及功能矫形前伸下颌后大鼠浅层嚼肌兴奋收缩单元表达变化的实验

及功能矫形前伸下颌后大鼠浅层嚼肌兴奋收缩单元表达变化的实验 曹,,,,,, 学校代?,, ,,,】, ( 学 号:,,,,,,, 四川大学 口腔医学博士专业学位论文 力学刺激体外培养颌面肌细胞及 功能矫形前伸下颔后大鼠浅层嚼肌 题目 墨查二些塑星垄垂姿壅些盟塞墅壁窒 作 者 是勇 专 业 ～壁坚盎堕芏 指导教,师姓名 罗颂椒教授 ,,五年旧月二,六, 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别中以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名: 芬、融 ?、,，, 导师签名:弩以哥致 , 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解四川大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权四川大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位学位论文作者签名: 累岛 导师签名 ,私袭仪签字日期:新年妒月,,日 签字同期 护手年年月谚日学位论文作者毕业后去向:工作单位:上海市第九人民医院颌面外科联系方式 ,,,,,,,,,,,,(;,,,通讯地址:上海市制造局路,,,号 邮政编码 ,,,,,, 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 英文缩略词表缩略词 英丈全名 中文译名,,, ;,,,,,,, ,,;,,,,,,,(;,,,,,;,,,, ;,,,,,,, 兴奋一收缩偶联,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,, 二氢吡啶受体,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,, 雷诺丁受体,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 聚台酶链反应,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,,, 焦碳酸二乙酯,(, ,,,, ,,;,,,,,,,(;,,,,,;,,,, ,,,, 兴奋一收缩单元,,,,, ,,,;,,,,,,,,,(,一,,,,,,,,, ,一磷酸甘油醛脱氢酶 ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,,, 十二烷基硫酸钠,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, 牛血清白蛋白 ,, ,,,;,,,,,, 肌膜,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,, ,,肌膜与肌浆网连接处 ,,,;,,,,,, 的部位 ,, ,,,;,,,,,,,; ,,,,;,,,, 肌浆网 ,,,;,,,,,, ,,,,,,, ,,肌浆网与肌膜连接处 ,,, ,,,?,,,,,,,,; ,,,,;,,,, 的部位 ,，,, ;,,;,,,—,,,,;,, ;,,;,,, ,,,,,,, ,,,，诱导的;,，释放 ，,,, ,,,,,,,, ,，,，,(,,,,,,,,,,,,,肌醇一,，,，,一三磷酸受体 ,,;,,,,„ ,,, ,,,,,,,,,, 钙调蛋白 ,,;娘 ,,;,,,,,; ,;,,,,;,,,,,, ,,;,,,,, 烟碱样乙酰胆碱受体 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 力学刺激体外培养颌面肌细胞及功能矫形前伸下颌后 大鼠浅层嚼肌兴奋一收缩单元变化的实验研究 博士研究生: 吴勇 导 师: 罗颂椒教授 赵志河教授 中文摘要 在正畸功能矫形治疗中，“力”的使用无处不在，“力”的神奇充斥着整个过程。功能矫治器本身不产生任何机械力，而是通过改变下颌姿势位所引起的肌力改变发生作用。颌面骨骼肌是矫治力的主要介质，嚼肌则是人体参与功能矫形 治疗的主要肌肉。在矫治过程中，嚼肌的张力、收缩状态、兴奋性都发生了适应性变化。二氢吡啶受体(,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,，,,,,,)和,,,,,,,,,受体(,,,,,,,,, ,,;,,,,,,，,,，,,)是骨骼肌兴奋一收缩偶联的分子基础，作为肌膜和肌浆网,,,，通道结构蛋白，是骨骼肌细胞肌膜和肌浆网信号传导，引发兴奋一收缩偶联最关键的一对受体，称之为兴奋一收缩单元。研究力学刺激对颌面骨骼肌,,,,,和,,,,表达的影响，对于阐明功能矫形中矫治力的传导以及颌面骨骼肌适应性改建的分子机制具有重要意义。 目的:构建体外培养颌面骨骼肌成肌细胞一力学刺激模型和功能矫形前伸大鼠下颌动物模型，从在体实验和体外实验两个角度，观察力学刺激体外培养的面颌肌细胞及功能矫治前伸下颌后,,大鼠浅层嚼肌,,,,,的功能亚基一?,亚基和,,,,表达水平的变化，对骨骼肌改建机制进行初 四川大学华西口腔医学院博士学位论文步探讨，为,临床研究提供理论依据。 方法:(,)采用,,,,法，取材出生后,,,天纯种,,大,，,,鼠，用机械分离和酶消 获取乳鼠颌面骨骼肌成肌细胞，进行体外培养、鉴定。采用,,,;,,化法分离 四点弯曲加力装置(专利号:,,,,,,,,,,)，以培养的成肌细胞为研究对象构建肌细胞体外培养一力学刺激模型，分别施加,,、,,、,,、,,,、,,,，,,,, , ,,,,,,，,(,,,的张应力刺激后，收集细胞，运用荧光定量,,,技术测定成肌细胞,,,, ,。亚基和,,,, ,,,,变化量。 (,)选择,,,周的雄性青春期,,大鼠为实验动物，用可摘式上颌斜面导板功能矫治器前伸大鼠下颌，建立动物模型。分别在矫治第,、,,、,,、,,天处死动物，取浅层嚼肌，运用荧光定量,,,技术测定,,,, ,。亚基和,,,, ,,,,表达变化，,,,,,,, ,,,,技术检测,,,, ？。亚基蛋白表达变化。 结果:(,)实验培养的,,大鼠颌面骨骼肌成肌细胞可以贴附于加力板上生长，细胞的形态正常，活力良好。成肌细胞,,,, , ,基因和,,,基因在,,,, , ,,,,,,、,(,,,、不同持续时间的周期性张应力刺激后其表达量变化没有统计学意义。各实验组均数都小于,，即备组加力样本与对照样本的差值为负，所含,,,,拷贝数小于对照样本，可以认为成肌细胞,,,,, ,基因和,,,基因在,,,,, ,,,,,,、,(,,,、不同持续时间的周期性张应力刺激后其表达量可能呈降低趋势。(,)动物实验研究发现，戴用矫治器后第,,天大鼠浅层嚼肌,,,,, ,。亚基在基因和蛋白水平表达都增加，第,,天恢复到对照组水平，,,,,基因表达水平在第,天有所增高，第,,天恢复到对照水平，两种受体都没有出现表达下调现象。两种受体的基因表达变化在时相上不一致。 结论:(,)体外培养的成肌细胞,,,,,和,,,,的变化很可能不是周期性张应力作用下细胞内,,,，浓度改变的主要原因。(,)在前伸,,大 四川大学华西口腔医学院博士学位论文鼠下颌的动物实验研究中，,,,, ,。亚基和,,,,基因表达水平和,,,,,,亚基的蛋白表达水平都发生了适应性变化，说明,(,单元的两种分子参与了功能矫形骨骼肌改建的过程，动物实验和体外实验的结果不一致，神经调节的缺如和体液环境的差别可能是体外实验中基因对应力刺激不敏感的主要原因。其变化规律也不同于能够导致骨骼肌损伤的异常牵张训练实验，可能和功能矫治过程使用轻力和间断力相关。 本研究提示:神经和体液支持是骨骼肌完成适应性改建的必要条件。在正畸临床功能矫形治疗过 程中应使用柔和的力量，对于下颌后缩较多的患者，应该分步前导;同时，使用间断力也有利于肌肉组织在改建过程中的健康。 关键词:,,,,,,,,,,,,,,,受体;,,,,,,,,,受体;功能矫形前伸下颌:张应力刺激;面颌肌细胞 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,,,,,,, ,, , , ,,,,,,,, , , , ,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,, ,,;， ,;—,,,,,,—，,,,,,;,，,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,;,,,,, ,, ,, ,, ,,, ,,,,,,,,,: ,, ,,,, ,,,,, :,,,,(,,, ,,,,, ,,, ,,,,(,,,, ,,,,, ,,,,,,;, ,,,;,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,; 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,,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,;,,,,、析,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,(,,, ,,,,,;, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,, ,, ,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,, ,, ;,;,,; ,,,,,,(,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,, ;,,,;,,,,,,,, ,;;,,,,,; ;,,,,,;,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,, ,,,;,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,;,, ,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,,,;, ,,,, , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,( ,,, ,,,,, ;,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,; ,,，,,,;, ,,,,,,,,,,;, ,,,,,,, ,,,;,, ,,,,,,，,,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,,,,, ,, ,, ,,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,;,,,,,,;,,,, ,,,,,;,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,, ;,,,, ，， ,,,,;;,,,,,,, ,, ,,,,(，, ,,,,,,,,,,, ,,;;,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,,？,,, ;,,,,,,,,( ,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,;,,,,,,,,, ,,;,,,,,:,,,,,,;,,,,,,,;,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,,,:,,,,,,,, ,,,,,;,,,,, , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 前 言 功能矫形治疗是临床用于矫治下颌后缩的轻中度骨性，，类错验儿童和青少年患者常用的矫治技术，实践证明可获得良好的矫治效果。功能矫治器不同于其它常规矫治器，它本身不产生任何机械力，而是通过改变下颌姿势位所引起的肌力改变而发生作用。颌面骨骼肌是矫治力的主要介质，嚼肌则是人体参与功能矫形治疗的主要肌肉。 面颌部肌肉属于骨骼肌，具有骨骼肌的特点。骨骼肌可塑性较强，其结构和功能可以随外界刺激的改变而发生适应性改建。成肌细胞是骨骼肌成熟肌纤维的前体细胞，也是适应性改建的主要体现者。肌细胞感觉和转导各种刺激信号，刺激特异基因的表达【,,，调控肌纤维整合的一系列反应，从而使细胞的结构成份以及细胞外与肌纤维有关的结构(神经、血管)口峻生相应的结构一功能适应性改建，这是功能矫形力在临床得以应用的重要理论基础。 兴奋一收缩偶联(,,;,,,,,,,—;,,,,,;,,,, ;,,,,,,,，,—, ;,,,,,,,)是骨骼肌最重要的生理功能【,】。以往研究表明，在功能矫形力的作用下，面颌肌细胞兴奋性【,,和收缩特性，,,都发生了适应性改建。二氢吡啶受体 (,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,(,,,,,)和,,,,,,,,,受体(,,,,,,,,,,,;,,,,,,，,,,,)作为肌膜和肌浆网,,,，通道结构蛋白，是骨骼肌细胞肌膜和肌浆网信号传导，引发兴奋一收缩偶联最关键的一对受体，两者合称为兴奋一收缩单元，是骨骼肌兴奋一收缩偶联的分子基础。 体外培养肌细胞(力学刺激实验证实，与,,,,,和,,,,极为相关的细胞内;,，水平在周期性张应力刺激下发生了改变〔,,。骨骼肌持续牵张、收缩„,,及骨骼肌损伤性异常牵张训练【,,的动物实验中也发现，,,,,,和,,,,的,,,,表达水平发生了显著改变。 , 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 功能矫形治疗过程中，颌面骨骼肌在作用力值、作用周期和作用方式方面都不同于持续牵张和持续松弛，亦不同于损伤性异常牵张训，练。可以推测，研究功能矫形治疗过程中，力学刺激对颌面骨骼肌,,,,,和,,,,表达的影响，对于阐明功能矫形中矫治力的传导以及颌面骨骼肌适应性改建的分子机制具有重要意义。在这方面的研究国内外尚未见报道。 本研究拟构建体外培养颌面骨骼肌成肌细胞一力学刺激模型和功能矫形前伸大鼠下颌动物模型，从在体实验和体外实验两个角度，通过实时定量,,,和,,,,,, ,,,,等实验技术，观察力学刺激体外培养颌面肌细胞及功能矫形前伸下颌后大鼠浅层嚼肌,,,,,的功能亚基一,,亚基和,,,,表达水 平的变化规律，以更好地阐明临床正畸功能矫形治疗中骨骼肌改建的机理。本研究分为两个部分:论文一周期性张应力对面颌肌细胞二氢吡啶受体,?,亚基和,,,,,,,,,受 体,,,,表达影响的体外实验研究论文二功能矫形前伸下颌后大鼠浅?憬兰《 膺拎な芴澹幔煅腔 恚遥危?和蛋白表达变化及,,,,,,,,,受体,,,,表达变化的动物实验研 究 ,, 四川大学华西口腔医学院博士学位论文论文一周期性张应力对面颌肌细胞二氢吡啶受体,,亚基和,,,,,, , ,,,受体,,,,表达影响的体外实验研究 对处于生长期的儿童和青少年功能性和轻中度骨性错合畸形患者，临床常常通过矫治器将矫治力以及面颌部肌肉收缩产生的力学信号传递到牙、牙弓及颌骨等需要矫治的部位，使牙颌形态发生改建，同时向中枢传递『,确的信息，纠正异常信号的偏差，使功能过度或功能不足的肌肉恢复正常，引导生长期的儿童和青少年口颌系统正常生长发育, ,,。大量研究证明，青春期大鼠功能矫形治疗后下颌支和髁突等硬组织发生了广泛的改建【,,,，但是这种改建是有限的，其改建量常常达不到功能矫形治疗中下颌前移的矫治要求【”】，因此可以说，神经肌肉功能改变是下颌近中移位的主要机制。 面颌部肌肉属于骨骼肌，兴奋一收缩偶联(,,;,,,,,,,,;,,,,,;,,,,;,,,,,,,，,,, ;,,,,,,,)是其最重要的生理功能【,】,研究表明，在功能矫形力的作用下，面颌肌细胞在神经肌接头〔,,,,,】、细胞兴奋性„,,、;矿循环〔,】、细胞收缩特性【,,等方面都发生了适应性改建，这些方面都与骨骼肌兴奋一收缩偶联密切相关。 骨骼肌兴奋(收缩的初始信号是肌膜的去极化，由肌膜上的电压感受器感知，向内传导到肌浆网，导致肌浆网内,,,，的释放，胞浆内,,,，浓度升高，引起一次肌肉收缩〔,，,,】。在此过程中，二氢毗啶受体(,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,(,,,,,)和,,,,,,,,,受体(,,,,,,,,, ,,;,,,,,,，,,,,)起了感知、传导信号的作用，并作为肌膜和肌浆网;,,十通道结构蛋白，参与;,,，循环，是骨骼肌细胞肌膜和肌浆网信号得以传导并引发兴奋一收缩偶 四川大学华西口腔医学院博士学位论文一 —————————————————————————————————————————————————————————————————————一联最关键的一对受体，称为兴奋一收缩单元(,,;,,,,,,,(;,,,,,;,,,, ,,,,,，,(, ,,,,,)。 ,,,,,是肌膜上的二氢吡啶敏感性慢激活;,,，通道(,型一;,,，通道)，由,,、,【,、,、丫、,五个亚基构成,,】，其中,(,亚基分子量为,,,,,，是其主要的功能单元。口,亚基是,型,,,,,，通道形成蛋白，电压感受器，二氢吡啶的结合部位〔,,之,】，而且是和,,,,相互作用的主要功能蛋白。,,,,的主要功能是作为肌浆网上的;,,，通道，和,管上的,,,,,分子相互作用。接收由,,,,,传来的信息，打开或者关闭通道，完成肌浆网中;,,十的释放，使胞浆内,,,，浓度迅速升高，达到引起肌肉收缩的浓度，是肌纤维;,,，循环的重要环节〔,,。 由以上可知，功能矫形过程中，骨骼肌的兴奋性和收缩性都发生了显著变化，而,,;单元是和骨骼肌兴奋一收缩密切相关的，于是给我们提出了疑问，功能矫治过程中，骨骼肌发生改建，,,,单元的两种蛋白在其中扮演了什么角色,在这方面的研究国内外尚未见报道。 本实验拟用四点弯曲细胞加力装置对体外培养 的面颌肌细胞施加周期性张应力，研究周期性张应力对面颌肌细胞,,,,,和,,,, ,,,,表达的影响，以探讨在功能矫形力的作用下,,,单元的两种蛋白在颌面部肌肉适应性改建中的作用。 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,面颌肌细胞体外培养,(,实验材料及设备,(,(,实验材料 实验动物:出生后,,,天纯种,,大鼠(四川大学实验动物中心提供，动物等级二级，质量合格证:川实动管质第,,,号) 试剂 公司 产地 ，型胶原酶 ,,,,,公司 美国 胰蛋白酶 ,,,,,公司 美国 ,,多聚赖氨酸 ,,,,,公司 美国 小牛血清 哈里生物工程有限公司 成都 ,,,培养基 ,,,;,公司 美国 鼠抗,,,,,, ,,,,,公司 美国 ,,试剂盒 ,,,,,公司 美国 ,,,试剂盒 搏士德公司 武汉 增殖培养基:,,,,,,,,培养基，加入,,,,,,,青霉素、,,,,,,, 链霉素，,,,小牛血清，,,的鸡胚提取液，,,值 ,(, 生长培养基:,,,,,,,,培养基，加入,,,,,,,青霉素、,,,,,,, 链霉素，,,,小牛血清，,,的鸡胚提取液，,,值 ,,, 分化培养基:,,,,,,,,培养基，加入,,,,,,,青霉素、,,,,,,, 链霉素，,,小牛血清，,,的鸡胚提取液，,,值,(, 其他培养液:,(,,,,?,液 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,(,(,实验设备 ,,,孵箱(,,,,, ,,,,,,,,) 离心机(北京医用离心机厂,,,,(,离心机) 倒置相差显微镜及照相系统(,,,,,,, ，,,,， 日本) 细胞加力板:以聚苯乙烯组织培养瓶(,,,,,,公司， 美国)的瓶 璧切割成, , ,(,;,,的加力板。,(, ,,大鼠颌面部骨骼肌的培养 本实验采用,,,,法„,，,”，用出生,,,,的,,大鼠乳鼠进行颌面部骨骼肌的原代培养。出生,,,,的,,大鼠乳鼠原代培养的成肌细胞活力较好，随着出生后天数的增多，培养难度加大。,(,(,原代细胞的分离与纯化 (,)选用出生后,,,天,,大鼠,,只，体重分别,,,,, ,，雌雄不限.