【doc】日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组分抗原分析

【doc】日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组分抗原分析 日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组 分抗原分析 中国血吸虫病防治杂志2005年第l7卷第5期ChinJSchistoControl2005,Vo1.17,No.5?351’ [文章编号]1005—6661(2005)05035105 日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期 诊断组分抗原分析 华万全,许永良,余传信,戴建荣,何伟,曹国群 [摘要]目的寻找具有血吸虫病早期诊断价值的组分抗原.以感染后不同时间的兔血清, 用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和免疫印迹试验(Westernblotting)方法,对日本血吸虫 尾蚴,成虫和虫卵中的可溶性抗原的成分进行免疫分析.结果可溶性尾蚴抗原(SCA)94,48,41,40 kDa和38kDa组分抗原最早出现免疫印迹反应,能被感染后2周兔血清所识别,可被感染后3周兔 血清识别的SCA7l,23kDa组分抗原反应最强.可溶性成虫抗原(AWA)最早出现反应的组分抗原 是7l,58kDa,能被感染后3周兔血清所识别.可溶性虫卵抗原(SEA)最早出现反应的组分抗原是 270,15l,73,69,50kDa和24kDa,能被感染后4周兔血清所识别.结论 SCA94,7l,48,4l,4O,38, 23kDa,AWA7l,58kDa和SEA270,l51,73,69,5O,24kDa能被急性感染 兔血清所识别,是具有潜 在早期诊断价值的组分抗原. [关键词]日本血吸虫病;早期诊断;可溶性尾蚴抗原;可溶性成虫抗原; 可溶性虫卵抗原 [中图分类号]R383.24[文献标识码]A Analysisofearlydiagnosticfractionantigens adultwormsandeggsofSchistosomajaponicum Yongliang,y”Chuanxin,DaiJianrong,HeWei,CaoGuoqun(Jiangsu Diseases.uxi214064.China) ofcercariae, HuaWanquan,Xu InstituteofParasitic [-Abstract]ObjectiveTofindoutthevaluableearlydiagnosticantigenofSchistosomajapon— icum.MethodsTheseraofrabbitswerecollectedatdifferenttimeaftertherabbitswereinfected withcercariaeofSchitosomajaponicum.Thefractionsofthesolublecercariaantigen(SCA),solu— bleadultwormantigen(AWA)andsolubleeggantigen(SEA)wereseparatedb ySDS—PAGEand recognizedbyWesternblottingwithrabbits’seraofdifferenttimeofpost—inf ection.ResultsIn Westernblotting,thebandsof94,48,41,40kDaand38kDaofSCAappearedtheearliestand wererecognizedbytherabbitsseraof2-weekpost—infection,thebandsof71 kDaand23kDaof SCAreactedwiththerabbitsseraof3-weekpost—infectionstrongly.Theban dsof71kDaand58 kDaofAWAappearedtheearliestandwererecognizedbyrabbitsseraof3-weekpost—infection. ThebandsofSEAreactedearliestlytOtherabbitsseraof4一 weekpost—infectionwere270,151,73, 69,50kDaand24kDa.ConclusionThefractionantigensof94,71,48,41,4O,38kDaand23 kDaofSCA,thefractionantigensof71kDaand58kDaofAWAandthefractionantigensof270. 151,73,69,50kDaand24kDaofSEAcouldberecognizedbyseraofacuteinfectedrabbitsand mighthavepotentialearlyimmuno—diagnosisvalueforschistosomiasis. [Keywords~Schistosomiasisjaponica;Earlydiagnosis;Solublecercariaantigen;Solubleadult wormantigen;Solubleeggantigen 日本血吸虫尾蚴,成虫及虫卵可溶性抗原是血 吸虫病免疫诊断的常用检测抗原,其中可溶性尾蚴 [基金项目]江苏省科技厅社会发展项目(No.BS2001061),江苏省 卫生厅资助项目(No.X2113) [作者单位]江苏省血吸虫病防治研究所(无锡214064) [作者简介]华万全(1961).男.大专.副主任医师.研究方向:血 吸虫病诊断 ? 论着? 抗原(SCA)已被证实具有血吸虫病早期诊断价 值,但这些不同发育阶段虫体粗抗原的成分复杂, 在特异性方面不尽人意,因此人们力图从粗抗原中 筛选,纯化出特异的抗原组分,以进一步提高诊断血 吸虫病的特异性及达到区分病程等目的.在以往我 们对虫卵组分抗原的分析研究中[2],通过检测短程 华万全等:日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组分抗原分析 抗体,发现虫卵107kDa和121kDa组分抗原,具有 较好的疗效考核价值.有一些学者已进行了可溶性 成虫抗原(AWA)及可溶性虫卵抗原(SEA)早期诊 断分子的筛选工作j,但对尾蚴组分抗原的分析甚 少.本研究试图对血吸虫尾蚴,成虫和虫卵三大主要 抗原的复杂组分进行全面分析,筛选出特异性的,能 最早检出应答抗体的某些组分抗原,为血吸虫病早 期诊断的现场应用奠定基础. 材料和方法 1血吸虫虫株 为江苏省血吸虫病防治研究所钉螺室长期实验 室传代的江苏株. 2抗原制备 2.1SCA按文献[1]方法制备,蛋白含量为1.5 mg/ml. 2.2AWA从感染1500条日本血吸虫尾蚴 45d的家兔肠系膜和门静脉系统中,用抗凝盐水灌 注下腔静脉方法收集成虫,并将成虫在生理盐水中 洗涤3次以去除宿主组织和血液.将成虫放入研钵 中,加3倍量的生理盐水,冰浴下研磨1h后,14000 r/min4C离心1h,上清液即为AwA,蛋白含量为 7.8mg/ml,分装后保存于一30C以下备用. 2.3SEA以上述获取成虫的家兔肝脏,去除结 缔组织并将肝脏剪成小块后放入组织匀浆器,8000 r/min匀浆3次,每次1min,间隔3min,用1.2冷 盐水冲洗匀浆通过60,80,120孔/25.4mm铜筛过 滤,用280孔/25.4mm尼龙筛绢浓集滤液,以1000 , 1500ml1.2冷盐水洗下尼龙筛绢上的虫卵,再 经160:fL/25.4mm铜筛过滤于三角量杯中进行沉 淀.沉淀物用l0,15ml尖底离心管以2000r/min 的速度离心2min,每次离心后尽量吸去肝组织,如 此3次洗涤沉淀物即可获得较纯净的虫卵.SEA制 备方法与AWA的相同,蛋白含量为8.8mg/ml. 3试验血清 以1500条尾蚴腹部玻片法感染家兔5只,分 别于感染前,感染后2,3,4周和6周,从耳缘静脉采 血并分离血清,一30C以下保存备用.试验时,将同 一 时间收集的5份兔血清进行等量混合. 4SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和蛋白 组分分子量测定 将尾蚴,成虫及虫卵可溶性抗原进行SDS— PAGE,方法参照文献E23.电泳时浓缩胶3.50/,分 离胶10.0,以低分子量标准蛋白质(上海丽珠东 风生物公司产品)为样品对照,使用PROTEAN ?xi大型垂直板电泳仪,浓缩胶120V及分离胶 220V电压下电泳分离SCA,AWA和SEA.为求较 正确地分辨各组分蛋白并计算其分子量,反复进行 多次实验,同时还参照在7.5和12.0不同分离 胶上及以高分子量标准蛋白质(Promega公司)为同 一 样品对照的电泳结果.凝胶染色用考马斯亮蓝法. 按照文献E4]方法,以标准蛋白的相对迁移率为横坐 标,分子量对数值为纵坐标,在半对数纸上绘制出标 准曲线,并求出线性范围内的回归方程,以计算各组 分蛋白的分子量. 5免疫印迹试验(Westernblotting) 将上述分离蛋白的凝胶紧贴于硝酸纤维膜 (NC,0.2m,BIO—RAD公司)上,放人转印槽内,进 行恒电流转印过夜(100mA,4C15h).取出NC 膜,切下标准蛋白样品部分,用0.2丽春红液染 色,其余的用0.3Tween一2O—PBS封闭1h,然后 纵切成0.5cm宽的NC膜长条,编上号码,分别放 入含6ml(1:200稀释)感染不同时间的兔血清的 加盖试管内,置室温摇床上1.5h.用0.05 Tween一20一PBS洗涤3次,每次10rain,加入1:20 稀释的SPA—HRP(上海生物所),室温反应1.5h.洗 涤后用DAB底物显色15rain,用蒸馏水终止反应, 观察结果. 结果 1SCA,AwA和SEA的SDS—PAGE测定 经10SDS—PAGE分离后,SCA组分蛋白以 染色深浅可分主带2O条,次带25条,AwA组分蛋 白主带12条,次带26条,SEA组分蛋白主带14条, 次带25条,3种抗原的电泳带谱和蛋白组分的分子 量分别见图1和1. 从图1可见,SCA,AWA和SEA的许多蛋白组 分大小相似,其相似的分子量区间主要位于73, 69,55,50,44,37kDa和31,29kDa. 2免疫印迹反应 分别将感染后不同时期的兔血清与转印到NC 膜上的SCA,AwA,SEA组分蛋白进行免疫检测, 发现感染后2周的兔血清即可与SCA反应,SCA中 最早出现免疫印迹反应的组分抗原是94,48,41,40 kDa和38kDa,但反应带显色较淡,感染2周后的血 清与SCA反应的蛋白条带逐渐增多且显色逐渐加 深,3周后的血清与71,23kDa条带已呈明显的深 色反应,6周时血清的阳性蛋白印迹带达27条,其 中主要的显色带是200,102,71,53,38kDa和23 kDa(图2,表2). 中同?IL吸虫稿防清占:l5年第】卷第5期ChinJSchistoControl2005,Vo].I7?No5353’ 表1J0t早出现免疫印迹反应的时间是感染后 3周的血清,最早出现免疫反应的纽分抗原是71,58 kDa.与感染后6周血清反应的蛋向印迹带有2l=J条. 并显色反应加深.其中主带是】93,】5l,71,60,58, 34,33kDa和23kDa SEA最早出现免疫印迹反应的时问是感染后4 周的血清,晟早出现免疫反应的组分抗原是270, l5173,69,50kDa和14kI)与感染后6周的血清 反应的蛋白印迹带增至26条,其反应程度均明显比 SCA和AwA的强烈.其中主带是】d,bblts’f 图2SCA,AWASEA的免疫印涟反应分析 nE.2lmmunohlt~tofSCA.AWAandSEAwith infectedrabbits’sera 甜勰卧靶鹦 轴捆蛆??孙孙业 一弛?姐引 川?盯拍 ““ 柏咐舢拈” ?—]! 曩?蠢誉蠢誓一一 叭 舞 M 华万全等:日本血吸虫尾蚴成虫及虫卵的早期诊断组分抗原分析 表2 Table2 感染后不同时间兔血清与SCA,AWA,SEA免疫印迹反应条带的分布 DistributionofimmunobiotbandsofSCA,AWAandSEAreactedwith rabbits’seraindifferenttimeofpost—infection 感染后2周 2-weekpostinfection 感染后3周 3——weekpost—-infection 感染后4周 4-weekpost—infection 感染后6周 6-weekpost—infection 94,48,41,40,38 200,151,94,71,51, 48,41,40,38,37,23 200151947161 53,5,48,45,4, 40,38,37,23 通过对图1,2的比较分析发现,SCA29kDa和 AwA29kDa是很粗的蛋白条带,但这些组分蛋白 的免疫印迹反应并不明显.与此相反,SCA23kDa 蛋白条带较细,而免疫印迹反应很强.从图2可见, SCA,AwA和SEA产生免疫印迹反应相似的组分 抗原区间主要是73,69kDa,且反应也很强. 3对照血清的免疫印迹反应 与感染前兔血清的对照比较中,3种可溶性抗 原的某些组分蛋白也呈显色反应,分别为SCA84 kDa,AWA220,44kDa,SEA220kDa,其中SCA 84kDa显色较浅,并且在未加任何血清而只代之稀 释液PBS的对照比较中,发现这些组分蛋白仍旧能 呈显色反应,证明这些蛋白组分可直接与SPA—HRP 酶标结合物结合. 讨论 本研究通过Westernblotting技术全面比较和 分析了血吸虫尾蚴,成虫,虫卵抗原的蛋白组分的免 疫应答情况,结果表明不同发育阶段血吸虫组分抗 原检出抗体有时间先后现象.SCA的94,48,41,40 kDa和38kDa抗原反应最早,能被感染后2周兔血 清所识别,但反应较弱,SCA的71,23kDa抗原对 感染后3周兔血清的反应很强.AwA出现最早反 应的抗原是71,58kDa,能被感染后3周的兔血清所 识别,SEA最早出现反应的抗原是27O,151,73,69, 50kDa和24kDa,能被感染后4周的兔血清所识 别.随着感染时间的延长,感染兔血清所识别的组分 抗原逐渐增多,免疫印迹反应也逐渐加深,6周时尤 以SEA的反应最强.本研究与其他实验室报道的血 吸虫组分抗原的分子量存在一些差异口,这可能与 虫株,抗原制备和实验条件等不同有关. SPA—HRP和羊抗兔IgG—HRP是常用的酶标 结合物,为了避免羊抗兔IgG—HRP对血吸虫成虫和 虫卵的兔源成分的交叉反应,本实验选用了SPA— HRP,免疫印迹反应的效果是蛋白条带及背景清晰, 有效地减少了非特异性反应,但也可能影响最早时 间检出抗体的敏感性. 本研究发现SCA84kDa,AWA220,44kDa, SEA220kDa蛋白组分,在对感染前兔血清或甚至 无血清的免疫印迹反应时也出现显色反应,表明这 些抗原分子中可能存在能与SPA或HRP相结合的 结构域,从而导致显色反应.因此,在用血吸虫粗抗 原为检测抗原的ELISA等实验中,选择适宜的抗原 和酶结合物浓度,以及设置无一抗的空白对照很关 键,可降低反应本底,提高诊断的特异性.寻找和纯 化既有特异性和敏感性又有早期诊断价值的高效抗 原分子,是血吸虫病免疫诊断研究的方向,为此本研 究提供了初步实验依据. SCA,AwA和SEA蛋白成分极为复杂,其中 有许多共同特点的组分抗原,特别是69,73kDa区 间组分抗原能引起很强的免疫印迹反应,检出抗体 也较早,但也有尽管蛋白含量高而并不引起与感染 后6周兔血清明显反应的组分抗原,如SCA和 AwA的29kDa蛋白,这些可能是逃避宿主免疫作 用的重要组分,而SCA23kDa等含量较少却能引 起较强的免疫印迹反应,这可能是一个很有诊断潜 能的抗原分子,是否与已经报道的有诊断价值的日 本血吸虫23kDa膜蛋白相关有待于进一步研究]. 中国血吸虫病防治杂志2005年第17卷第5期 ChinJSchistoControl2005,Vol?17,No?5’355’ [参考文献] [1]华万全.朱荫昌,何伟,等.日本血吸虫可溶性尾蚴抗原早期诊 断价值的研究EJ].中国血吸虫病防治杂志,2002,14(6):439 441. [2]华万全,朱荫昌,何伟.等.日本血吸虫虫卵组分抗原的分析 EJ].中国血吸虫病防治杂志,1996,8(5):274276. [33周晓红,陈晓光,冯明钊,等.日本血吸虫成虫及虫卵可溶性抗原 的早期诊断分子筛选[J].寄生虫与医学昆虫,2000,7(1): 24—29. E4]李允鹤.寄生虫免疫学及免疫诊断[M].南京:江苏科学技术出 版社,1991.416—417. [5]余传信,朱荫昌,殷旭仁,等.重组GST—HD融合蛋白用于血吸虫 病诊断和疗效考核的研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2001,13 (2):82—85. [收稿日期]2005—04—26[编辑]陶波 =:__.…:………:=…一__I:;=.__=__t=_..…j_..i!i※.;_iiiii!i!!i [文章编号]1005—6661(2005)050355—01?防治经验? 大山区急性血吸虫病误诊原因探讨 Thinkingaboutmisdiagnosisofacuteschistosomiasisinmountainousareas 胡孝勇 [中图分类号]R532.21[文献标识码]B 西昌市是四川省大山区血吸虫病重流行区.在每年发生 的急性血吸虫病(急血)患者中.有部分病例因各种原因被误 诊为其他感染性疾病而贻误病情.现对本站1991,2004年 收治的54例误诊急血病例资料进行整理,并分析其误诊原 因,以探讨寻求减少或避免急血误诊的有效办法. 1病例分析 1.1一般资料54例急血病例中.男4O例,女14例,男女 之比为2.86:1.年龄最大为48岁,最小为3岁.3,2O岁4O 例,占74.O7,21,48岁14例,占25.93.其中学生37例 占68.52.54例来自疫区,均有疫水接触史.学龄前儿童和 学生多以游泳,嬉水,摸鱼捞虾方式接触疫水感染,农民多以 生产,生活接触疫水感染.发病月份多数集中在4,10月,共 45例占83.33. 1.2主要症状体征54例均以无明显诱因而出现不规则 发热,多数以午后为甚,艮寒,多汗为首发症状.同时伴有不 同程度的纳差,乏力,咳嗽,头昏,头痛,腹痛,腹泻,皮疹等. 其中有脓血便10例,占18.52;肝肿大8例,占14.81;脾 肿大6例,占11.11;腹水1例,占1.85;WBC异常3O 例,占55.56,最高达68.4×10./L;嗜酸粒细胞异常37例, 占68.52,最高达63.OO;HBsAg阳性2例,占3.700A. 2误诊情况 54例患者均以发热,畏寒,出汗为首发主症而就医,体温 最高为41C.38,41(,者为36例,占66.67,发热时间最 长60d,最短7d,平均为21d,误诊时间最长2月余,最短 7d.部分病例来本站就诊身体已很虚弱,j4例在当地医疗 站,区,乡卫生院和州,市综合医院均初诊误诊为其他感染性 疾病,采取抗生素,抗病毒治疗,少数病例用过糖皮质激素. 均无效而来本站就诊.其中被误诊为钩端螺旋体病1例.败 血症2例,肝脓肿1例,支气管炎1例.冈发热体温高,咳嗽, 扁桃体肿大,咽充血,血象高,腹泻大便带脓血等而被误诊为 扁桃体炎,伤寒,肠炎,上呼吸道感染,结核病等其他感 [作者单位]四川省西昌市血吸虫病防治站(西昌615000) 染性疾病49例.54例来本站就诊时,询问病史均来自疫区, 均有疫水接触史.经病原学检查粪检阳性而确诊为急血,其 中粪孵阳性38例,大便常规镜检查见血吸虫虫卵16例. 3讨论 通过急血误诊情况的综合分析可见,误诊的原因主要为 医,患双方及社会环境因素三大方面.急血患者来自流行区, 又有疫水接触史,当出现发热等急血症状就医时忽略了急血 的可能,未到血防站作相关检查;同时患者在其他医院就医 时未向初诊医生说明自己来自疫区,常有疫水接触史这一重 要病史.各级医疗机构人员对急血的相关知识缺乏全面的了 解,加之病史询问不详,未作急血的相关检查而盲目诊断为 其他发热性疾病造成误诊.由于山区的文化,经济较落后,疫 区人群受教育水平较低,对疾病与健康的意识较淡薄,对血 吸虫病的危害认识不足.据此,笔者认为针对这三大主要因 素可采取以下:?因血吸虫病是一种地区性,行为性寄 生虫病,故在流行区工作的各级医务人员应对本病的相关知 识有一个全面的了解,每年定期由血防专业人员对乡,村, 区,州,市医院的医务人员及检验人员进行血吸虫病知识的 全面系统,使其掌握急血的诊断及鉴别诊断要点.尤其 要重视病史的详细询问,可向各级医疗机构发放血吸虫病防 治知识手册.在急血的高发季节4,10月,开展广泛深入 的血防知识健康教育活动,在中校加设血防知识课程, 利用图片,电视,广播,咨询等多种形式宣传普及血防知识, 使疫区人群了解急血的常见症状体征和急血对人体的严重 危害,当出现发热等症状就医时主动提供疫水接触史.?因 急血的临床症状轻重不一,错综复杂.又无特异性的临床表 现,易与其他发热性疾病相混淆,加之大山区血吸虫病具有 高感染率低感染度的特征,在急血早期粪便中可找不到血吸 虫卯或毛蚴,并且粪检又有一定的漏检情况,故建议各级医 疗机构对初诊来自疫区的发热病人应作常规大便镜检2次 以上,作粪孵也应在2次以上.并且进行血吸虫免疫学检查, 同时作B超检查肝脾,以达到早期确诊. [收稿日期]200506—20[编辑]杭盘宇