[doc] 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长
胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎
干细胞生长
?
470?
上海交通大学(医学版)
JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)Vo1.26No.5May
2006
【文章编号】0258—5898(2006)05—0470—06?基础研究?
胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长
施英唐.唐帆.褚建新
(上海交通大学医学院新华医院发育生物学研究中心,上海200092)
【摘要】目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力.方法先诱导
mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB—dFE),以用作饲养细胞.采用形态学,集落形成率,细胞分
化率,免疫细胞化学,碱性磷酸酶染色和RT—PCR对生长在mEB—dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定.采用RT—PCR和诱
导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性.结幂从EB三个发育阶段(EB贴壁l0,l5,20d)分离出48个mEB—
dF系,其中5个(来自15d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能
性达l0代以上.生长在这种饲养层上的mESCs与生
长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达
碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA—l,OCT-4,
NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB—dF系
则不具有这种能力.结论研究不仅为mESCs体外培养提
供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还
提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异
的分子机制值得进一步研究.
【关键词】小鼠胚胎干细胞;类胚体;饲养细胞
【中圈分类号】R329.1;R329.28;Q26【文献标识码】A
MouseEmbryonicStemCellsDerivedFeederCellsSupporttheGrowthof
Themselves
SHIYing-tang,TANGFan,CHUJian-xin
(CenterforDevelopmentalBiology,XinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai
200092,China)
Abstract:ObjectiveTotestwhether~edercellsderivedfrommouseembryonicstemcells(mESCs)c0uldsup.
portthegrowthofmESCsthemselves.MethodsmESCswereinducedtoformmouseembryoidbodies(EB),and
thenfibroblast—likecellswerederivedfromfurtherdifferentiatedmEB(mEB.dF),whichservedasfeedercells.The
undifferentiationofmESCsgrownonmEB—dFwasconfirmedbymorpholo
gicalanalysis,colonyefficiencyandcelldif-
ferentiationrateofmESCs,immun0cyt0chemistry,alkalinephosphatasestainingandRT.PCR.Thepluripotencyof
dFwasexaminedbyRT.PCR,inducingtheirdiffere mESCsgrownonmEB—
ntiation0andinitro.Results
Forty—eightfibroblast—likecellslineswerederivedfromthesameEBatthreeperiods(d10,d15andd20),andfive
ofthem,mostlyderivedfromd15EB,wereabletomaintainmESCsinundifferentiatedstatusandpluripotentia1abili.
tyover10passages.mESCsculturedonthesefeedercelllinesexpressedalkalinephosphataseandspecificmESCs
markers,includingSSEA一
1,OCT-4,NANOG,andformedEBinvitroandteratomasvivo.
HOWever.themaj0ritv
ofmEB—dFlines(43/48)hasnosuchability.ConclusionThisstudynotonlyprovidesan0velfeedersvstemfor
mESCsculture,avoidinglotofdisadvantagesofmouseembryofibroblastsusedasthefeeder.butals0indicatesthat
fibroblast—likecellsderivedfrommESCstakeondifferentfunctions.Themolecularmechanism0fdif_feI-entf.uncti0n0f
thesefibroblastcellsisworthyoffurtherinvestigations.
Keywords:mouseembryonicstemce11s;embry0idbedy:feederce11s
【基金项目l国家重点基础研究发展规划(“973”)项目(2001CB509904)
【作者筒介l施英唐(1975一),女,福建泉州人,博士生
【通讯作者l褚建新,E-mall:jianxinchu@yahoo.com.cn
NO.5施英唐,等:胚胎于细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎于细胞生
长’’卜
20多年前,小鼠胚胎干细胞(mouseembryonic
$temcells.mESCs)的分离和维持是以小鼠胚胎成纤
维细胞(mouseembryofibroblast,MEF)作为饲养层
进行共培养而获得的.对MEF能够维持mESCs
长期生长的特殊作用目前了解甚少.一般认为,
MEF提供mESCs最佳的生长环境,有利于信号网络
的相互作用以及解毒等.3].至今,仅有少数饲养细
胞体系能支持mESCs的生长,如MEF,SIM小鼠胚胎
来源的抗硫代氨基酸和哇巴因细胞(SIMmouse
embryo—derivedthioquanineandouabainresistant,STO)
和幼仓鼠肾脏细胞(babyhamsterkidneycells,
BHK21)等J,其中MEF最常用.然而它们都是来
源于异种或同种异体的饲养细胞,存在引入种间和
种内病原体的可能性;此外,还需不断培育胎鼠
制备MEF,以及其最佳应用期为4,6代不等.
最近有研究者报道,人胚胎干细胞(humanem—
bryonicstemcells,hESCs)来源的成纤维细胞可作为
饲养细胞体系支持自体hESCs生长.在mESCs培养
中尚未见类似报道.为试验mESCs来源的成纤维细
胞能否支持自身mESCs生长,我们分离了48个小鼠
类胚体来源的成纤维样细胞系(mouseembryoid
body-derivedfibroblast,mEB—dF),发现其中5个能够
保持mESCs未分化状态和多潜能,而大多数(43/48)
没有这种作用.本研究不仅提供了一种支持mESCs
生长的新饲养细胞,而且还提示mESCs可诱导出不
同功能的成纤维样细胞.
材料与方法
小鼠成纤维样细胞的诱导mESCs—D3(CRL一
11632,ATCC)按常规培养.培养液成分包括DMEM
(Gibco),15%胎牛血清(fetalbovineserum,FCS)(Hy—
clone),1000U/mL白血病抑制因子(1eukemiainhibi—
toryfactor,LIF)(Sigma),0.1mmoL/LB一巯基乙醇
(Sigma),1%非必需氨基酸(MEM—nonessentialamino
acidsolution,NEAA)(Gibco)和1%青霉素/链霉素
(penicillin/streptomycin,P/S)(Gibco).为诱发类胚体
(embryoidbodies,EB)产生,将mESCs悬浮培养5,6
d,诱导液成分包括DMEM,10%FCS,0.5I~mol/L全
反式视黄酸(Sigma)和1%P/S.为进一步诱导EB
分化,将形成的EB贴壁培养于预涂0.1%明胶的培养
皿中,诱导液包括DMEM,10%FCS,10%马血清(Sig—
ma),1%NEAA,1%鸡胚提取液(chickembryoex-
tract,CEE)(AccurateChemical&ScientificCorpora—
tion),10ng/mL表皮生长因子(epidermalgrowthfac—
t0r.EGF)(Sigma)和1%P/S,隔日换液,培养到第
10天,用0.05%的胰酶/EDTA(Gibco)消化从mEBs
迁移出的细胞进行培养.其余贴壁的EB进一步培
养,经5d和10d分别重复培养消化下细胞的步骤.
以上三个阶段被消化下来的细胞称为原代细胞,原代
细胞培养5,10d达到90%融合时,用0.05%的胰
酶/EDTA消化传代,传代细胞改换培养液进行培养
(培养液为DMEM,20%FCS,1%NEAA和1%P/S),
直到形态全为成纤维样,统称为mEB-dF.
mEB.dF作为饲养层将第5,20代的mEB—dF
(48个细胞系)用细胞霉素c处理后,接种于预涂有
0.1%的明胶培养皿中为饲养层,接种密度为10000
,
12000cells/cm.将mESCs接种于mEB—dF饲养
层上进行培养,以MEF饲养层为对照,每日换液.集
落边缘出现分化前用0.05%胰酶/EDTA进行消化传
代,接种于备好的饲养层上.mESCs接种于饲养层
上的集落形成率和分化率按以下公式计算:
集落形成率=(集落数/5×10)×100
分化率=(分化集落/总的集落数)×100
每次集落计数20个视野(×100),重复3次.
碱性磷酸酶染色结果示未分化集落为全染色集落,
分化集落包括部分染色和未染色集落.结果以
?s表示.
mESCs的核型
mESCs与mEB—dF共培养
前后,按G一带方法对其进行核型分析,每个细胞
样品均取20个染色体中期进行计数.
免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色:贴壁细胞用
4%多聚甲醛固定15min.0.1%TritonX一100/PBS处
理10min.用3%BSA/PBS阻断3omin后加入已稀
释的一抗,置湿盒中4?孵育过夜;用PSA替代一抗
作为阴性对照.使用的第一抗体包括Vimentin(博士
德),OCT-4(SantaCruz),SSEA一1(Chemicon),二抗标
记FITC或辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,
HRP)(Jackson),后者用DAB底物(博士德)显色.苏
木素复染.结果在显微镜下观察并拍照(A×80;
Olympus).碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,APase)
活性用BCIP/NBT底物(Roche)显色.
体外分化为检测mESCs在mEB-dF上生长后
的多潜能特性,第8代mESCs被悬浮培养形成EB,
并且通过将EB贴壁培养进一步诱导其分化.EB贴
壁培养3周后进行RT—PCR分析.
体内分化以mEB—dF为饲养层,将mESCs培
养数代后注射到NOD/LtSz—scid小鼠的大腿肌肉内,
每只鼠注射3×10,5×10个细胞.10,12周后
观察取材,将生成瘤块用4%多聚甲醛固定过夜,常
上海交通大学(医学版)
规石蜡切片,苏木素染色观察.小鼠由中科院上海
实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(沪)2002-
0010,使用许可证号:SYXK(沪)2002—0033.
RT.PCR用Trizol(Invitrogen)提取细胞总
RNA,然后用DNAseI(Promega)37?处理20min以
降解DNA,用M.MLV逆转录酶和随机引物(Promega)
合成第一链.PCR所用引物如表l.PCR反应条件:
94?预变性4min;然后94?30S,56oC(62cI=:REX-
1)30s,72?30s,共4o个周期,最后72?10min.
表1PCR引物
Tab1PCRprimers
Products
GenesPrimerq”“(bp)A..i.”“.
结果
mEB-dF的生长特性EB贴壁生长10d,有大
量细胞迁出,其中约85%为成纤维样细胞(图1A),
其余为上皮样细胞.将迁出的细胞进行消化培养,
贴壁的EB仍继续培养,5d后大量细胞迁出,细胞形
态各异,成纤维细胞比例下降到约55%(图lB).再
将迁出细胞消化培养.保留贴壁EB继续培养5d,
有更多异质性细胞迁出(图1C).将三个阶段(第一
阶段10d,第二阶段15d;第三阶段20d)分离出的
细胞传3,5代后,几乎所有细胞呈成纤维细胞形态
(图1D)即为mEB-dF.这些细胞表达两种成纤维细
胞的标志:Vimentin和P4HB(图lE,F).细胞每隔
2,4d按l:3传代,在本培养条件下所有细胞可传
至27代左右.总计48个细胞系,三个阶段各有l6
个.mEB.dF在冻存和复苏后成活率约75%.本研
究以第5代至20代的mEB-dF作为饲养层.
以mEB-dF为饲养层的mESCs生长特性将
mESCs与48个mEB.dF细胞系进行共培养,发现其
中5个细胞系能有效地支持mESCs未分化生长超过
l0代.这5个细胞系称为有效成纤维细胞(efficient
fibroblasts,EF),细胞系一个来自EB分化第一阶段
迁出的细胞,4个来自EB分化第二个阶段迁出的细
胞.以这5个细胞系为饲养层,mESCs仍保持它们
典型的形态(图2A),其生长速度与生长在MEF上
的相似,即每隔2,3d按l:6传代.当mESCs与
EF共培养8代后,其集落形成率和分化率与同MEF
共培养4代后的相似(表2).相反的,当mESCs与
其它43个细胞系共培养时,第一代细胞分化率超过
95%(图2B,表2).此外,早期l,4代虽然能形成
集落,但绝大部分的集落呈分化状态(图2B,表2).
因此,将这43个细胞系称为无效成纤维细胞(ineffi.
cientfibroblasts,IF)细胞系.当mESCs在IF上生长
到第6代已无法再形成集落(数据未显示).这些结
果表明EF和MEF一样能够支持mESCs未分化生长.
mESCs与EF共培养前后的核型相同(数据未显示).
表2以mEB-dF为饲养层的mESCs的集落形成率和细胞分化率
(i?s)
Tab2ColonyefficiencyandcelldifferentiationrateofmESCs
grownonmEB-dF(i?s1
以mEB-dF为饲养层的mESCs未分化特性
经mESCs未分化标志抗原免疫细胞化学和RT.PCR
检测证明,mESCs和EF共培养8代后仍然表达
OCT-4,SSEA-l,REX-l和APase(图3A,C,E;图
4A);而mESCs和IF共培养l代后OCT4和SSEA.1
几乎不表达(图3B,D,F),APase为部分表达,共培
养6代后仍有REX.1表达(图4A).
以mEB-dF为饲养层的mESCs多潜能特性
以EF为饲养层,mESCs生长8代后仍能形成EB(图
5A),EB贴壁培养后有分化细胞迁出(图5B,C,D).
通过RT?PCR分析证明含三个胚层的细胞(图4B).
态m2个J止纤维细胞特
蛛标得到确认总【l48个戍纤维样咆乐束
于相同呐?个发育阶段,遗些细胞系可恃20代
上仃意义的是其巾5十(多数朱门帮_二阶段)
能生持n佛IIIESCs未分化逃I”代上生K
该饲粹细胞j的mESCs侏宵啄米特征,遮特
l-塘过集绋彤志学表1mESCs特琳标记,以琏证悼
01-肜_J芷FH和住体内形成l啼腑州等讣估得倩认;
mESCs集潜孵成败琦暑细胞舒化率生&任MEl”
的IIIESCs也相似结表明.我分离的?IEB—dF
巾少部什支持l体mESCs长的J能且要
澉瓤功,亓和复苏的影响一为mESC~培养提供一种新
的饲养细恤,畦免丁MEF作锕养胞的多缺点
值得盥的是一来源的mB—dF中大多数(1,3/
48)白吏持mESCs丰仆化乍的能力血就
址砒.mESCs诱甘出的这些成纤维绑胞最+少数可
戈持mESCs生{乇,而擞大多数缺乏这种作用这些
细胞J能缺乏立持mESGs生{乇的因子或胞外筚质
拈llJrC1mmbers等指…缺王分泌L【F功能的
ME井小能阻止mESCs的抒『七搓近舛柯仔【
究袁叫l墚L?1外诬仃其它f号建径在维持
hESCs_I…ESCs持续增蚯,r1找?新j1舒化巾
起到跫谜n.用.这些信号缝径包括BMP4,SCF”I’GF.
誓
No.5施英唐,等:胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生
长?475?
131,FGF,WNT3等.最近Li等?在分离的多种饲养
层细胞支持同源ES的实验中发现,凡是能够高表达
LIF,bFGF,BMP4,SCF,TGF.Bl,WNT3的细胞就能够
有效支持其同源ES的生长,而那些不表达或低表达
这些信号的细胞恰恰缺乏支持ES生长的能力.这样
的结果似乎可以解释其分离的不同饲养层细胞具有不
同的支持能力.在本实验中EF和IF是不是也存在着
相同的信号途径差异还是另有原因,进一步探讨这一
现象的本质将有助于理解mESCs自我更新的机制.
至于支持自体mESCs未分化生长的mEB.dF为什么
多数来自第二阶段的EB,这是不是与分离MEF作为
饲养层需来自胎鼠发育特定阶段(14.5d)一样,因为
这个特定发育阶段的成纤维细胞才具有有效的支持
作用,但其中的机理目前尚不清楚.
据文献?”报道,有2种方法可获得hESCs来
源的饲养细胞:一种方法是hESCs在无饲养细胞培
养体系中培养一周后自发分化为成纤维样细胞,通
过传代可用作饲养细胞.另一种方法是先诱导
hESCs形成EB,再诱导其进一步分化,l0,14d后
从贴壁EB迁出的成纤维样细胞,通过传代可用作饲
养细胞.在本研究中,按前一种方法培养mESCs.
D3,细胞增殖形成分化集落,无分化成成纤维细胞的
现象,5—7d后细胞融合达90%,传代后大多细胞退
化或死亡,少数细胞贴壁,但失去增殖能力,一周后
衰老.该
不能诱导mESCs分化出饲养细胞.用
另一株小鼠胚胎干细胞(mESCs.S8,来自本实验室)进
行同样实验结果相似(数据没显示).当按照第二种
方法(本实验稍做修改),先诱导mESCs形成EB,进一
步诱导其分化为成纤维样细胞并建立细胞系,其中少
数细胞系有支持自体mESCs未分化生长能力.提示
mESCs和hESCs来源的成纤维样细胞的特性有所不
同,这种不同可能不是培养条件所导致,而是种间不同
所致,这与目前认为人和小鼠的ESCs存在许多差异
的看法是一致的.
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【收稿日期】2006—01—05【本文编辑】周珠凤