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[doc] 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

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[doc] 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长[doc] 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎 干细胞生长 ? 470? 上海交通大学(医学版) JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)Vo1.26No.5May 2006 【文章编号】0258—5898(2006)05—0470—06?基础研究? 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长 施英唐.唐帆.褚建新 (上海交通大学医学院新华医院发育生物学研究中心,上海200092) 【摘要】目...
[doc] 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长
[doc] 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎 干细胞生长 ? 470? 上海交通大学(医学版) JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)Vo1.26No.5May 2006 【文章编号】0258—5898(2006)05—0470—06?基础研究? 胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长 施英唐.唐帆.褚建新 (上海交通大学医学院新华医院发育生物学研究中心,上海200092) 【摘要】目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力.方法先诱导 mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB—dFE),以用作饲养细胞.采用形态学,集落形成率,细胞分 化率,免疫细胞化学,碱性磷酸酶染色和RT—PCR对生长在mEB—dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定.采用RT—PCR和诱 导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性.结幂从EB三个发育阶段(EB贴壁l0,l5,20d)分离出48个mEB— dF系,其中5个(来自15d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能 性达l0代以上.生长在这种饲养层上的mESCs与生 长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达 碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA—l,OCT-4, NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB—dF系 则不具有这种能力.结论研究不仅为mESCs体外培养提 供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还 提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异 的分子机制值得进一步研究. 【关键词】小鼠胚胎干细胞;类胚体;饲养细胞 【中圈分类号】R329.1;R329.28;Q26【文献标识码】A MouseEmbryonicStemCellsDerivedFeederCellsSupporttheGrowthof Themselves SHIYing-tang,TANGFan,CHUJian-xin (CenterforDevelopmentalBiology,XinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai 200092,China) Abstract:ObjectiveTotestwhether~edercellsderivedfrommouseembryonicstemcells(mESCs)c0uldsup. portthegrowthofmESCsthemselves.MethodsmESCswereinducedtoformmouseembryoidbodies(EB),and thenfibroblast—likecellswerederivedfromfurtherdifferentiatedmEB(mEB.dF),whichservedasfeedercells.The undifferentiationofmESCsgrownonmEB—dFwasconfirmedbymorpholo gicalanalysis,colonyefficiencyandcelldif- ferentiationrateofmESCs,immun0cyt0chemistry,alkalinephosphatasestainingandRT.PCR.Thepluripotencyof dFwasexaminedbyRT.PCR,inducingtheirdiffere mESCsgrownonmEB— ntiation0andinitro.Results Forty—eightfibroblast—likecellslineswerederivedfromthesameEBatthreeperiods(d10,d15andd20),andfive ofthem,mostlyderivedfromd15EB,wereabletomaintainmESCsinundifferentiatedstatusandpluripotentia1abili. tyover10passages.mESCsculturedonthesefeedercelllinesexpressedalkalinephosphataseandspecificmESCs markers,includingSSEA一 1,OCT-4,NANOG,andformedEBinvitroandteratomasvivo. HOWever.themaj0ritv ofmEB—dFlines(43/48)hasnosuchability.ConclusionThisstudynotonlyprovidesan0velfeedersvstemfor mESCsculture,avoidinglotofdisadvantagesofmouseembryofibroblastsusedasthefeeder.butals0indicatesthat fibroblast—likecellsderivedfrommESCstakeondifferentfunctions.Themolecularmechanism0fdif_feI-entf.uncti0n0f thesefibroblastcellsisworthyoffurtherinvestigations. Keywords:mouseembryonicstemce11s;embry0idbedy:feederce11s 【基金项目l国家重点基础研究发展规划(“973”)项目(2001CB509904) 【作者筒介l施英唐(1975一),女,福建泉州人,博士生 【通讯作者l褚建新,E-mall:jianxinchu@yahoo.com.cn NO.5施英唐,等:胚胎于细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎于细胞生 长’’卜 20多年前,小鼠胚胎干细胞(mouseembryonic $temcells.mESCs)的分离和维持是以小鼠胚胎成纤 维细胞(mouseembryofibroblast,MEF)作为饲养层 进行共培养而获得的.对MEF能够维持mESCs 长期生长的特殊作用目前了解甚少.一般认为, MEF提供mESCs最佳的生长环境,有利于信号网络 的相互作用以及解毒等.3].至今,仅有少数饲养细 胞体系能支持mESCs的生长,如MEF,SIM小鼠胚胎 来源的抗硫代氨基酸和哇巴因细胞(SIMmouse embryo—derivedthioquanineandouabainresistant,STO) 和幼仓鼠肾脏细胞(babyhamsterkidneycells, BHK21)等J,其中MEF最常用.然而它们都是来 源于异种或同种异体的饲养细胞,存在引入种间和 种内病原体的可能性;此外,还需不断培育胎鼠 制备MEF,以及其最佳应用期为4,6代不等. 最近有研究者报道,人胚胎干细胞(humanem— bryonicstemcells,hESCs)来源的成纤维细胞可作为 饲养细胞体系支持自体hESCs生长.在mESCs培养 中尚未见类似报道.为试验mESCs来源的成纤维细 胞能否支持自身mESCs生长,我们分离了48个小鼠 类胚体来源的成纤维样细胞系(mouseembryoid body-derivedfibroblast,mEB—dF),发现其中5个能够 保持mESCs未分化状态和多潜能,而大多数(43/48) 没有这种作用.本研究不仅提供了一种支持mESCs 生长的新饲养细胞,而且还提示mESCs可诱导出不 同功能的成纤维样细胞. 材料与方法 小鼠成纤维样细胞的诱导mESCs—D3(CRL一 11632,ATCC)按常规培养.培养液成分包括DMEM (Gibco),15%胎牛血清(fetalbovineserum,FCS)(Hy— clone),1000U/mL白血病抑制因子(1eukemiainhibi— toryfactor,LIF)(Sigma),0.1mmoL/LB一巯基乙醇 (Sigma),1%非必需氨基酸(MEM—nonessentialamino acidsolution,NEAA)(Gibco)和1%青霉素/链霉素 (penicillin/streptomycin,P/S)(Gibco).为诱发类胚体 (embryoidbodies,EB)产生,将mESCs悬浮培养5,6 d,诱导液成分包括DMEM,10%FCS,0.5I~mol/L全 反式视黄酸(Sigma)和1%P/S.为进一步诱导EB 分化,将形成的EB贴壁培养于预涂0.1%明胶的培养 皿中,诱导液包括DMEM,10%FCS,10%马血清(Sig— ma),1%NEAA,1%鸡胚提取液(chickembryoex- tract,CEE)(AccurateChemical&ScientificCorpora— tion),10ng/mL表皮生长因子(epidermalgrowthfac— t0r.EGF)(Sigma)和1%P/S,隔日换液,培养到第 10天,用0.05%的胰酶/EDTA(Gibco)消化从mEBs 迁移出的细胞进行培养.其余贴壁的EB进一步培 养,经5d和10d分别重复培养消化下细胞的步骤. 以上三个阶段被消化下来的细胞称为原代细胞,原代 细胞培养5,10d达到90%融合时,用0.05%的胰 酶/EDTA消化传代,传代细胞改换培养液进行培养 (培养液为DMEM,20%FCS,1%NEAA和1%P/S), 直到形态全为成纤维样,统称为mEB-dF. mEB.dF作为饲养层将第5,20代的mEB—dF (48个细胞系)用细胞霉素c处理后,接种于预涂有 0.1%的明胶培养皿中为饲养层,接种密度为10000 , 12000cells/cm.将mESCs接种于mEB—dF饲养 层上进行培养,以MEF饲养层为对照,每日换液.集 落边缘出现分化前用0.05%胰酶/EDTA进行消化传 代,接种于备好的饲养层上.mESCs接种于饲养层 上的集落形成率和分化率按以下公式计算: 集落形成率=(集落数/5×10)×100 分化率=(分化集落/总的集落数)×100 每次集落计数20个视野(×100),重复3次. 碱性磷酸酶染色结果示未分化集落为全染色集落, 分化集落包括部分染色和未染色集落.结果以 ?s表示. mESCs的核型mESCs与mEB—dF共培养 前后,按G一带方法对其进行核型分析,每个细胞 样品均取20个染色体中期进行计数. 免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色:贴壁细胞用 4%多聚甲醛固定15min.0.1%TritonX一100/PBS处 理10min.用3%BSA/PBS阻断3omin后加入已稀 释的一抗,置湿盒中4?孵育过夜;用PSA替代一抗 作为阴性对照.使用的第一抗体包括Vimentin(博士 德),OCT-4(SantaCruz),SSEA一1(Chemicon),二抗标 记FITC或辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)(Jackson),后者用DAB底物(博士德)显色.苏 木素复染.结果在显微镜下观察并拍照(A×80; Olympus).碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,APase) 活性用BCIP/NBT底物(Roche)显色. 体外分化为检测mESCs在mEB-dF上生长后 的多潜能特性,第8代mESCs被悬浮培养形成EB, 并且通过将EB贴壁培养进一步诱导其分化.EB贴 壁培养3周后进行RT—PCR分析. 体内分化以mEB—dF为饲养层,将mESCs培 养数代后注射到NOD/LtSz—scid小鼠的大腿肌肉内, 每只鼠注射3×10,5×10个细胞.10,12周后 观察取材,将生成瘤块用4%多聚甲醛固定过夜,常 上海交通大学(医学版) 规石蜡切片,苏木素染色观察.小鼠由中科院上海 实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(沪)2002- 0010,使用许可证号:SYXK(沪)2002—0033. RT.PCR用Trizol(Invitrogen)提取细胞总 RNA,然后用DNAseI(Promega)37?处理20min以 降解DNA,用M.MLV逆转录酶和随机引物(Promega) 合成第一链.PCR所用引物如表l.PCR反应条件: 94?预变性4min;然后94?30S,56oC(62cI=:REX- 1)30s,72?30s,共4o个周期,最后72?10min. 表1PCR引物 Tab1PCRprimers Products GenesPrimerq”“(bp)A..i.”“. 结果 mEB-dF的生长特性EB贴壁生长10d,有大 量细胞迁出,其中约85%为成纤维样细胞(图1A), 其余为上皮样细胞.将迁出的细胞进行消化培养, 贴壁的EB仍继续培养,5d后大量细胞迁出,细胞形 态各异,成纤维细胞比例下降到约55%(图lB).再 将迁出细胞消化培养.保留贴壁EB继续培养5d, 有更多异质性细胞迁出(图1C).将三个阶段(第一 阶段10d,第二阶段15d;第三阶段20d)分离出的 细胞传3,5代后,几乎所有细胞呈成纤维细胞形态 (图1D)即为mEB-dF.这些细胞表达两种成纤维细 胞的标志:Vimentin和P4HB(图lE,F).细胞每隔 2,4d按l:3传代,在本培养条件下所有细胞可传 至27代左右.总计48个细胞系,三个阶段各有l6 个.mEB.dF在冻存和复苏后成活率约75%.本研 究以第5代至20代的mEB-dF作为饲养层. 以mEB-dF为饲养层的mESCs生长特性将 mESCs与48个mEB.dF细胞系进行共培养,发现其 中5个细胞系能有效地支持mESCs未分化生长超过 l0代.这5个细胞系称为有效成纤维细胞(efficient fibroblasts,EF),细胞系一个来自EB分化第一阶段 迁出的细胞,4个来自EB分化第二个阶段迁出的细 胞.以这5个细胞系为饲养层,mESCs仍保持它们 典型的形态(图2A),其生长速度与生长在MEF上 的相似,即每隔2,3d按l:6传代.当mESCs与 EF共培养8代后,其集落形成率和分化率与同MEF 共培养4代后的相似(表2).相反的,当mESCs与 其它43个细胞系共培养时,第一代细胞分化率超过 95%(图2B,表2).此外,早期l,4代虽然能形成 集落,但绝大部分的集落呈分化状态(图2B,表2). 因此,将这43个细胞系称为无效成纤维细胞(ineffi. cientfibroblasts,IF)细胞系.当mESCs在IF上生长 到第6代已无法再形成集落(数据未显示).这些结 果表明EF和MEF一样能够支持mESCs未分化生长. mESCs与EF共培养前后的核型相同(数据未显示). 表2以mEB-dF为饲养层的mESCs的集落形成率和细胞分化率 (i?s) Tab2ColonyefficiencyandcelldifferentiationrateofmESCs grownonmEB-dF(i?s1 以mEB-dF为饲养层的mESCs未分化特性 经mESCs未分化标志抗原免疫细胞化学和RT.PCR 检测证明,mESCs和EF共培养8代后仍然表达 OCT-4,SSEA-l,REX-l和APase(图3A,C,E;图 4A);而mESCs和IF共培养l代后OCT4和SSEA.1 几乎不表达(图3B,D,F),APase为部分表达,共培 养6代后仍有REX.1表达(图4A). 以mEB-dF为饲养层的mESCs多潜能特性 以EF为饲养层,mESCs生长8代后仍能形成EB(图 5A),EB贴壁培养后有分化细胞迁出(图5B,C,D). 通过RT?PCR分析证明含三个胚层的细胞(图4B). 态m2个J止纤维细胞特 蛛标得到确认总【l48个戍纤维样咆乐束 于相同呐?个发育阶段,遗些细胞系可恃20代 上仃意义的是其巾5十(多数朱门帮_二阶段) 能生持n佛IIIESCs未分化逃I”代上生K 该饲粹细胞j的mESCs侏宵啄米特征,遮特 l-塘过集绋彤志学表1mESCs特琳标记,以琏证悼 01-肜_J芷FH和住体内形成l啼腑州等讣估得倩认; mESCs集潜孵成败琦暑细胞舒化率生&任MEl” 的IIIESCs也相似结表明.我分离的?IEB—dF 巾少部什支持l体mESCs长的J能且要 澉瓤功,亓和复苏的影响一为mESC~培养提供一种新 的饲养细恤,畦免丁MEF作锕养胞的多缺点 值得盥的是一来源的mB—dF中大多数(1,3/ 48)白吏持mESCs丰仆化乍的能力血就 址砒.mESCs诱甘出的这些成纤维绑胞最+少数可 戈持mESCs生{乇,而擞大多数缺乏这种作用这些 细胞J能缺乏立持mESGs生{乇的因子或胞外筚质 拈llJrC1mmbers等指…缺王分泌L【F功能的 ME井小能阻止mESCs的抒『七搓近舛柯仔【 究袁叫l墚L?1外诬仃其它f号建径在维持 hESCs_I…ESCs持续增蚯,r1找?新j1舒化巾 起到跫谜n.用.这些信号缝径包括BMP4,SCF”I’GF. 誓 No.5施英唐,等:胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生 长?475? 131,FGF,WNT3等.最近Li等?在分离的多种饲养 层细胞支持同源ES的实验中发现,凡是能够高表达 LIF,bFGF,BMP4,SCF,TGF.Bl,WNT3的细胞就能够 有效支持其同源ES的生长,而那些不表达或低表达 这些信号的细胞恰恰缺乏支持ES生长的能力.这样 的结果似乎可以解释其分离的不同饲养层细胞具有不 同的支持能力.在本实验中EF和IF是不是也存在着 相同的信号途径差异还是另有原因,进一步探讨这一 现象的本质将有助于理解mESCs自我更新的机制. 至于支持自体mESCs未分化生长的mEB.dF为什么 多数来自第二阶段的EB,这是不是与分离MEF作为 饲养层需来自胎鼠发育特定阶段(14.5d)一样,因为 这个特定发育阶段的成纤维细胞才具有有效的支持 作用,但其中的机理目前尚不清楚. 据文献?”报道,有2种方法可获得hESCs来 源的饲养细胞:一种方法是hESCs在无饲养细胞培 养体系中培养一周后自发分化为成纤维样细胞,通 过传代可用作饲养细胞.另一种方法是先诱导 hESCs形成EB,再诱导其进一步分化,l0,14d后 从贴壁EB迁出的成纤维样细胞,通过传代可用作饲 养细胞.在本研究中,按前一种方法培养mESCs. D3,细胞增殖形成分化集落,无分化成成纤维细胞的 现象,5—7d后细胞融合达90%,传代后大多细胞退 化或死亡,少数细胞贴壁,但失去增殖能力,一周后 衰老.该不能诱导mESCs分化出饲养细胞.用 另一株小鼠胚胎干细胞(mESCs.S8,来自本实验室)进 行同样实验结果相似(数据没显示).当按照第二种 方法(本实验稍做修改),先诱导mESCs形成EB,进一 步诱导其分化为成纤维样细胞并建立细胞系,其中少 数细胞系有支持自体mESCs未分化生长能力.提示 mESCs和hESCs来源的成纤维样细胞的特性有所不 同,这种不同可能不是培养条件所导致,而是种间不同 所致,这与目前认为人和小鼠的ESCs存在许多差异 的看法是一致的. 【参考文献】 [1]EvansMJ.KaufmanMH.Establishmentincultureofpluripotential cellsfrommouseembryos[J].Nature,1981,292(5819):154— 156. [2]XuC,InokumaMS,DenhamJ,eta1.Feeder-freegrowthofundif- ferentiatedhumanembryonicstemcells[J].NatBiotechnol,2001, 19(10):971—974. [3]LiraJW.BodnarA.Proteomeanalysisofc0nditionedmediumfrom mouseembryonicfibrcblastfeederlayerswhichsupportthegrowthof humanembryonicstemcells[J].Proteomics,2002,2(9):1187— 1203. [4]MfopouJK,SwillemsE,LeynslL,eta1.Expressionofregulatory genesforpancreasdevelopmentduringmurineembryonicstemcell differentiation[J].IntJDevBiol,2005,49(8):915—922. 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