病毒的血凝及血凝抑制试验

病毒的血凝及血凝抑制试验 大连瑞达生物实验室技术资料 病毒的血凝及血凝抑制试验 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作，了解其实用价值。 [材料与试剂] 1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50,L定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。 3. 新城疫病毒液(尿囊液或冻干疫苗液)，新城疫阳性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] (一)血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50,L生理盐水。 ,L病毒液(尿囊液或冻干疫苗液)，混合均匀后，吸50,L2. 于左侧第1孔加50 至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50,L;第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50,L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果(4-1)。 表 4-1 病毒血凝试验的操作方法(单位:,L) 孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 病毒液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0.5%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃50 结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + + - - 4. 结果判定:从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行 大连瑞达生物实验室技术资料 结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集(++++)，不凝集者(-)红细胞沉于孔底呈点状。 % 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1以100 看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50,L生理盐水。 3. 第,孔加被检鸡血清50,L，吹吸混合均匀，吸50,L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50,L，稀释度分别为:1:,、1:4、1:8 „„ ;第12孔加新城疫阳性血清50,L，作为血清对照。 4. 自第1孔至12孔各加50,L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50,L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果(表4-2)。 表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法(单位:,L) 孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血清稀病毒 血清 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 对照 对照 释度 生理盐50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 水 被检鸡50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 血清 4单位病50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 毒 室温中静置 10 min 0.5%红细50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 胞 弃去50 结果观 - - - - - - + ++ +++ ++++ ++++ - 察 6. 结果判定:待病毒对照孔(第11孔)出现红细胞100%凝集(++++)，而血清对照孔(第12孔)为完全不凝集(-)时，即可进行结果观察。 以100,抑制凝集(完全不凝集)的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效 大连瑞达生物实验室技术资料 价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。 从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。 附 录 1. 阿氏液(Alsever):即红细胞保养液 枸橼酸钠(5HO) 0.80g 2 枸橼酸(HO) 0.055g 2 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g 双蒸水 加至 100 ml 将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115?灭菌10min,4?保存备用。 2. 0.5% 鸡红细胞制备方法 先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1,5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。 3. 96孔微量反应板的清洗 将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37?温箱中干燥。