丙酮盐双水相体系的构建及萃取分离四环素类抗生素研究（可编辑）

丙酮盐双水相体系的构建及萃取分离四环素类抗生素研究（可编辑） 丙酮盐双水相体系的构建及萃取分离四环素类抗生素 研究 分类号: 邳墨 : 编号:窆窆 江薛大擎 硕士学位论文 丙酮一盐双水相体系的构建及萃取分离 四环素类抗生素的研究? ?指导教师 闰丞胜塾拯作者姓名 塑笪垩 申请学位级别 硕士 专业名称 工业催化 论文答辩日期 论文提交日期垄垄生垒旦 星至生鱼旦 学位授予单位和日期 年年 答辩委员会主席 评阅人 月 年独创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外,本论 文不包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 月 日 日期: 年学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定, 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 年解密后适用本授权书。 保密口,在 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名:汤膨呼 指导教师签名:// 砂哞月 日 力厶年多月『日江苏大学硕士学位论文 摘 要 双水相萃取技术是分离生物物质的一种有效的方法,并且已经在 其下游生产中得到应用。聚合物.盐双水相体系以及离子液体.盐双水 相体系己成功用于抗生素的提取,但是成相物质生产成本高以及分离 回收的难题限制了这两种双水相体系在商品化生产中的大规模应用。 水溶性小分子有机化合物.盐双水相体系由于其廉价,易于回收等优 点,具有很好的应用前景。本文建立了丙酮.无机盐/有机盐双水相体 系,并应用该体系萃取分离了四环素类抗生素盐酸土霉素和盐酸四 环素,为进一步进行数据拟合、建立热力学模型及双水相萃取 提供科学的方法和依据。 测定了丙酮./瓜双水相体系 在不同温度下的相图。双节线数据用一个四参数非线性方程进行了拟 合;基于该方程以及杠杆规则建立了快速计算液液相平衡组成的方 法,计算得到了丙酮一/依双水相体系 液液相平衡组成,并用卜和方程关联了实验所 得的液一液相平衡数据,验证了计算方法和结果的准确性,并通过液一 液相平衡数据计算得出了体系的褶点;采用有效排出体积理 论计算了三种柠檬酸盐在丙酮溶液中的值,通过值与相图, 比较了盐的分相能力,得到柠檬酸盐的盐析能力顺序 。 测定了丙酮一///双水相体系的 相图。双节线数据用一个四参数非线性方程进行了拟合,采用丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 理论计算了四种硫酸盐在丙酮溶液中的值,通过值与相图 比较了硫酸盐的分相能力,得到盐的盐析能力顺序? 唧?。同时对比相同阴离子不同阳离子盐的盐析能力及 阳离子所带电荷数对盐析能力的影响。 用丙酮一双水相体系萃取分离了盐酸土霉素 ?和盐酸四环素?,并且测定了目标物在上下两 相中的分配系数以及萃取率,讨论了目标物在两相间的 分配机理以及目标物浓度、、温度、分相盐浓度以及丙酮体积对 于萃取率的影响机制。对于?,当丙酮体积为 , 浓度大于.‖时,?的萃取率达到%以上,低于 等电点有利于萃取。对于?,其在丙酮中的溶解度远小于在水 中的溶解度,当. ,浓度为.‖时,? 在丙酮一双水相体系中的和分别为.和.%。 实验证明了该双水相体系应用于四环素类抗生素萃取的可行性。 关键词:丙酮,柠檬酸盐,硫酸盐,双水相萃取,四环素江苏大学硕 士学位论文 衔 铆 撕 仃 仃,帆。一向.如印 舰 .,曲一 巧 玛 . , 略 .?,,行 玛. ? 玛 . . , 一仃/毹 . 印 . ,. ?. 一// ?丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 印. , . 】【 // .缸卜. 缸 . 姆, ? ? .. /// 卜锄 向. , 仃 ? 加 ? ? ??. 一 . ,,, 江苏大学硕士学位论文. 仃臼 . 向 , 伍%.? 仃., .咖 ‘ . 一 .%. 够?仃 玛 . : , 玛 , 唱 , 帆 , 丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究江苏大学硕士 学位论文 目 录 第一章绪论?. .双水相萃取及应用研究? ..前言.. ..双水相体系概述. .双水相萃取的原理 ..影响双水相体系物质分配平衡的因素..双水相体系的应 用??.. .双水相体系液一液相平衡及其研究进展..双水相体系相图. ..双节点及液.液相平衡数据拟合方程 .四环素类抗生素.. ..四环素类抗生素的概述?.. ..四环素类抗生素的作用与用途??. ..四环素类抗生素的结构与性质??.. ..四环素类抗生素的分离提取方法.. ..四环素的分析方法??. .选题依据及研究内容? ..选题的目的、意义??. ..研究内容? 第二章 丙酮.柠檬酸盐双水相体系相图及数据拟合研究。 .实验部分? ..仪器与试剂??.. ..实验方法.. .结果与讨论 ..双节线数据的测定与拟合..系线数据的测定与拟合 ..褶点数据的计算. ..柠檬酸盐的分相能力?. 丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 .本章小结?. 第三章丙酮硫酸盐双水相体系相图及数据拟合研究??. .实验部分? ..仪器与试剂 ..浊度法绘制体系双节线??.. .结果与讨论 ..双节线数据的测定与拟合..硫酸盐的分相能力??. .本章小结?. 第四章丙酮伽。双水相体系萃取分离四环素类抗生素的研究。 .丙酮帆双水相体系萃取分离盐酸土霉素的研究 ..实验部分.. ..结果与讨论 .丙酮.双水相体系萃取分离盐酸四环素的研究 ..实验部分.. ..结果与讨论??.. .本章小结.. 第五章结论、创新点及进一步工作建议.本研究的主要结论??.. .本研究的创新点? .进一步工作的建议??.. 参考文献??. 致谢. 附录一:攻读学位期间发表的学术论文??。 附录二:中英文符号及缩写对照表江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 .双水相萃取及应用研究 ..前言 溶剂萃取分离法是利用不同化合物在互不相溶的两相水相和有机相 间的溶解度或分配系数的不同,使目标物质与基体物质相互分离的方法。溶剂萃 取既可以用于有机物的分离,也可以用于无机物的分离。溶剂萃取首先在有机化 学中被用来分离有机化合物,是基于有机化合物在有机溶剂中的溶解度通常要显 著大于在水相中的溶解度的原理。到世纪,人们开始尝试用溶剂萃取法分离和 纯化无机物。如用二乙醚从沥青铀矿中提取和纯化硝酸铀酰,用乙醚从水中萃取 硫氰酸盐等。 世纪后期取得的液液分配定量关系等理论成就为世纪溶剂萃取 的飞速发展奠定了基础。世纪年代以后,溶剂萃取走向成熟,并迎来了鼎盛 时期,建立起了完善的理论体系,发展出了丰富的萃取模式,并被广泛应用于科 学研究和工农生产的各个领域。 溶剂萃取至今仍是实验室和工厂中常用的分离方法,其优势主要表现在仪器 设备简单、操作方便、分离选择性比较高和应用范围广。不过,随着生物工程及 生物化工如基因工程、蛋白质工程、代谢工程、细胞培养工程等生物质分离及 纯化技术的迅速发展,一些具有生物活性又极具价值的生物物质的分离提纯, 是十分关键的。利用常规的萃取技术来分离生物活性物质,往往会带来长、 易失活、收率低和成本高等缺陷。双水相萃取技术是分离生物活性物质的一种新 型溶剂萃取分离技术。在双水相体系中,两相中的水分含量都在%~%左右, 组成双水相的高聚物、离子液体、水溶性有机小分子和盐一般不会造成生物活性 物质的失活和变性。 双水相萃取技术始于世纪年代,早在年,荷兰微生物学 家】发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液在一定浓度相混合时, 得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂或 淀粉,这种现象被称为聚合物的不相溶性,从而产生了双水相体系。但 由于受到当时实验条件和客观因素的限制,并未深入研究这一体系。直到年,丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 【】首次将双水相体系应用于生物产品的萃取和分离,他主要研究了聚乙 二醇/葡聚糖/体系和/盐体系在分离纯化中的应用。迄今,由于条 件温和、容易放大、安全无毒或低毒、工艺简单、可连续性操作等特点,双水相 体系已经在分析化学、生物产品、天然产物等分离分析和富集提纯方面得到了较 为广泛的应用。 ..双水相体系概述 ...双水相体系的分类 双水相体系是一种或几种物质在水中以适当的浓度溶解,在一定条件下形成互 不相溶的水溶液体系。传统的双水相体系即高聚物/高聚物双水相体系的形成主要 是由于高聚物之间的不相溶性,即高聚物分子在空间上产生的空间阻隔效应,相 互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为两相。 但是这种理论对于含有电解质的双水相体系就不能很好适用了。对于小分子有机 溶剂/盐双水相体系的形成是盐溶液中的盐离子与有机溶剂争夺水分子形成缔合水 合物的结果;对于离子液体/盐双水相体系的形成是因为盐析作用;对于表面活性 剂双水相体系形成双水相的机理,以等为代表的学者认为是表面活性剂 混合溶液中不同的组成和结构的胶束平衡共存的结果。双水相体系的种类及其成 相原理见表.: 表.双水相体系的种类及其成相原理 . ? 江苏大学硕士学位论文 ...双水相体系形成的影响因素和盐析理论 对于新型离子液体/盐双水相体系和水溶性小分子有机化合物/盐双水相体系, 在一定条件下,某些盐能够和水溶性小分子有机化合物如脂肪醇,丙酮的水 溶液形成上相富含醇或酮的有机相,下相富含盐的无机相的两相萃取体系。这种 现象的形成,不仅与成相有机溶剂、盐的种类和浓度有关,还与体 系的值、温 度等外界条件有关,在对双水相体系的研究和应用中,人们也认识并了一些 规律【】:第一,与成相的水溶性小分子有机化合物的极性有关,极性越大,分相能 力越差。一般来说,分相能力丙醇大于乙醇,而能和甲醇形成双水相体系的盐更 少;第二,与成相的无机盐的离子半径、电荷数有关,一般来说,离子半径越小, 电荷数越多,分相能力就越大。 影响双水相形成的因素很多,而且缺乏系统的研究,因而,目前对于这类体系 的相分离现象的解释也很多: 水化理论【】,当盐加入非电解质溶液中,非电解质的活度系数会发生变化。 如果活度系数增大,我们就称之为“盐析”,反之,我们称之为“盐溶”。根据水 化理论,盐析作用的结果是由于水分子的转移。因而,在水溶性小分子有机化合 物、盐以及水组成的三元体系中,存在盐离子与水分子之间的相互作用盐离子 结合水分子以水合离子的形式存在和有机化合物分子与水分子 之间的相互作用。 这两种作用的相互竞争,导致了两种截然不同的结果:一是分享盐“盐析”结晶; 二是水溶性小分子有机化合物被“盐析”,形成有机化合物富集的上相,即形成 双水相体系。 静电理论,这个理论解释了在盐的影响下,溶液介电常数的变化。【引、 【】和【导出了一系列适用于计算稀的盐溶液中非电解质的活度系数 方程。根据这些方程,可以预测如果非电解质溶液的介电常数小于水的介电常数, 那么将会发生“盐析”;反之,将会出现“盐溶”。同时这个理论也说明了非电解 质溶液的活度系数的对数与离子强度成线性关系。 内部压力理论,根据【】提出的内部压力的概念,和【 指出往水中加入盐后,如果总体积减小,这可以看做是溶剂的压缩。这使得非电 解质的分子的溶解变得更加困难,从而出现“盐析”。反之,如果盐加入后总体 积增大,将会出现相反的影响,即出现“盐溶”。丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 ...双水相体系的特点 双水相萃取技术作为一种新型的分离技术,与传统的溶剂萃取法相比,对生物 物质、天然产物、抗生素等的提取和纯化表现出以下优势: 易于放大。哪证明分配系数仅与分离体积有关,各种参数可以按 比例放大,而产率并不低,这是其他过程无法比拟的,这一点对工业应用尤为有 利; ,传 分离迅速。双水相体系分相时间短,自然分相时间一般为~ 质过程和平衡过程速度均很快,因此对于某些分离过程来说,能耗较低,而且可 以实现快速分离; 条件温和。含水量高~%,在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性。界面张力小,一般为’~ /大大低 于有机溶剂与水相之间的界面张力,有助于两相之间的质量传递,界面与试管壁 形成的接触角几乎是直角。不使用传统有机溶剂,因此毒性小,对人体危害小, 更加环保。整个操作过程可以在常温常压下进行,因而有助于保持生物活性和强 化相际传质,既可以直接在双水相体系中进行生物转化以消除产物抑制,又有利 于实现反应与分离技术的耦合; 步骤简便。大量液体杂质能够与所有的固体物质同时除去,可以直接从 含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质或者酶,还能不经过破碎直接 提取细胞内酶,省略了破碎或过滤等步骤。与其他常用的固液分离方法相比,双 水相萃取技术可以省去一两个分离步骤,使整个分离过程更加经济; 变通性强。由于双水相体系所受的因素复杂,聚合物、离子液体或是水 溶性有机溶剂的浓度、盐的种类和浓度,以及体系的值等因素都会影响被萃取 物质在两相间的分配,因此从某种意义上说可以采取多种手段来提高选择性或萃 取率。 早期研究主要集中在聚合物.聚合物双水相体系,由于所用聚合物成本较高, 粘度大,限制了该技术的工业化应用,因此需要开发廉价高效的双水相体系。相 继而生的聚合物.盐双水相体系,成本相对较低,体系粘度小,已被广泛的应用于 物质的萃取分离中。近几年,离子液体作为一种可替代传统挥发性有机溶剂的绿 色溶剂,它具有良好的物理化学稳定性、几乎没有蒸气压、无可燃性、具有溶剂 江苏大学硕士学位论文 和催化剂的双重功效、许多有机或无机离子在其中都具有良好的溶解性,可通过 改变阴阳离子组合进行优化设计。将离子液体应用于双水相技术,拓宽双水相体 系的应用范围,形成新型“绿色萃取技术”。但用于成相的离子液体分离回收困难, 成本较高,限制了该技术的工业化应用。有机小分子一盐双水相体系最大的优点是 成相物质价格低廉,后续分离操作简单,非常具有开发价值与应用前景。 不同双水相体系除拥有共有的特点外,还具备各自的优势与不足,只有深入研 究不同体系的特点,综合考虑被萃物性质、双水相体系特点、实效与成本等因素, 开发与目标萃取物相适应的双水相体系才能加快该技术在工业 生产中的应用。 ..双水相萃取的原理 双水相萃取与水.有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分 配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作 用和各种力如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境因素的影响,使其在上、 下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数可用下式表示: %。 其中为分配系数,.和下分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的值不同,可利用双 水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律,即“在一定温度一定压 强下,如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里,达到平衡后,该 物质在两相中浓度比等于常数”,分离效果由分配系数来表征。 由于双水相体系有种物质组成,只要其中任一一种组分发生改变,上下两相 的组成就会发生变化,分配系数就会发生相应的改变。因而在双 水相体系的实际 萃取过程中,最佳的操作条件往往是依靠实验获得的。 ..影响双水相体系物质分配平衡的因素 在双水相体系中,粒子的表面能和电荷是影响其分配的重要因素。分配系数与 表面能和电位差成指数关系,可以表示为: . 一及?丛矽‖丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 式中,口为表面能;?为两相表面能之差;万为电荷数;?矽为电势差;‖为一个 热力学量,包含标准化学位和活度系数。 物质在双水相体系两相中的分配受诸多因素的影响,如盐的种类与浓度、 值、系线长度和温度等。在分离纯化或分析某一种物质时,只需选用合适 的双水相体系并优化各条件便可得到理想的分配系数和萃取率。 ...盐的种类与浓度的影响 由于盐的正负离子在两相间的分配系数不同,两相形成电势差,从而影响带点 生物大分子的分配。对于某些在水溶液中存在不同价态的盐,如磷酸盐,它既可 以与聚合物等形成双水相体系,又可以作为缓冲剂调节体系的 值。由于磷酸盐 不同价态的酸根在双水相体系中有不同的分配系数,因而可以通过控制磷酸盐的 比例和浓度来调节相之间的电位差,从而影响物质的分配。 一些研究人员认为在双水相体系中加入中性盐的影响主要表现为阴阳离子在 两相间不均衡分配,形成穿越相界面的电位差,它是影响荷电物质分配的主要因 素。 ... 值的影响 值对被萃物的分配系数有很大的影响,第一,体系的值能明显改变物 质的表面电荷,影响两性物质分子如四环素类抗生素中可离解基团的离解度, 因而改变了两性物质所带电荷的性质和大小,这是与两性物质的等电点有关的; 第二,可以影响某些盐的离解度,如磷酸盐,的变化能改变尸;一、胛暖一 和:的比例,进而影响电势差。 在大多情况下,值同样会影响金属离子的双水相萃取分离/分析效果,如双 水相萃取金属离子时应用最多的络合萃取,在体系中金属离子络合物稳定性越高, 萃取率越高,而溶液的酸度会影响金属离子络合物的稳定性,从而影响双水相萃 取效率。 ...系线长度的影响 许多研究表明,被萃物在两相间分配系数的对数值与系线长度成线性 关系。的变化之所以会对被萃物的分配产生显著影响,主要是由于随着江苏大学硕士学位论文 增加,双水相体系上下两相组成的差别增大,从而影响被萃物在两相问的分配平 衡。 ...温度的影响 温度越高,双水相体系形成所需的高聚物浓度就越高。在临界点附近,温度对 双水相体系的形成更为敏感。温度对物质的分配的影响首先是影响相图,在临界 点附近尤为明显。但当远离临界点的时候,温度影响较小。由于高聚物对生物活 性物质具有稳定作用,在大规模生产中多采用常温操作,从而节省冷冻费。采用 较高的操作温度,体系的黏度较低有利于分离。 随着新型双水相体系的开发,人们发现温度变化对于一些双水相体系的形成具 有很大的影响。近年来,人们利用温度诱导相分离,开发了温敏性双水相体系, 常见聚合物是环氧乙烷和环氧丙烷的无规共聚物。当温度高于云点 时,体系分为两相,形成富含聚合物的下相及几乎为纯水的上相,利用温度调节 即可实现目标物的提取以及成相聚合物的分离。 ..双水相体系的应用 ...聚合物双水相体系 聚合物双水相体系是最早被发现的,并且首先被应用于物质分离分析或纯化。 经过数十年的研究,聚合物双水相体系已经由最早的聚合物.聚合物双水相体系, 发展出了聚合物.盐双水相体系,并且在实际应用中人们提出了将聚合物进行改性, 将其改性为温敏或敏感的聚合物,进而有利于提高萃取率,也有利于其回收。 表.列出了聚合物双水相体系在分离提纯金属离子、蛋白质、抗生素及小分子有 机物等方面的应用。丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 表.聚合物双水相萃取技术的应用 . 撕 舯 ...离子液体双水相体系 离子液体双水相体系.是由等‘在年首次提出的,他们 采用亲水性离子液体氯化.丁基..甲基咪唑】和磷酸钾首次形 成了上相富含离子液体和下相富含磷酸钾的离子液体.盐双水相体系。离子液体 是近几年出现的一种可替代传统挥发性有机物的绿色溶剂,是由离子组成的在室江苏大学硕士学位论文 温时呈液态的有机盐,一般由有机阳离子和无机阴离子组成。离子液体不但具有 传统有机溶剂的优势,而且与有机溶剂相比表现出了许多优异性质。离子液体具 有不挥发、无色、无味;有较宽的稳定温度范围;较好的化学稳定性;几乎没有 蒸汽压,消除了挥发性有机溶剂对环境的污染问题;通过阴阳离子的设计可调节 其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性;并且其酸度可调至超酸;改变阴阳 离子组成,可以合成不同性质的离子液体等一系列优点,该双水相体系是由一种 有机盐亲水性离子液体和一种无机盐磷酸盐或有机盐柠檬酸盐形成, 用离子液体代替传统的高聚物,综合了离子液体和双水相体系的优点,开辟了新 的萃取分离体系。表.列出了离子液体双水相体系在分离提纯金属离子、蛋白 质、抗生素及小分子有机物等方面的应用。 表.离子液体双水相萃取技术的应用 . 丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 ...水溶性有机小分子双水相体系 水溶性有机小分子.盐双水相体系最大的优点是成相物质价格低廉,后续分离 操作简单,非常具有开发价值与应用前景。目前国内外对于水溶性小分子醇.盐双 水相体系分离金属离子和生物产品的研究不多,但是已有的研究结果证明了该技 术的潜在应用价值。表.列出了水溶性小分子有机溶剂双水相体系在分离提纯 金属离子、蛋白质、抗生素及小分子有机物等方面的应用。 表.水溶性小分子有机溶剂双水相萃取技术的应用 . 盯 唱 ,江苏大学硕士学位论文 .双水相体系液.液相平衡及其研究进展 ..双水相体系相图 双水相体系相平衡是热力学在化学领域中的一个重要应用,也是化学热力学的 主要研究对象。相平衡一般用相图来表示。图.是?时,丙酮 体系的相图,上相富含丙酮相组成用表示,下相富含柠檬酸铵相 组成用表示,从图中可以看出上相富含丙酮,下相富含柠檬酸铵,上下两相中 均含有大量的水。点称为临界点或褶点。曲线称为双节线,、、三点 在一条直线上,称为系线。双节线上方为液液平衡两相区,下方为单相区。在两 相区的所有系统点,如点,达到液液平衡后,其上下两相组成分别为和, 、相的质量符合杠杆规则,即和两相的质量比等于线段和的长 度比: . 卸一 。。 胁而 式中,。和晰分别表示上相和下相体积,而和丽分别表示点和点及 点和点之间的距离。系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度。系线越长,两 相的性质差别越大,反之则越小。 若向双节线移动,系线变短,、两点接近,即两相差别减小,、在 接近双节线点时,体系变成一相。在临界点附近系线的长度趋向于零,上下相 的组成相同,此时系统很不稳定。一般我们采用浊点法来测取临界点的位置。 的相图 图.产.时,丙酮廿 ? .. 丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 ..双节点及液.液相平衡数据拟合方程 ...双节点及液夜平衡数据的拟合方程 双节点数据的拟合方程 经验方程.,.,.和.常被用来拟合双水相体系双节点, 其中方程.与.应用较多,主要用于关联离子液体一盐双水相体系以及 聚合物一盐双水相体系双节剧粕】。方程.主要应用于离子液体.糖双水相体 系【。 . ?口彬一一嵋 . 口以。 . 口以‘嵋嵋 . 口鹾%嵋 公式中,耽指盐的质量分数,指聚合物、离子液体以及水溶性有机 小分子的质 量分数,口,,,为拟合参数。 液.液相平衡数据的拟合方程 卜.方程.和方程.已成功用于关联一盐体 系四,离子液体一盐体系【以及水溶性小分子有机溶剂一盐体系 ‘系线数据。 七, 半墨等丁 . 缸五 其中,钟,嵋,瞄,嵋,嵋分别代表了水溶性小分子有机溶剂,盐, 水在上相和下相中的质量分数。尼,也,,,为拟合参数。一方面, 可通过相关系数俾和标准偏差来判断方程.和.关联双节点的 效果;另一方面,一嵋/叫对一罐/磋线性相关或是瞄/谴对 嵋/叫线性相关均表明方程.和.对系线数据具有较高的拟合度。 此外,可通过相关系数和相对标准偏差来判断关联的效果。这两个方 ,江苏大学硕士学位论文 程是应用最为广泛的系线数据拟合方程。 此外,还可用方程.【及具有两个参数的简单方程.【】 也被用来关联系线数据,公式如下: ,叩 . ?毛中‘一乞中一妒 专帅钟咖 其中,,尼,恕分别表示聚合物/离子液体/水溶性小分子有机溶剂的摩尔浓度,分 相盐的摩尔浓度,关联聚合物/离子液体/水溶性小分子有机溶剂的活度系数与浓度 的参数,盐析系数。在实际应用中,可通过比较盐析系数如的大小来考察盐的 分相能力。 ...水溶性小分子有机溶剂双水相体系液.液相平衡的研究 系统、完整、准确的测定双水相体系相图数据是设计双水相萃取、 进行数据拟 合以及建立热力学模型的基础。聚合物.聚合物以及聚合物一盐双水相体系的相图数 据报道较多,水溶性小分子有机溶剂.盐双水相体系的相图数据报道相对较少,而 且许多报导的双节线数据不完整。在水溶性小分子有机溶剂、盐以及水组成的三 元体系中,存在盐离子与水分子之间的相互作用以及有机溶剂分子与水分子之间 的相互作用。这两种作用力相互竞争,两者之间的差异将导致两种截然不同的结 果: 分相盐被“盐析”结晶; 水溶性小分子有机溶剂被“盐析”,形 成有机溶剂富集的上相,即形成双水相体系。通过盐离子和水溶性小分子有机溶 剂两者之间竞争水分子的差异性可进行盐的回收或是双水相萃取。盐在混合溶剂 中的溶解度数据以及双水相体系相图数据对于设计这两个不同的过程十分重要。 目前用来测定相平衡数据的方法很多,例如用滴定法,原子吸收法,重量 法【,电导率法和折光率法【】测定盐的含量:用折光率法【测定 聚合物的含量; 用气相色谱法刚和氧化法【测定水溶性小分子有机溶剂的含量;用冷冻干燥 法【】和 法【】测定水的含量。表.列出了文献报道的水溶性小分子有 机溶剂一盐双水相体系双节线数据的测定温度以及成相物质的质量分数范围。丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 表.水溶性小分子有机溶剂.盐双水相体系双节线的测定 . 酏?唱 从表.和.中可以看出,对丙酮双水相体系的液液平衡的研究还很少,目 前大都局限于丙酮双水相体系的应用研究。 .四环素类抗生素 ..四环素类抗生素的概述 世纪年代. 从金霉素链霉菌江苏大学硕士学位论文 中发现了第一个四环素类抗生素金霉素。土霉素是由等人在 中发现的。年生物化学 辉瑞实验室附近分离到的链霉菌研 家 .解析出土霉素的结构,使得辉瑞大规模生产土霉素成为可 能,并用商品名开始大量销售。的这一大发现是四环素类抗 生素史上的重要发现,这一发现为土霉素的衍生物强力霉素的发现铺平了道路。 土霉素”,,灰黄色结晶粉末,熔点?,难溶于 水,微溶于乙醇,在.时,半衰期为.小时,饱和水溶液.。结构 如图: ?; ’ :.?: ~ 图.土霉素的结构式 仃 .. 四环素,,黄色结晶粉末,熔点~?,微溶于水,易 溶于稀酸或稀碱溶液,在.时,半衰期为.小时。结构如图:图.四环 素的结构式 仃 .. 仃 ..四环素类抗生素的作用与用途 四环素类抗生素能够抑制基因转译而抑制细胞生长,它能与细菌 核糖体亚 基上的结合,抑制锄?进入核糖体一位置,而在自然界中, 这种结合是可逆的。 细胞耐药的发生至少有种机制。丙酮双水 相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 ., 由质粒或转座子编码的排出因子 和 在细菌细胞 膜表达,这些排出因子也称泵蛋白,可介导依赖性药物外流,在细菌体内还 存在一种抑制因子,对排出因子的表达有抑制作用。抗生素能与该抑 制因子结合并使之失活,从而导致排出因子大量表达,促进药物排出细胞外,使 仃抗生素不能在细菌细胞内聚积而产生耐药性。 和 由质粒或转座子编码的核蛋白体保护因子 在细菌细胞 内的表达,可与四环素类抗生素抗生素结合,从而阻碍抗生素与核蛋白体结合, 发挥核蛋白体保护作用。 细菌产生灭活酶。土霉素主要用于防治畜禽大肠杆菌、沙门氏菌感染如 犊牛白痢、羔羊痢疾、仔猪黄白痢、幼畜副伤寒等、巴氏杆菌、布氏杆菌感染及 猪喘气病、鸡慢性呼吸道病;也常用于治疗狗的立克次氏体病、猫的传染性贫血, 预防狗的衣原体病和钧端螺旋体病;局部用于坏死杆菌所引起的子宫内膜炎及组 织坏死等;作为饲料舔加剂使用,具有促进生长和提高饲料转化 率的作用。土霉 素可用于下列疾病:一、立克次体病,包括流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、 洛矶山热、恙虫病和热。二、支原体属感染。三、衣原体属感染,包括鹦鹉热、 性病、淋巴肉牙肿。 四环素能用于治疗呼吸道、中耳、鼻窦、尿路等部位的感染,也能用于治疗淋 病。尤其是用于对大环内酯类抗生素和.内酰胺类抗生素过敏的患者。 ..四环素类抗生素的结构与性质 四环素类抗生素是以四并萘萘并萘为母核的抗生素。这些抗生素都是黄色 结晶物质。从水中结晶得到的土霉素含有分子结晶水,水的含量到达.%,加 热时就会失去结晶水。从水中结晶得到的四环素含有分子结晶水,水的含量到 达.%。从含水有机溶剂中结晶得到的四环素含有分子结晶水。它们都具有吸 湿性,含水量分别低于.%和.%的土霉素和四环素暴露在空气中会吸收空气 中的水分。 四环素类抗生素含有下列官能团:二甲胺基,酰胺基,酚羟基 和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统和,这两个系统决定了抗生素的 颜色和在紫外光中的特征吸收峰。系统的。。在 左右,系统的舣 江苏大学硕士学位论文 在 左右。 .,酚二酮 四环素类抗生素是两性化合物。三羧基甲烷系统具有酸性 .的存在。 系统也具有酸性 .,但酸性很弱。碱性是由于二甲胺基 因此它能和各种酸、碱形成盐,其中以盐酸盐最重要,广泛用于医疗上。游离的 土霉素即成偶极离子形式习惯上称为土霉素碱或游离碱。土霉素的游离碱系 统中氢离子和二甲胺基结合形成内盐。由上述的数值,可以得等电点的为 .。在等电点时,土霉素呈游离碱的形式存在,在水中的溶解度最小。土霉素在 不同的溶解度见表.。 表.在不同下土霉素在水中的溶解度? .髓 时 的 由表.可以看出,土霉素在.~.之间难溶于水,在较酸和较碱的溶液 中,溶解度增加。 ..四环素类抗生素的分离提取方法 根据土霉素的理化性质,可以采用沉淀法、溶剂萃取法或离子交换法,从发酵 液中提取。 沉淀法:四环素类抗生素在碱性条件下能与钙、镁、钡或某些季铵碱形 成复合物而沉淀。例如土霉素滤液加入.~%溴代十二烷吡啶,调节值至 .~.有沉淀析出。发酵液浓度只有.~. ‖。沉淀过滤后用水洗涤, 然后溶于%草酸:浓盐酸:混合液中。得到的溶液为.~.,浓度为 ‖。然后用活性碳脱色,调..,析出土霉素碱粗制品。由于发酵单 位的提高,现在生产厂家一般采用将发酵液先用草酸或盐酸一草酸酸化,然后加 黄血盐、硫酸锌净化后,过滤,滤液采用树脂脱色后,调至等电点进行结 晶。 溶媒萃取法:土霉素的游离碱或盐酸盐在一般溶媒中溶解度都比较小, 但因为含有两个酸性基团,因此在碱性条件下,能和一些长链的季铵碱形成复盐, 难溶于水,而易溶于溶媒中。这样就可以将士霉素从发酵液中萃取到溶媒中。然丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 后进行反萃取,调节溶媒的至,复盐分解,土霉素就进入水相。在水相中, 调至等电点土霉素即可以游离碱析出。 离子交换法:四环素抗生素在酸性下当.成一价阳离子, 在等电点附近成偶极离子,在碱性条件下,成一价阴离子,当碱性增加时,最终 形成二价阴离子。 卜游离碱专一专‘ 因此在酸性条件下,磺基树脂能吸附四环素: ;?; 然后在碱性条件下进行洗脱,为了防止抗生素被破坏,洗脱机不超过肚为 宜,由于四环素正离子转变成负离子要消耗。离子,导致洗脱液值下降,因 此洗脱剂一般选用硼酸铵和氨溶液的缓冲溶液,其反应过程如下: ;:’专;: ?竺屿一或厶 为了防止抗生素破坏,洗脱宜在低温下进行,解吸液随时中和,用草酸酸化至 ,去除一些蛋白质,然后调至.,即将四环素碱析出。土霉素也可以采 用此法生产。 上述工艺往往十分繁杂,所需时间长,提取过程中需要消耗大量的原料,能耗 高,产品回收率低,废水污染严重且处理难度大。另外,抗生素在漫长的提取过 程中易变性失活。 ..四环素的分析方法 四环素类抗生素属于广谱抗生素,由于具备广谱抗菌特性以及价格低廉等优 点,己被广泛应用于畜禽和水产养殖中,用于预防和治疗多种感染性疾病、促生 长、提高饲料转化率等。近年来四环素类抗生素的残留对环境带来的影响受到国 内外研究人员的广泛关注,并建立了多种检测方法。四环素类抗生素常用的检测 方法有高效液相色谱、毛细管电泳、高效液相色谱法、微生物法等。江苏大学硕士学位论文 ...高效液相色谱法口 高效液相色谱法肿是世纪年代末年代初发展起来的一种新 型分离分析技术,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛的化学分离分 析的重要手段。具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。目前,食 , 品、土壤中四环素类抗生素残留分析应用较为普遍的是紫外检测器 。它不仅可进行定量检测,还可提供组分的光谱定性信息。贺蕴普‘等利用 瑚同时检测出养猪废水中四种常见四环素类抗生素,方法的检出限为.. /。 ...毛细管电泳 毛细管电泳印珂仃,是经典电泳技术和现代柱分离结合 的产物,灵敏度和分辨率高、分析速度快、样品量少、成本低,具有广阔的发展 前景。邢晓平‘建立了毛细管电泳.电化学检测法检测鸡蛋中土霉素和四环素残留 的方法,当体积分数为.%,检测电位为., /缓冲液., 分离电压,进样的条件下,四环素和土霉素有很好的分离效果,检 测限分 别为.×。‖和.ב‖。 ...薄层色谱法 薄层色谱法 黟叩,具有简便快速、不需要复杂仪 器等优点,因此该法己广泛应用于四环素类抗生素混合物的快速定性鉴定。薄层 色谱法可分为正相薄层色谱?和反相薄层色谱冲一两种方法。钱 下用薄层 英刚应用薄层色谱法检测家禽肌肉组织中的四环素和土霉素,在 色谱法定量检测,检测限为 /。 ...微生物法 微生物法是目前公认而又广泛应用的测定抗生素的方法,它根据对抗生素敏 感的实验菌,在适当条件下所产生的抑菌圈大小和药物浓度成比例的关系设计而 成。操作简单、成本低廉、适合大批样品分析、可反映生物效价;但灵敏度低、 存在交叉反应。黄晓蓉等四同时使用藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌 蕈状变种为敏感菌,建立了一次制样提取可同时检测多类抗生素的方法,对四环 素类抗生素的测定最低检出限为. /,但提取液对蜡样芽孢杆菌 丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 有抑制作用,干扰结果判定。 .选题依据及研究内容 ..选题的目的、意义 四环素类抗生素抗菌谱广,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、螺旋体、衣原体、 立克次氏体、支原体、放线菌和阿米巴原虫都有较强的抑制作用。目前提取四环 素类抗生素的方法有沉淀法、溶媒萃取法和离子交换法。这些方法工艺往往十分 繁杂,所需时间长,提取过程中需要消耗大量的原料,能耗高,产品回收率低, 废水污染严重且处理难度大。另外,抗生素在漫长的提取过程中易变性失活。因 此开发一种既能提高四环素类抗生素收率,又有助于解决废水污染的切实可行新 的提取方法一直是生产厂家和广大科研工作者所关注的课题。 液液萃取是化学工业和分析化学中最常用的分离技术,在生物、医药、食品等 领域的分离、制备和样品预处理中也有广泛的应用。然而,传统 的有机溶剂在上 述领域的使用,特别是在生物样品的处理过程中受到限制,传统液液萃取技术正 面临着巨大的挑战。因为蛋白质、核酸、各种细胞器和细胞在有机溶剂中容易失 活变性,而且大部分蛋白质有很强的亲水性,难溶于有机溶剂中;此外,随着社 会的发展,人们对于食品、药品以及功能性保健品的安全意识以及环境保护意识 越来越强,对传统液液萃取技术提出了更高的要求。双水相萃取技术主要是针对 生物活性物质的提取和分离发展起来的一种新型液液萃取分离技术。双水相体系 是一种或几种物质在水中以适当的浓度溶解,在一定条件下形成互不相溶的水溶 液体系,由于其操作条件温和,具有良好的生物相容性,目前成功实现了蛋白质、 酶、细菌素、细胞、氨基酸、多肽、抗生素、遗传物质和维生素等物质的分离纯 化。 目前对亲水有机相/含盐水体系的研究主要集中在萃取体系的建立及其应用方 面,对亲水有机相/含盐水体系的热力学行为和物理化学性质尚缺乏系统的、详细 的研究,其成相机理也还不是很清楚。而且,应用方面的研究主要集中在金属离 子的富集、分离方面,将该体系应用于生物物质分离的研究才刚刚起步。因此, 深入研究亲水有机相/含盐水体系的成相机理、液液相平衡关系以及生物物质在该 体系的分配规律和影响因素,不仅可以给生物物质的分离提纯提供一种必要的理 江苏大学硕士学位论文 论依据和基础数据,而且对电解质溶液理论研究以及天然产物中有效成分的分离 提取也有一定的参考价值。 本文建立了丙酮.无机盐/有机盐双水相体系,并应用该体系萃取分离了四环素 类抗生素盐酸土霉素和盐酸四环素,为进一步进行数据拟合、建立热力学模型 及设计双水相萃取提供科学的方法和依据。 ..研究内容 测定了丙酮./依双水相体系的相图。双节 线数据用一个四参数非线性方程进行了拟合;和及 ?方程关联了实验所得的液液相平衡数据,取得了较好的关联性, 并通过液液相平衡数据计算得出了体系的褶点;采用有效排出体积?理论计算 了三种柠檬酸盐在丙酮溶液中的值,通过值与相图,比较了盐的分相能 力。 测定了丙酮.以删犯双水相体系的相图。双节线 数据用一个四参数非线性方程进行了拟合,采用有效排出体积理论计算了四 种硫酸盐在丙酮溶液中的值,通过值与相图,比较了盐的分相能力。同 时对比相同阴离子,不同阳离子的盐析能力及阳离子所带电荷数对盐析能力的影 响。 用丙酮.双水相体系萃取分离了盐酸土霉素’和盐 酸四环素’,并且测定了目标物在上下两相中的分配系数以及萃 取率。讨论了目标物在两相间的分配的机理以及目标物浓度、、温度、分 相盐浓度以及丙酮体积对于双水相体系上相体积和萃取率的影响机制。丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 第二章丙酮.柠檬酸盐双水相体系相图及数据拟合研究 双水相体系是一种或几种物质在水中以适当的浓度溶解,在一定 条件下形成互 不相溶的上下两相,两相中水所占比例可以达到~%。双水相中两相密度和折 射率差别较小,相界面张力小,两相易分散,活性生物物质或细胞不易失活,可 在常温、常压下进行,易于连续操作,具有很多优点,备受工业界的关注。目前 该体系已经成功应用于蛋白质、抗生素、小分子有机化合物和重金属离子的分离 和富集。 测定系统、完整、准确的双水相体系的双节线和液液平衡数据是设计双水相萃 取以及建立热力学模型的基础。由于关于丙酮.盐双水相体系的相图数据报道较少, 而且许多文献报道的双节线数据不完整,许多建立在丙酮.盐双水相体系的应用并 没有涉及到该类双水相体系的相图研究。目前用来测定液液相平衡时上下相组分 数据的方法很多,例如盐的含量可以用原子吸收法,滴定法,重量法,电导率法 和折光率法测定;聚合物的含量可以用折光率法测定;小分子有机溶剂的含量可 以用气相色谱法和氧化法测定;水的含量可以用冷冻干燥法和 法测定。因此,为了得到双水相体系液液相平衡数据必须分别测定上相和下相中 至少两种组分的含量,即测定四个数据才能得到一条系线,操作比较繁琐。 本章基于双节线拟合方程以及“杠杆规则”,由直接计算得到了液液 相平衡数据,大大简化了常规操作流程。计算所得数据由方程和 方程进行了关联和验证。 .实验部分 ..仪器与试剂 丙酮、柠檬酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾,以上试剂均为分析纯,由国药集团 化学试剂有限公司提供。实验用水为二次蒸馏水; 电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司,误差为土. ; 恒温水浴锅?巩义市英峪予华仪器厂,误差为士.?。 ..实验方法 ,,江苏大学硕士学位论文 ...浊度法绘制体系双节线 首先称量一定量的盐于锥形瓶中,加蒸馏水溶解,置于一定温度的水浴中恒 温,然后逐步滴加丙酮,直至溶液恰好出现浑浊;然后再加一定量 的水使溶液变 澄清,再逐步滴加丙酮直至溶液恰好出现浑浊。通过称量法可得到各组分的质量, 从而计算出浊点时丙酮、柠檬酸盐、水的质量分数。重复上 述步骤,重新称量不同质量的盐进行滴定。 ...液液相平衡实验 具塞比色管中,振荡溶解, 首先称量一定量的盐所:和水所,于 分液漏斗中,置于一定温度 然后加入适量的醇聊。,充分混合后,转移至 的恒温水浴中静置分相,当两相完全澄清后分液,分别称量下相质量%与上 相质量聊。。 基于方程.以及“杠杆规则”的原理可以得到以下三个方程: 叫/尺一一尺/,瞄 . 嵋/一一尺/尺呓 .. 尺 / 其中叫,钟,嵋和噬分别代表了丙酮和盐在上相和下相中的质 量分数。?和分别代表了丙酮和盐的总质量分数。利用方程,通过 可快速计算出双水相体系液液相平衡组成。 本章所研究体系的系线长度兕 ,斜率分别用以下方程.和. 计算。 . 儿 叫一衅嵋一谚 . 一钟/嵋一呓 其中和:分别代表丙酮和柠檬酸盐在上相中的质量分数。钟,磋分 别代表丙酮和柠檬酸盐在下相中的质量分数。丙酮双水相体系萃 取富集四环素类抗生素的研究 .结果与讨论 ..双节线数据的测定与拟合 丙酮呷//在.,., .下的双节线数据列于表.、.和.。本章的双节线数据的拟合是 采用一个四参数的非线性方程.: . ,嵋口以%毋嵋 其中?是丙酮的质量分数,是柠檬酸盐的质量分数,系数谚,,潮 为拟合参 . 表. 时的 丙酮唧在.,., 双节点数据 . 伽,仁 丘 .,., . 当 塑堡 当 堡 塑当 塑堡 当 塑堡 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 江苏大学硕士学位论文 表.丙酮在.,.,锄.时的 双节点数据 .嬲触 弘 .,., . 丙酮双水相体系萃取富集四环素类抗生素的研究 表.丙酮在.,.,.时的 双节点数据 . ?触 仁., ., . 江苏大学硕士学位论文 使用方程.拟合双节线数据所得的参数、相关系数及标注偏差耐 列于表.。通过表.可以看出含有四个参数的方程.能够很好地关 联实 验所得的双节线数据,其拟合的相关系数大于.,标准偏差小于 .。因此方程.可以用来拟合丙酮柠檬酸盐。利用方程.拟合 的双节线列于图.、.和.。通过拟合出的双节线可以看出温度对 双节线数据 的影响很小,丙酮.柠檬酸盐可以在较宽的温度范围内应用。 表.方程.对于丙酮//在 .,., .时的双节点数据的拟合参数 . ’ 锄 / 叫. / 丁.,., . ?是。衅衅。厶,其中。是实验所得丙酮的质量分数,”是方程. 计算所得的丙酮的质量分数, 胛表示双节线数据点的个数。