为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

氢化可的松发酵

2017-09-21 16页 doc 56KB 54阅读

用户头像

is_882336

暂无简介

举报
氢化可的松发酵氢化可的松发酵 子学习情境5 氢化可的松发酵 任务一 甾类药物 甾类药物是指分子结构中含有环戊烷多氢菲核的一类药物,在医学上应用非常广泛,特别是甾体激素类药物,应用在风湿性关节炎,控制炎症,避孕,利尿等各方面的治疗上,对机体起着非常重要的调节作用。甾类激素根据其生理活性可分为肾上腺皮质激素,性激素和蛋白同化激素三大类。 一、肾上腺皮质激素 12根据生理功能,肾上腺皮质激素可分为糖皮质激素和盐17131116D皮质激素两大类。糖皮质激素如可的松(cortisone)和氢化C1151014928可的松(hydrocorti...
氢化可的松发酵
氢化可的松发酵 子学习情境5 氢化可的松发酵 任务一 甾类药物 甾类药物是指分子结构中含有环戊烷多氢菲核的一类药物,在医学上应用非常广泛,特别是甾体激素类药物,应用在风湿性关节炎,控制炎症,避孕,利尿等各方面的治疗上,对机体起着非常重要的调节作用。甾类激素根据其生理活性可分为肾上腺皮质激素,性激素和蛋白同化激素三大类。 一、肾上腺皮质激素 12根据生理功能,肾上腺皮质激素可分为糖皮质激素和盐17131116D皮质激素两大类。糖皮质激素如可的松(cortisone)和氢化C1151014928可的松(hydrocortisone)是由肾上腺束状带细胞所合成和分AB735泌,主要影响人体的糖、蛋白质和脂肪的代谢,对水、盐的64 图17-1 甾体化合物的基本结构 代谢作用影响较小。临床上主要用于抗炎、抗毒素、抗休克 和抗过敏等。以醛甾酮和去氧皮甾酮为代的盐皮质激素是由肾上腺的球状带细胞分泌,主要作用是促进钠离子肾小管的重吸收,从而使钠的排泄量减小,促进钾的排泄。临床上主要用于治疗慢性肾上腺皮质机能减退症(阿狄森病)及低血钠症。 二、性激素 性激素的重要生理功能是刺激副性器官的发育和成熟,激发副性特征的出现,增进两性生殖细胞的结合和孕育能力,还有调节代谢的作用。按其生理功能可分为雄性激素和雌性激素两类。 雄性激素属于C类固醇,主要由睾丸和肾上腺皮质所产生,卵巢也有少量合成。睾丸19 分泌的雄激素主要有3种:睾酮、脱氢异雄酮和雄烯二酮。 雌性激素包括雌激素和孕激素两类,主要由卵巢合成和分泌,肾上腺皮质和睾丸也能少量合成。雌激素,真正由腺体分泌,有活性的只有3种:17β-雌二醇、雌酮和雌三醇。三种激素生理活性相差很大,其相对比活为100 : 10 : 3。孕激素属于C类固醇,体内真正存在的21 是孕酮。 三、蛋白同化激素 蛋白同化激素是一类从睾丸酮衍生物中分化出来的药物,特点是性激素的作用大为减弱,蛋白质同化作用仍然保留甚至增强,临床使用比较安全,较少引起男性化症状等不良反应。如17α-甲基去氢睾丸素(17-methyldehydro-testosterone,商品名为大力补)。蛋白同化激素主要作用有:? 促进蛋白质合成和抑制蛋白质异化;? 加速骨组织钙化和生长;? 刺激骨髓 1 造血功能,增加红血球量;? 促进组织新生和肉芽形成;? 降低血胆甾醇。 由于甾体激素类药物具有上述独特的疗效,这类药物发展很快,早期,甾类激素药物的生产主要靠化学合成。1949年发现可的松皮质激素对风湿性关节炎具有明显的抗炎活性后,人们以一种从胆汁中提取的脱氧胆酸为原料,花费了两年时间,经过30余步化学反应才制得醋酸可的松,且收率很低(用脱氧胆酸615kg,才能得到1kg醋酸可的松)。由于化学合成的成本高,限制了甾体药物的发展。1952年Peterson和Murray发现少根根霉(Rhizopus arrhizus)及黑根霉(R.nigricans)能使黄体酮转化成11α-羟基黄体酮(11α-hydroxyprogesterone),收率达85%。这一发现为甾体激素类药物的生产找到了一条新的途径——微生物转化。在前述的醋酸可的松生产中,脱氧胆酸的C-12上的氧原子通过化学方法移到C-11上最为困难,需经过10步反应才能完成,而采用微生物转化则可以省去这10步反应。 细菌、酵母、霉菌和放线菌的某些种类都可能使甾类化合物的一定部位发生有价值的转化反应,微生物转化已成为甾体工业中不可缺少的部分,在生产中常采用化学合成与微生物转化相结合的办法。 微生物转化在生产工艺上有如下特点: ? 可减少化学合成步骤,简化生产流程,缩短生产路线。如由黄体酮生产炔诺酮,利用微生物转化,可以减少6步工序。 ? 能提高产物的收率和产品质量,降低成本。不同的菌种都会影响到产品的收率和成本,菌种越优良,反应越向有利的方向进行。采用生物转化,减少了生产步骤,从而也降低了过程损失。如19-羟基-4-雄烯-3,17-二酮转化为雌酮,采用化学法合成需要3步才能完成,产品得率只有15%~20%,而采用微生物转化法,得率可达到80%以上。采用化学合成,过程中的加入的化学物质常对产品质量也有影响,如生产去氢可的松和去氢化可的松,过程中要加入SeO,在产品中常含有少量的Se有毒物质。采用微生物转化则没有这种问。2 ? 可进行化学法难以实现的反应。如甾类化合物C-11上的加氧(即羟化)等反应,化学法难以实现,常采用微生物法处理。 另外,微生物转化可供选择的酶的种类较多,为生产过程提供了可能。微生物转化避免和减少了强酸、强碱或化学有毒物质,改善了生产环境。在甾类激素药物的生产中,目前一般采用化学合成和微生物转化两种方法相结合的生产工艺。 任务二 微生物转化反应原理 2 微生物几乎对甾体每个位置都能进行转化,其中对甾体激素药物合成比较重要的主要有氧化反应、还原反应、水解反应等。其中氧化反应又包括甾体骨架上的羟基化和脱氢(生成双键)、甾醇氧化成甾酮、支链降解作用以及D环的切断和D环开裂形成内酯环等。 一、羟化反应 甾体上羟化对化学合成而言是非常困难的,除了C位上通过化学方法能导入羟基外,17 其它位置很难导入。通过微生物羟化酶能非常专一地选择某个碳位置上将某空间位置上的氢取代氧化成原来空间构型的羟基。 甾体激素药物的羟化反应机理经同位素追踪试验研究表明,转化到甾体的羟基是直接取代甾体碳架上的氢,不是通过形成烯的中间体来完成的,羟化作用的氧也不是来自水中的羟基(-OH),而是来自空气中的氧,所以工业上用黑根霉转化甾体时需要充分地供氧。霍亚马 3(Hoyam)及其合作者曾将Cα和Cα位上的氢被H所取代的孕甾-3,20二酮作为底物用1112 黑根霉转化来进行研究,结果表明甾体的酶促羟化反应是羟基化位置上的氢被直接取代。 1(Cα羟化 9 Cα羟化在甾体药物合成中是一个关键中间步骤,涉及到甾体边链的选择性降解,并且9 是皮质激素合成中一个关键中间体。由于C位上导入羟基后,容易在C—C之间引入双键,9910然后进一步形成Cβ羟基或导入氟原子。例如甾体合成中重要中间体9α-羟基-4-雄甾烯-3,11 17双酮和9α-羟基-3氧化娠烷-4,17双烯-20羧酸的制取。图17-2,Cα羟化示例。9 OO Corynespoa-Casicola OHATCC 16718 OO 9α-羟基-4-雄甾烯-3,17-双酮 4-雄甾烯-3,17-双酮 COOHCOOH 棒状杆菌ATCC 21329 或矩杆菌NRRLB-8054OH OO 9α -羟基-3 -氧化娠烷-4,17-双烯-20-羧酸 3-氧化娠烷-4,17-双烯-20-羧酸 3 图17-2 Cα羟化示例 9 2(Cα羟化 11 Cα羟化是微生物转化的特有反应,人体内的酶也不能将甾体Cα羟化。通过微生物1111转化实现甾体Cα羟化,不仅解决药物合成,更重要意义是增加皮质激素类化合物活力,使11 其具有高度抑制炎症效应。Cα位羟化为通过微生物转化来寻找更有效新药开创了新途径。11 0如孕酮的转化中,利用黑根霉在温度不超过32C时成功地实现了Cα羟基化反应。温度11 0的控制很重要,生产过程中温度超过32C,黑根霉只会大量生长菌丝而不对孕酮进行Cα羟11化。过程伴随有微量副产物出现。 CH3CH3C O C OHO 黑根霉 Rhizopus Nigricans ATCC 62276O O 11 α-羟基孕酮 CH3 孕酮 (主要产物) CH3C O HOC O HO + + OO OHH 11 α,6β-二羟基孕酮 11 α-还原孕酮 (微量副产物) (偶然产生副产物) 图17-3 Cα羟化示例 11 在Cα羟化菌株中,以黑根霉最好,除黑根霉外其它如放线菌、棒状杆菌和诺卡氏菌11 等微生物对孕酮进行羟化反应同时,会伴随有降解反应,或将母核降解,没有生产意义。 另外,也能利用微生物转化的方法实现Cβ、Cα、Cα和Cα位的羟化反应,这11161719些也是制药工业中很有价值的反应。例如新月弯孢霉(Curvularoa lunata)能将Reichstein S 化合物(简称化合物S,Compound S)一步转化成氢化可的松。 CHOH2CHOH2 C OC OHOOH 新月弯孢霉 4 OO 图17-4 Cβ的羟基化 11 二、环氧化反应 用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基团的反应与微生物羟基化有关。能产生11β-羟基化的新月弯孢霉或布氏小克汉银霉都可将17α,21-二羟基-4,9(11)-孕甾二烯-3,20-二酮转化成9β,11β环氧化合物。 三、脱氢反应 当抗炎甾体激素等药物的母核C1,C2位置导入双键后,其抗炎作用会成倍增加。如图14-5所示醋酸可的松C1,C2位上导入双键成醋酸脱氢可的松后抗炎作用增强3~4倍,由于动物体不能转化生成C1,C2位脱氢甾体激素,所以只有通过人工改造得到。 CHOH2 C O HOOH RR31 R = 9αF或H; 1 O R = H,6αCH,6αF; 23 R2 R = H,16αCH,16βOH,16αOH。33 图17-5 几类增强抗炎症效的脱氢皮质激素 化学法脱C1,C2氢是采用二氧化硒法,由于硒在生产中难以除尽会使产品中带有少量对人体有害的物质,所以采用微生物转化脱氢是甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一步。 微生物对甾体C1,C2位脱氢通过实验研究知道,不是先经过羟基化脱水的过程而是直接脱去C1,C2位上的氢。 微生物对甾体羟化与脱氢能力是相反的,细菌的脱氢能力比真菌大,特别是棒状杆菌和分枝杆菌活力最大。球形芽孢杆菌,诺卡氏菌对可的松和皮质醇也有较高的脱氢活力。而对甾体母核有脱氢活力的微生物,常伴随边链降解和C位酮基还原以及其Cα羟化引起β环269打开等作用。 5 CHOH2CHOH2 C OC OOHROHR 棒状杆菌 OO R = O 可的松 R= O 去氢可的松 R = OH氢化可的松 R = OH 去氢氢化可的松 图17-6脱氢反应示例 四、甾体母核及边链的选择性降解机理 具有生理活性甾体类药物的基本母核目前都是从高等动植物中获得的,首先必须有选择性地对其边链进行降解。化学法选择性差,产率低。目前,多采用微生物转化法。 当前世界各国用来制取甾体药物的天然资源大多是薯蓣皂苷元(约占60%),其次是豆甾醇(约占15%),随着这些天然资源的日渐减少,各国都积极寻找新资源和新方法。其中以胆甾醇和β-谷甾醇较为突出,两者不仅可以从毛纺工业和油脂工业的废水和下脚料中获得,并可通过生物技术来控制微生物选择性降解边链来获得许多重要的甾体药物中间体。 早在1964年Whitmarch在研究诺卡菌变株代谢胆固醇时就提出了边链降解的机理。后来Sih及其同事们对胆甾醇代谢通过一系列实验作了全面解释。甾醇边链降解机理与脂肪酸的β氧化途径相似。胆甾醇的边链降解从C羟基化开始,再氧化成C羧醇,继后β氧化先失去2727 丙酸、醋酸,最后再失去丙酸,形成C酮化合物,最后一步转化为脱氢,加水和开裂。17 5而对于甾体母核的降解,先在C进行酯化,3β-羟基氧化后接着Δ双键被异构酶催化3 4转位为Δ双键,但此步异构化也可发生于非酶催化。在3-酮-4-烯化合物9α-羟基化后,随着C-1(2)-脱氢同时,甾体母核A环芳香化并导致β环开裂。 由上可知,边链和甾体母核降解过程表明若在微生物降解过程中控制氧化边链酶,9α-羟化酶和C,脱氢酶分别获得4AD,ADD和BDA等重要中间体用来控制甾体类药物。1 2 工业上通过生物技术来控制微生物选择性地降解甾体边链,以获得雄甾-4-烯-3,17-双酮,简称4AD;1,4-二烯-雄甾-3,17双酮,简称ADD;3-氧联降胆甾-1,4-二烯-22-酸,简称 6 BDA等。常用的控制途径主要是三个方面:? 通过底物-甾体结构的修饰;? 在微生物降解过程中加酶抑制剂;? 通过诱变技术获得生化阻断突变菌株。 任务三 甾体激素的生产工艺过程 甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生素的生产不同,发酵的产物不是目的产物,而只是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。整个生产过程,微生物的生长和甾体的转化完全可以分开,一般先进行菌的培养,在菌生长过程中累积甾体转化所需要的酶,然后利用这些酶来改造分子的某一部位。所以为了获得较多的酶,首先需保证菌体的充分生长,但微生物的生长与酶的生产条件不是完全一致的,所以这时还需了解各种菌产酶的最适条件,并尽可能地诱导生产所需要的酶而抑制不需要的酶。 一、甾体的微生物转化生产流程 甾体的微生物转化通常分两个阶段。第一阶段是生长阶段,它是将菌种接入斜面培养基或小米培养基培养3~5d,然后将成熟的菌种细胞或孢子接入摇瓶或种子罐,给予合适的温度、溶氧浓度、pH值等条件培养,使其充分繁殖与生长。培养时间的长短随菌种和环境而异,细菌的生长期12~24h,真菌为24~72h。第二阶段是转化阶段,一般是在微生物生长的终点,逐渐将甾体的粉末或适当的(有机)溶液加到培养物中,或把成熟细胞分离洗涤,然后悬浮于水或缓冲液中,再将底物加入,加入方式如图14-7所示。大多数甾体化合物难溶于水,所以常用的方法是先把底物溶于有机溶剂,如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺(饱和溶解度达10%~20%),浓度在2%对微生物无毒性。或用表面活性剂(如吐温80)来提高基质溶解度。 培养基 培养菌氧化甾(甲) 液 体 甾体基质 离心 菌种 培养基 菌体 甾体基质 氧化甾(乙) 体 的溶液(有机溶剂) 或悬浮液(缓冲) 图17-7 甾体基质的加入方式 液) 甾体氧化需要较大的通气量,一般为1:0.8(v/v/min)。甾体加入的速度随菌种转化能 7 力和基质的性质而定,一般浓度约200~800mg/L,也有高达4g/L的,采用基质的定期加入和连续加入的办法来解决基质或产物的毒性问题,对甾体氧化或脱氢反应必需供给很好的通气条件,转化时间随菌种而异,一般范围在12~72h,便可完成转化。转化后的产物大多不溶于水,所以采用溶媒萃取法进行提取。微生物转化生产甾体化合物一般采用二级培养,其工艺流程如下: 投入底物 滤液 菌种 孢子制备 种子培养 发酵 过滤 滤饼 溶媒萃取 结晶 如果产物分泌在发酵液中,则发酵滤液采用离子交换树脂吸附法吸附甾体化合物,洗脱后,减压浓缩进行结晶。 二、甾体微生物转化方式 进行微生物转化反应可以利用不同形式的微生物细胞,如菌体培养物、静止细胞悬液、孢子悬液、干细胞、混合培养物、固定化细胞或固定化酶等。 由生长菌体培养物进行的反应是在培养菌体的适当时间(中期或后期),添加基质,一边继续培养,一边进行反应。 由静态菌体悬液进行的反应是在适当的培养基中,使菌体充分生长发育后,用过滤或离心法进行分离,将收集到的菌体悬浮在水或适当的缓冲液中,再将甾类化合物加入进去,使其反应。该法有以下优点:能自由地改变反应液中的基质和菌体量的比例,与生长培养法相比,一般能缩短反应时间,在转化生长物中杂质较少,分离提纯比较容易等等。一次配成的静态菌体,能够在低温下保持其活性,故可省去多次培养反应菌的手续,使用的反应菌有时 0还能多次反复使用。诺卡氏菌氧化胆甾醇时,湿菌体的酶活性在-20C以下保存,能够长时间地稳定不变。 混合培养进行反应是将具有1,2脱氢能力和11β-羟化能力的微生物并用进行转化反应。如果两种微生物单独培养,则必须将各过程中的抽提产物转送到下面的工序,人力物力消耗较大。如采用混合培养法,则可省略抽提操作。例如以17α,21-二羟基-4-孕甾烯-3,20-二酮为原料生产强的松龙,首先用新月弯孢霉完成第一步羟化反应,将底物转化为氢化可的松(HC),然后在此反应液中,添加另外培养的环形芽孢杆菌菌液,进行后一步的脱氢反应得产品强的松龙,省略了中间产物反应液抽提分离过程。 CHOH2CHOH 2CHOH2COCOCO OHOHHOOHHO C.LunataB.Sphaericas OOO 8 又例如用9α-氟氢化可的松制造氟羟脱氢皮质甾醇时,是使用玫瑰产色链霉菌(16α-OH化)和简单节杆菌(Arthrobater Simplex)(1,2脱氢),用同一培养基将两者进行完全的混合培养。 CHOHCHOH22 COCO OHHOOHHOA.simplexS.rosechromogenes S.rosechromogenes A.simplex FFOO CHOH2 CO OHHOOH F O 在湿、干菌体活性比较稳定的情况下,将一次制成的菌液进行反复使用是可能的,但迟早会由溶菌而失活的。因此,要能长期使用,必须设计固定(化)细胞或固相酶,使菌体与酶的活性不受影响地固定在不溶于水的载体中。新月弯孢霉的湿菌体固定在聚丙烯酰胺的凝胶(PAAG)中,能有效地进行11β羟化反应。还可将简单节杆菌的丙酮干燥菌固定在骨胶原中,活性非常稳定,能够长期地应用于生产等。 三、影响转化的一般因素 (1)搅拌 增加转化培养基的搅拌,可以增加氧气的供给及使其均匀分散而提高转化率。 (2)通气 增加氧气的供给。有研究表明,溶解氧量对诱导酶产生非常重要。 (3)前体半连续的加入 可以降低由于一次大量加入所引起的毒性,也可减少由于发泡所引起前体的损失。 9 (4)培养基组成 ?氮源规格影响不太大,水解蛋白比蛋白胨好;?糖类和脂肪对11β羟化有影响;?有些酶反应需要金属离子,例如缺锌不能进行6β-羟化,而有些金属离子使酶失活。 (5)温度:微生物的培养都有适宜的温度,若温度太低,微生物生长不良,不能产生足够的酶;若温度过高,又会因酶蛋白变性而使转化反应受阻。 四、产物的与分离方法 产物的分析与分离均需要用适当的与水不混溶的溶剂将甾体从培养基中提取出来,最常用的如:氯仿、二氯乙烷、醋酸乙酯和甲基异丁基酮等。溶剂的用量需根据产物在培养基和溶剂中的分配系数而定,提取时要防止乳化。产物的提取液经适当的浓缩,用柱层析或直接用分步结晶的办法可以得到产物。 在发酵过程中残存基质和生成产物的分析非常重要,一般用纸层析法进行发酵液的鉴定和分离,纸层析不仅可以进行鉴定,而且可以将分离产物,进一步直接在纸上制备。其它分析方法如硅胶薄板层析、紫外吸收光谱法、高压液相色谱法也常使用。 五、氢化可的松的制备 氢化可的松(Hydrocortisone)又称为皮质醇,化学名称为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-1,20-二酮。其结构式为 CHOH2 CO OHHO O 氢化可的松为白色或几乎白色的结晶性粉末,无臭,初无味,随后有持续的苦味,遇光逐渐变质,略溶于乙醇或丙酮,微溶于氯仿,在乙醚中几乎不溶,不溶于水。熔点为212~222? 0比旋光度为+162~169(1%乙醇)。 氢化可的松为皮质激素类药物,具有影响糖代谢、抗炎、抗毒、抗休克及抗过敏等作用。主要用于肾上腺皮质功能不足和自体免疫性疾病。应用于某些感染的综合治疗。消化性溃疡病、骨质疏松症、精神病、重症高血压患者忌用,充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。由于氢化可的松疗效确切,为重要的甾体激素类药物之一,国内生产的激素类药物中产量最大。 1(反应原理 10 这一步反应是利用梨头霉菌,引入11β-羟基。在产物中,除了氢化可的松(简称β体)(b)外,还产生11α-羟基化合物即表氢可的松(又称为α体)(c)、少量的其它位置的羟基化合物和未转化的化合物S(a)。所以在产品的分离纯化时,以上各种物质必须分离出去。 2(工艺过程 0将梨头霉菌接种到土豆斜面培养基,28C培养7~9d,成熟孢子用无菌生理盐水制成孢子悬液后。种子培养基用葡萄糖、玉米浆、硫酸铵等配制,pH为5.8~6.3,接入孢子悬液后,+ 在通气搅拌下28?培养28~32h。待培养液菌浓度达到35%以上,无杂菌污染,即可转入发酵罐。 将玉米浆、酵母膏、硫酸铵、葡萄糖及水投入发酵罐中搅拌,用氢氧化钠溶液调整物料pH值到5.7~6.3,加入0.03%豆油,灭菌温度120?,通入无菌空气,降温至27~28?,接入 2犁头霉孢子悬浮液,维持罐压0.6kg/cm,控制排气量,通气搅拌发酵28~32小时。用氢氧化钠溶液调pH值到5.5~6.0,投入发酵液体积0.15%的莱氏化合物S,氧化48小时后,取样作比色试验检查反应终点。到达终点后滤除菌丝,滤液用树脂吸附,然后用乙醇洗脱,洗脱液经减压浓缩至适量,冷却到0~10?,过滤、干燥得到粗品,熔点195?,收率46%左右。母液浓缩后,析出结晶主要是表氢可的松(α-体)。以上所得粗品中主要为β体,并混有部分α体,必须要分离精制,可以将粗品加入16~18倍含8%甲醇的二氯乙烷溶液中,加热回流 0使全溶,趁热过滤,滤液冷却至0~5C,冷冻、结晶、过滤、干燥得氢化可的松,熔点202?以上。经纸层析α体:β体=1:8左右,进行下一步精制。精制时可用16倍左右的甲醇或乙醇重结晶,即可以得到精制的氢化可的松,熔点212?以上。图14-8为氢化可的松的生产流 11 程简图。 图14-8 氢化可的松的生产流程简图 生物转化反应,随着菌种、菌株、培养基成分、发酵工艺、投料浓度、接种量等不同,转化率和收率也不相同。国外在氢化可的松的生产中,用新月弯孢霉在玉米浆培养基中将化合物S直接转化成氢化可的松,11β-OH转化率可以达到65~75%,大大高于用犁头霉菌的转化率50%。 12
/
本文档为【氢化可的松发酵】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索