环境抗雄激素影响男性性发育和性成熟,包括男性生殖器官和精子生成的维持】。 已经有体外试验研究表明许多拟除虫菊酯类农药及其代谢物可以通过干扰 信号通路产生抗雄激素作用【”。然而, 和 试验的结果在某些 方面未必是一致的。等对农药顺式氰戊菊酯、氰戊菊酯和氯菊酯分别进 行了体内试验,未检测出其中任何一种表现出抗雄激素作用【。等也通过 体内研究发现一种人工合成的拟除虫菊酯类农药右旋苯醚菊酯,即使在高浓度下 也没有对生殖系统产生有害影响【】。在我们的研究中,染毒组大鼠的睾丸、附睾 和精囊腺的脏器系数与对照组相比差异没有统计学意义,这和及 先前的研究报道是相符的。 为进一步探讨对男性生殖系统潜在的损伤作用,我们在试验中还采用了 精子头计数和计算每同精子生成量的方法。这种方法重复性和可靠性好,因此被 应用于评估毒作用对精子生成的影响试验【。睾丸中精子头计数的降低反映了 生精细胞的死亡。我们试验中三个组大鼠睾丸的重量并无统计学差异。但是, 与对照组相比,低剂量组和高剂量组的精子头计数及每同精子生成量呈递减趋势, 且差异均有统计学意义。这个结果表明.能够阻碍精子的发生过程。 研究显示位于睾丸的精曲小管内,对男性性分化、性发育和生殖功能的维 盆刿匿生堕塑?堂垡迨主 持发挥着重要作用,雄激素的生物学活性就是通过细胞内的介导的【。 等研究发现大鼠敲除了睾丸中的后,其精曲小管内的细胞数量减少并且细 胞体积变小。另外,也有试验证实基因突变会导致与雄激素不敏感相关的一系 列异常,包括从完全的女性化到表型男性不育症【。因为在精子发生和维持 中是必需的,所以农药抗雄激素作用的潜在机制可能与影响表达有关。 研究人员曾采用免疫组织化学的方法观察睾丸中的阳性表达,并且利用计 算机辅助分析来间接检测睾丸中表达的水平【】。在我们的试验中,染毒组 大鼠睾丸中的水平明显降低,表明对大鼠睾丸的损伤作用与表达减 少有关,可能是引起的精子生成量减少的重要机制之一。已有研究报道 是维持正常的精子发生的重要物质【.。我们的实验结果显示作为一种拟除虫菊 酯类农药,能够减少精子生成量,因此对男性繁殖存在潜在危险。这种干扰 精子发生的作用可能是导致一些国家男性平均精子数量降低的原因【引。我们的研 究为进一步探讨农药抗雄激素作用的发生机制提供了基础,下一步拟调整受试药 物的浓度到毫克水平,并且将对血液、肝脏和肾脏中药物的浓度进行检测 和分析。 总之,本研究通过成年雄性大鼠天染毒试验证实了暴露 于农药可导致大鼠精子生成减少。因此,日常生活中凡能接触到的情 况都可能给动物甚至是人类的生殖健康带来危害。试验中染毒组大鼠的水平 明 显降低,我们推测抑制表达可能是减少精子生成量的重要机制之一。雄 激素受体可能涉及对雄性大鼠生殖系统的损伤作用,具体机制有待更深入的 探讨。论文图片 表 染毒大鼠脏器系数变化士 与对照组比较. 表 染毒大鼠精子头计数和每日精子生成量. 与对照组比较?. 当 嗣 三 ?望簧 岩% ? 占 / / 图 染毒大鼠水平灰度值士 与对照组比较?. 图各组睾丸组织免疫组织化学染色情况 对照组 : 剂量组 剂量组 / ./认为雌激素、雄激素和甲状腺激素干扰物是需要重点研究的。以前 的文献对雌激素干扰物的报道较多,认为这类化学物与人类精子数量减少、尿道 下裂和隐睾发生率增高有关【酯网。由于雄激素在性分化的诱导、第二性征的形成 和维持精子发生的起始等方面起着关键作用,因此近年来对雄激素干扰物的研究 受到了广泛关注。已经发现一些化学物具有抗雄激素活性,能够与结合,产生 拮抗的作用,从而影响雄性机体生殖功能..。雄激素是雄性体内一类 最重要的类固醇激素。是雄激素诱导转录因子,介导雄激素的生物学作用,调 节多种基因的表达。化学物通过与竞争性作用,阻碍雄激素依赖的基因转录来 抑制靶基因的表达,发挥抗雄激素作用,其结果是导致雄性生物体生殖功能受损 或雌性化。美国佛罗里达州湖短吻鳄睾丸异常和小阴茎、食蚊鱼 精子生成量减少,西班牙河鲤鱼出现雌雄间性,非洲野生 雄豹精子异常、精子密度下降和隐睾,两栖动物出现雄性性征丧失,因此充当 拮抗剂的环境雄激素干扰物无疑与上述现象有一定关系【。作为雄激素物质 的筛选方法之一,报告基因试验获得快速发展【】。 基因由个内含子和个外显子组成,其编码的受体是一种核蛋白,由 个氨基酸组成,属于核受体超家族中的类受体.】。作为一种雄激素选择 性增强子,能与二聚体化的结合【】。某些特异性配体通过介导,识别靶基 因上特异的,激活靶基因。因此雄激素效应基因的表达需要三方面的因素: 特异性配体、和,这也是建立报告基因试验的理论基础。盆丛匡鲎堕塑?鲎 垡迨童 前期研究中,我们主要将受调控的报告基因质粒.与表达 质粒/.共转染非洲猴肾细胞株.,通过检澳:诱导的表达水 平,分析化学物的抗雄激素作用【】。试验结果显示已知的拮抗剂尼鲁他明和 氟他胺对.有拮抗作用,因此我们建立的研究方法能够有效地检测化学物抗 雄激素活性。 国家质检总局数据显示,目前我国农药年生产量万吨左右,每年使用农药 达.万吨,其中约%的农药直接进入环境。研究表明农药可以模拟或干扰内 源性激素的功能,与受体有一定的亲和力,通过与受体结合产生内分泌干扰 作用【眈】。是雄激素诱导的信号通路中重要的转录调节因子,其介导的抗雄激素 作 用已经成为大多数学者研究的焦点,涉及的机制可能包括抑制表达、竞争性 结 合以及干扰后续的依赖的转录。已知的通过干扰信号通路而表现出抗 雄激素活性的农药有滴滴涕,、二氯二苯二氯乙烯,、 多溴联苯醚和利谷隆.】。其他研究还显示,杀虫剂 杀螟硫磷和腐霉利也是两种抗雄激素【矧。 滴滴涕和两种主要的烯菌酮代谢产物和都可以竞争性结 合后阻碍内源性雄激素诱导的基因转录,从而抑制男性正常性功能的发育和维 持【】。 世纪年代到年代初,我国大量使用有机氯农药,后来由于这类农药脂 溶性高,性质稳定、不易降解,已停止生产和大规模使用【?。此后,拟除虫菊酯 类农药的生产和使用逐年增加。尽管这些农药的毒性较低,但是长期接触也可能 对人体造成严重的潜在危害。应用之前建立的报告基因试验,我们对氯菊酯、 氯氰菊酯、氰戊菊酯等拟除虫菊酯类农药的作用机制进行了初步探讨,结果显示 这些农药在一定浓度下能拮抗一双氢睾酮.诱导的报告基因表达,提示 它们可能通过介导抑制其转录活性,引起雄激素靶基因的下行调节,具有抗雄 ‘ 激素效应【.。.细胞株,购于中国医学科学院上海分院细胞研究所。 .质粒和菌株 和?质粒图谱见图为产品; 博士 /.质粒图谱见图为日本 馈赠;大肠杆菌,本实验室保存。 .试剂 胰化蛋白胨和酵母提取物 公司产品 核糖核酸酶 公司产品 吗啡啉一丙磺酸 公司产品 氨苄青霉素。 公司产品 质粒提取试剂盒 公司产品 南京农药厂 ?标准品纯度大于% 双氢睾酮, 公司产品 质粒转染试剂盒 肿公司产品 无酚红培养基 公司产品 测试系统公司产品 试剂盒 公司产品 引物和全基因合成 上海博亚生物技术有限公司完成 .仪器 超净工作台 苏州净化设备厂 培养箱 德国公司盆刿匡堂睦塑?堂焦迨塞 倒置相差显微镜 日本公司 台式高速低温离心机. 美国公司 仪. 美国 公司 紫外可见分光度计. 美国公司 全自动酶标仪 美国.公司 .?超低温冰箱 美国公司 一次培养板孔 公司 方法 .某些试剂的配制 .. 培养基的配制及细菌培养平板的铺制 纯水中胰化蛋白陈,酵母提取物, ,搅拌至溶质完 全溶解,定容至,高压下蒸气灭菌分钟,?保存备用。配制固 体培养基时,每液体培养基中加入琼脂糖,高压下蒸气灭菌。高压后 取出培养基,轻轻晃动使溶解的琼脂糖均匀分布在整个培养基中。培养基降 温至 左右时,按/的量加入‘,以/皿的量将培养基倾倒入直径 的培养皿中,铺制含的选择性平板,同时制备不含‘的 平板。 .. ./的溶液 纯水中加入 .,搅拌至完全溶解,定容至,取部分溶液加 入甘油,配制甘油含量为%的溶液。高压下蒸气灭菌分钟,? 保存备用。 ..重悬缓冲液 ?, 。纯水中加入 .,? ,终浓 .,搅拌至完全溶解,调至.,定容至。用前加入 度为/。盆幽匡鲎堕塑?茔焦迨塞 ..裂解缓冲液, ,%/。纯水中加入 .,% 搅拌至完全溶解,定容至。 ..中和缓冲液 .乙酸钾。纯水中加入乙酸钾.,搅拌至完全溶解,用冰乙酸 调至.,定容至。 ..平衡缓冲液 , ,%异丙醇,.%.。纯水 中加入 .,.,搅拌至完全溶解,调至.,加入异丙醇, . .,搅拌至完全溶解,定容至。 ..清洗缓冲液 . , ,%异丙醇。纯水中加入 ., .,搅拌至完全溶解,调至.,加入异丙醇,搅拌至完全溶 解,定容至。 ..洗脱缓冲液 . , ?。纯水中加入 ., ., 搅拌至完全溶解,调至.,加入异丙醇,搅拌至完全溶解,定容至。 .?保存备用。 .. 缓冲液?, 。纯水中加入.,? .,搅拌至完全溶解,用盐酸调至.,定容至。取过滤除菌, ?保存备用。 ..标准品的配制 .标准品溶于无水乙醇,配置成.的母液,一?贮存,临用『稀释 至所需浓度。染毒时培养液中溶剂含量不超过.%/。 置冰上冷却分钟,,离心分钟沉淀细菌。 弃上清,用预冷的. /的氯化钙溶液重悬沉淀,冰浴分钟,, 离心分钟回收细菌。 弃上清,用含%甘油的. 的氯化钙溶液重悬沉淀,分装成 的小份,置于无菌的. 管中,立即使用或一冻存备用。 ... /.转化 取含感受态细菌的管,加入./.浓度为./, 同时设一空白菌作为对照,其中不加质粒。混匀,冰浴分钟。 将管取出,水浴中热休克秒。 将管转移到冰浴中,使细胞冷却分钟。加入培养液“,混 匀,?,转/分振荡培养小时,使细菌复苏。 取转化液涂布在含的选择性平板上,?正面培养小时后 倒置培养过夜。 观察菌落生长情况,挑取单菌落接种到一定量的含心的培 养基中,转/分振荡培养小时,以%的比例加入高压灭菌的甘油,分装到 无菌的. 管中,一冻存备用。 ..质粒/.的提取加入预冷的 ,立即温和颠倒离心管次,有蓬松的白色物质 生成,冰浴分钟。 ?,离心分钟,将上清转移到另一干净的离心管中,, 离心分钟,收集上清备用。 用 平衡管,让 在重力的作用下,缓慢流出 管。 将步骤收集的上清移入管中,让上清在重力作用下,缓慢流出, 弃流出液,此时质粒被吸附在柱中。 将 加入管中,让在重力的作用下,缓慢流出管, 洗涤柱吸附的质粒,共次。 将 ;.管中,让在重力的作用下缓慢流出,洗脱 柱吸附的质粒,用的灭菌聚苯乙烯管收集沈脱液。 加入..倍体积室温异丙醇,混匀,,离心分钟,沉 淀质粒。 小心弃去上清,用%醇洗涤质粒沉淀,离心分钟。 小心弃去上清,室温干燥质粒沉淀分钟,用灭菌缓冲液 溶解沉淀。 取上述质粒:稀释后用紫外分光光度计测定?和,计算盆刿匡鲎堕塑?茎垡 迨塞 浓度和纯度,.?保存备用。 .质粒转染.图 .. .细胞用不含酚红的 培养基青、链霉素各/,庆 .,,%培养箱中进行培养,当生长 大霉素./,%, 至%满瓶时,用.%胰酶.%消化液消化细胞,用不含酚红的 培养基重悬,按 细胞/孔的量接种到孔板中,培养液的加入量为, ,%培养箱中培养小时,细胞密度达.%。 ,, ..在转染前小时,弃培养基,加入新鲜的不含酚红的 %培养箱中继续培养。 ..配制质粒/ 复合物以一孔的量计 . 、. /.和. 一稀释于 液中,轻轻混匀。 液中,轻轻混匀。 转染试剂稀释于 将液滴加到中,充分混匀混合液,室温孵育分钟。 将上述混合液加到六孔板中,轻轻摇动使混合液与培养基均匀混 合。,%培养箱中培养小时后,加入受试物进行染毒。 .受试物的染毒图 弃六孔板中的转染液,用 洗一次,加入含有不同剂量受试物及 .的不含酚红的 培养基%.,各剂量组均设 个复孔。 .报告基因的检测 ..细胞裂解 弃六孔板中的培养液,用 ×洗细胞两次,尽量用枪头将吸干 净。注意不要丢失细胞。 每孔加入×报告基因裂解液,轻轻晃动培养板保证所有的细缝刿匡鲎堕塑? 堂垡迨塞 胞都被覆盖。 室温下,在脱色摇床上轻轻晃动培养板,孵育分钟。 轻刮培养板的表面,倾抖培养板,将细胞完全刮到培养板的低处。将细胞裂 解液转移到.的离心管中,旋涡混匀.秒。 ,离心分钟,将上清转移到另一干净的离心管中。 细胞裂解液可直接用于测定或保存在.?备用。 .. .的测定 .标准、待测细胞裂解液加入标记的 将试剂融化,用前混匀。将 板中,以作为阴性对照。 每管加入 ,轻轻混匀。 ×测定缓冲液 在?恒温摇床上轻轻振荡直至呈现黄色。 应用全自动酶标仪,在处读取吸光度值。 .. 的测定图 将标准/、待测细胞裂解液加入已包被一抗的商品化的酶 标板反应孔中,以 作为阴性对照。封板,置?孵育小时。 ? 去除反应液,用 洗板次,每孔加入 工作液地高辛标记的二抗,/,封板,置?孵育小时。 去除反应液,用 洗板次,每孔加入. 过氧化物酶标记的工作液,/,封板,置?孵育小时。 去除反应液,用 洗板次,每孔加入. 底物溶液 ‘.连氮一二.乙基苯并噻唑一一磺酸,室温下在脱色摇床上轻轻振荡显 色一分钟。 应用全自动酶标仪,在双波长和下读取吸光度值。 统计分析 诱导活性以相对于溶剂对照的倍数表示。诱导倍数染毒组 值/染毒组. 值/溶剂对照组 值/溶剂对照组. 盆幽匡鲎堕塑?堂焦迨童 值。应用.统计软件,采用单因素方差分析处理数据。 结 果 受试物的细胞毒性 通过对转染质粒的细胞的分析来评估的细胞毒性。为避免 由受试物造成的细胞毒性,各组.的浓度都控制在弓以下。结果所有测试 组和对照组之间的水平无统计学差异数据未显示。可见在控制浓 度下对细胞不产生明显毒性。 的抗雄激素作用 .转染三种质粒后,以.为阳性对照,检测.诱导的激动 作用,结果显示?的.即显著诱导的表达,诱导倍数为., 时达到最大值,诱导倍数为.。以.浓度的对数为,几率单位为, 计算浓度对数与几率单位之间的回归方程为..,根据该方程计算 ?。 .的半数效应浓度如为. 在一 .一浓度范围内,随着染毒计量的加大,受试物.拈抗 .诱导的表达,并且在×? 时呈明显的拮抗作用图。计算 一。 得出.的半数抑制浓度为.:.讨 论 内分泌系统是一个信号传输的网络系统,激素作为机体内的化学信使传输信 号。雄激素维持雄性体内生殖器官的正常功能和精子发生过程,对男性性发育和 性成熟起着重要作用【。雄激素水平严格调控着男性机体的内分泌,并在需要的 时间生产适当的生物反应。正是因为雄激素对男性生殖系统的关键作用,所以具 有抗雄激素活性的内分泌干扰物正成为一个值得关注的问题。大量研究认为抗雄 激素物质主要通过与结合、改变活性阻止机体内自然的生物过程。这些抗 雄激素物质无疑与发病率逐渐升高的男性性分化异常有一定关系,如尿道下裂, 隐睾症,精子数量和质量下降等。 迄今为止,农药中已发现的内分泌干扰物大多是有机氯类农药。由于其生物 蓄积性和对野生动物的繁殖功能的有害作用,几年前在大多数国家这些化合物就 被禁止使用。然而,目前广泛使用的一些农药也已经被报道具有内分泌干扰的特 性【。在中国和其他一些国家,拟除虫菊酯类农药是现在使用最多的一类农药。 已有研究报道一些拟除虫菊酯类农药及其代谢产物能够干扰机体内分泌系 统,具 有抗雄激素的活性,如氯菊酯对雄激素依赖的附属性腺产生的损伤作用 【?.舯,,吲。因此迫切需要建立抗雄激素物质筛选方法,能从大量的环境内分泌干 扰物中识别充当拮抗剂的雄激素干扰物。 受体介导理论是报告基因试验的理论基础,尽管方法的原理大致相同,但 尚无统一的标准方法,其差别包括细胞株、受体表达质粒、报告基因、转染方法 和拮抗剂的阳性对照等。酵母表达系统最早被等用于受体报告基因试验【., 研究认为该系统能够有效地筛选激动剂,但缺乏对拮抗剂的检出效力。由于酵 母表达系统存在的缺陷,基于哺乳动物细胞的报告基因试验在抗雄激素干扰物 研究中得到广泛关注和快速发展。虽然报告基因试验是抗雄激素筛选的较理想 的 方法,但各个实验室建立的方法标准很难统一。研究认为各个实验室可 以根据具体情况,选择并建立合适的报告基因试验。坌刿匡生瞳塑?鲎焦逾童 在此之前,我们已经建立了一种用.为转染细胞的报告基因试验,能够 有效筛选出已知的拮抗物质【?。本项研究中仍然采用此种方法对.进行 试验,动物试验已经显示该物质有抗雄激素的活性,是否通过拮抗作用则可根 据此试验进行研究。我们将表达的质粒/.、重组报告基因质粒 .和阳性对照质粒..共转染.,以.双氢争酮. 试剂盒检测的表达,利用显色 为阳性对照。.染毒后,应用 . 反应,通过测定值反映的蛋白表达水平。结果显示:.毛? 的浓度范围内能拮抗 的.诱导的的表达,并且在浓度为 时 试验 对.的拮抗作用较明显,其为.士.一。这与之前 的结果是一致的,都反映了.属于抗雄激素物质,通过报告基因试验进一 步揭示了该物质是通过拮抗产生的作用。结合以前的研究和大量文献报道,可 见拟除虫菊酯类农药能够干扰机体内的正常功能,从而对生物体健康和全球环 境构成潜在威胁。 本研究显示.是拮抗剂,同时进一步验证该方法在进行筛选时的可靠 性。一方面,提示该报告基因试验可作为监测的常规方法和早期预警系统, 在环境监测和危险度评价中发挥重要作用。另一方面,作为一种配体依赖性转 录调节因子,对靶基因表达的调控涉及一系列复杂精密的信号转导过程,包括配 体与结合、活化、激活靶基因转录等,结合一活化一转录构成一个相互联系 的统一整体,其中任何一个环节受到影响,都将抑制雄激素靶基因的表达,导致 机体损伤,拮抗剂究竟通过哪种机制影响到哪个环节目前很不清楚。因此我们 将以报告基因试验为基础,在信号通路上,研究化学物确切的作用靶点,揭 示其分子作用机制。总之,从我国国情出发,综合研究,预防其造成的生殖 危害,保证生殖健康,提高人口素质。论文图片 一? 潲’ ,’ : 图 质粒图谱 是一种阳性对照载体,用于测试哺乳动物细胞的转染效率和监测转染时的细胞 毒性。启动子和增强子,启动编码半乳糖甘酶的基因的转录。图 /.质粒图谱