黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究

黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 摘 要 本实验以黑果腺肋花楸茎尖为组培，研究不同消毒剂和不同处理时间对茎尖消毒效果的影响，使污染降低，提高组织培养的诱导率。本实验分别用浓度为0.1%氯化汞和8%次氯酸钠对黑果腺肋花楸茎尖进行不同时间的消毒处理，然后根据不同消毒剂和不同处理时间对茎尖诱导不定芽进行比较，把诱导率和污染率作为评价指标。结果表明:用8%的次氯酸钠对茎尖进行消毒15min，得苗情况是90%，污染情况为6.67%，褐化情况为3.33%，效果最好;用0.1%氯化汞对茎尖进行消毒6min，得苗情况是3.33%，污染情况为86.67%，褐化情况为10%，效果最差。 关键词:黑果腺肋花楸;茎尖;消毒方法;比较研究 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 THE ROSACEAE PLANT BLACK CHOKEBERRY SHOOT TIP CULTURE COMPARISON OF DIFFERENT METHODS OF STERILIZATION ABSTRACT The thesis is based on the Rosaceae plant black chokeberry shoot tip as the experimental materials of in use after the different disinfection methods of Sorbus pohuashanensis stem tip regeneration. Sterilization of explants in tissue culture is a very important link, this experiment respectively with 0.1% mercuric chloride and 8% sodium hypochlorite of Sorbus pohuashanensis stem apex for the disinfection of the treatment of different treatment depending on the time of disinfectants and shoot tip induce adventitious buds were compared to induce rate and contamination rate as the evaluation index. Test results show that: with 8% sodium hypochlorite disinfection immersion 15min, The survival rate of shoot tips was 90%, and the pollution was 6.67%, and with the 3.33% browning case, this way was the best results; with 0.1% mercuric chloride were explants disinfection 6min, the survival rate of shoot tips was 3.33%, and the pollution was 86.67%, and browning the case of 10%, this was the worst one. Key words: Aronia melanocarpa Elliot; stem tip; disinfection method; comparative study 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 目 录 1 前 言 ...................................................................................................................................... 1 1.1 花楸的介绍及概述 ........................................................................................................... 1 1.1.1 生物学习性 ............................................................................................................ 1 1.1.1 生态学特性 ............................................................................................................ 1 1.2 观赏价值和市场价值 .............................................................................................. 2 1. 1.1.3 黑果腺肋花楸栽培现状........................................................................................... 2 1.2 花楸茎尖培养中的常见的消毒方法................................................................................... 3 1.2.1乙醇 ....................................................................................................................... 3 1.2.2 氯化汞 ................................................................................................................... 3 1.2.3次氯酸钠 ................................................................................................................ 3 1.2.4漂白粉 .................................................................................................................... 4 2.5次氯酸钙 ................................................................................................................ 4 1. 1.3 本实验的目的及意义........................................................................................................ 4 2 材料与方法 ............................................................................................................................... 5 1 实验材料 ......................................................................................................................... 5 2. 2.2 实验药品 ......................................................................................................................... 5 2.3 实验仪器 ......................................................................................................................... 6 2.4 实验方法 ......................................................................................................................... 6 4.1 无菌茎尖的获得 ..................................................................................................... 6 2. 2.4.2 培养基的制备......................................................................................................... 7 2.4.3 无菌室及培养基的灭菌........................................................................................... 8 2.4.4 培养步骤................................................................................................................ 9 2.4.5 培养条件................................................................................................................ 9 2.4.6测定方法 ...............................................................................................................10 3 结果与 .............................................................................................................................. 11 3.1 次氯酸钠不同消毒时间对茎尖生长发育的影响 ................................................................ 11 3.2 氯化汞不同消毒时间对茎尖生长发育的影响.................................................................... 11 3.3 不同剂和不同消毒处理时间对茎尖生长发育的影响 .........................................................12 4 结 论 .....................................................................................................................................13 参考文献 .....................................................................................................................................14 致 谢 .........................................................................................................................................15 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 1 前 言 1.1 花楸的介绍及概述 1.1.1 生物学习性 黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpaelliot)，又称不老莓、野生莓，它是植物界被子植物门，蔷薇科，花楸属的腺肋花楸，落叶灌木。树高1.5~3m，球形或丛状树形，树高与冠径大约相同。具有浅根性，叶互生的特点。花期20天，花序是复伞房，花颜色为 [1]白色的完全花。黑果腺肋花楸的花芽是混合芽，顶芽和侧芽均可结出果实，花属两性花。光滑的树皮，皮孔圆形，灰色。浅根性的根系属，水平根具有很发达的特性，主根 [2]分布在30~40cm 的土层中。果实为浆果，味道甜酸略涩，暗红色果肉，1.5cm左右直径，在无霜期较短的寒冷地区，整个冬天果实可宿存树上，是珍贵的观赏树种。黑果腺助花楸是喜光植物，同时具有很强的抵寒、抗旱性，即使极限低温-40?以上，降水量 [3]仅仅400 mm以上的不良条件下也能正常生长。 1.1.1 生态学特性 花楸为中生落叶阔叶灌木，性喜湿润土壤，耐湿冷环境，也能耐干燥瘠薄的土壤环境，多沿着溪涧山谷的阴坡生长。 我国的东北黑龙江省老爷岭、小兴安岭及完达山地区为主要分布地区;另外，东北地区的辽宁省和吉林省及华北各省也有很多分布。此外，在俄罗斯的远东地区和朝鲜北部也有不多数量的分布，常常生长在海拔比较高的山谷杂木林内、山地暗针叶林内，以及林缘、山路旁和河岸等地，其状态呈单株散生。我国东北地区的优质花楸树种作为城市良好的绿化树种，邻国日本引进进行栽培，并且在东京、大坂等地区有着很好的发育 [4]情况。 第 1 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 1.1.2 观赏价值和市场价值 花楸具有挺拔美观的树干，春发新芽，郁郁葱葱，枝秀叶美。夏天青青绿叶，花白如雪，令人着迷。入秋红黄相间的果实与它的绿叶相配，多种色彩互相映照。晚秋叶片色彩斑斓，或黄、或红、或粉、或紫，更加凸显出果实的红艳。冬天枝脱叶落，挺拔俊朗的身姿上挂满了红红的果实。花楸是一种优良的观赏型树种，所以在园林种植，城市 [5]美化绿化等多方面是优选的树种。 花楸的果实当中有丰富的维生素，一克果实含有胡萝卜素8毫克，维生素C 40~150毫克，另外果实中含有丰富的柠檬酸和糖等，可以制成美味可口的食用产品，例如果酱、 [6]果醋、果酒、果汁、果冻、蜜饯、干粉等。也可以制作含有维生素的粮果馅和巧克力，所以花楸食用价值还是不错的。同时花楸的根、果实、种子等可以入药，有止咳化痰，调理脾胃之功效，树皮制成的药剂可用于腹泄的治疗，浆果中的成分可以提炼漱口药的配方，也可用于扁桃体炎的治疗。还可以治疗肺结核、慢性支气管炎等多种身体疾病， [7]在医药用途方面前景广阔。另外，花楸树因为其有着细腻坚硬的材质，常用作家具的 [8-9]制作，农民也常把它用来做农用工具。 1.1.3 黑果腺肋花楸栽培现状 黑果腺肋花楸原产地位于美国东北部，波罗的海沿岸至太平洋沿岸也皆有生长，在欧洲的引种栽培历史已百余年。欧美的保加利亚、加拿大和亚洲地区的朝鲜、日本都有引进栽培种植。1946~1947年，前苏联的黑果花楸全境普及，在之后的10~20年间，黑 [10]果腺肋花楸迅速推广，总种植面积达到了9000公顷以上。在将近20年的时间里，全球腺肋花楸的栽种范围也在逐步的增长。欧洲部分国家例如匈牙利、波兰、乌克兰等国已经有了较大范围的栽培和比较稳定的加工产业，此外，在斯洛伐克和捷克等国也有较大的栽种面积。 我国引进黑果腺肋花楸的经济树种近30年时间。1989年，辽宁省第一次从邻国朝鲜引进一个品种用于干旱地区造林研究，这开启了我国研究及利用黑果腺肋花楸的新篇章。1998年，在俄罗斯选择一个品种并引进;2001年，国家林业局的“948”项目——“腺肋花楸优良种质资源及栽培与利用技术引进”由辽宁省干旱地区造林研究所承担发展，引进的腺肋花楸优良品种15个中包括了8个黑果腺肋花楸优良品种，2005年，该项目通过验收，在国内为进一步开发及利用黑果腺肋花楸打下了坚实的基础;2008 年， 第 2 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 山西省桑干河杨树丰产林实验局在太原地区也开始了对黑果腺肋花楸引种栽培的探究 [11] ;2010年，辽宁省鞍山市岫岩林业科学研究所在岫岩地区建了一个66.7公顷的示范基地，进行黑果腺肋花楸的大量栽植。截止目前，我国有大约12个省(直辖市)种植了黑果腺肋花楸树种。 黑果腺肋花楸的栽植培育在我国尚处于伊始阶段，这些品种具有适应性强、产量高、果实品质高及观赏性好的特点，不仅能满足园林绿化又能进行区域栽培而且果实还可以 [3]加工成食品，为我国丰富的良种选育和遗传资源奠定了丰富的基础 。 1.2 花楸茎尖培养中的常见的消毒方法 由于灭菌药剂种类不同，所以各种药剂的杀菌力也有差异。所以在选择不同的药剂对外植体进行杀菌时也要考虑浓度和处理时间。常见的消毒剂有以下几种。 1.2.1乙醇 乙醇的杀菌能力较好，也有很强的组织穿透力。它可以对实验材料气泡内的空气进行杀菌，也能够使材料湿润，为渗入其他消毒剂提供便利，做到既能杀菌又能湿润的双重功效。可乙醇消毒的时间不适太久，浸泡30~60s便能达到表面灭菌，但灭菌不是很彻底，所以还需要其他杀菌剂的灭菌。 1.2.2 氯化汞 一种对人和动物毒性巨大的重金属化合物。常用浓度为0.1%，处理时间为5~15min，杀菌效果较好，但是残余的毒性较大。茎尖灭菌过后，要用无菌水冲洗几次。 1.2.3次氯酸钠 次氯酸钠，钠的次氯酸盐，强氧化剂。次氯酸钠有很好的杀菌效果，也很方便去除，而且对植物造不成伤害。但因为次氯酸钠会随着时间的流逝而逐渐分解，所以在使用时应该新鲜配置，避光、避热、密封保存。 第 3 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 1.2.4漂白粉 漂白粉是一种具有低毒性质的消毒剂，为白色至灰白色的粉末或颗粒，通常情况下含少量的次氯酸钙，使用时大约用10%的浓度，或者称取饱和溶液的上清液，浸泡10~30min，杀菌功效比较好，而且对茎尖伤害较小，容易洗净。漂白粉应密封储存，现用现配。 1.2.5次氯酸钙 较好能溶于水的粉末状固体，溶于水之后，等澄清后选取上层清液对材料消毒，一般使用的消毒浓度是35~100g/L，大约15min的消毒时间。但是次氯酸钙比次氯酸钠进入植物组织内的时间慢很多，而且易潮解，存储的时间有一定限制，不适选择。 一般采用消毒后容易除去的消毒剂，如果清除不净，会对植物组织有伤害，不利于发育生长。大部分实验会选择氯化汞消毒处理黑果腺肋花楸或者次氯酸钠对黑果腺肋花楸进行消毒灭菌，但目前没有对二者作为消毒方法的结果做比较研究。所以本实验就以氯化汞和次氯酸钠的消毒方法进行比较，观察更适合黑果腺肋花楸茎尖在组织培养中消毒处理的方法。 1.3 本实验的目的及意义 在组培的整个过程中，促发实验材料污染的原因是多方面的，其中实验所用材料的消毒环节是整个过程中最关键的。消毒是否彻底，是否到达预期效果，直接对组织培养能否诱导出苗的结果造成影响，所以，在开始做组培的实验时，就要考虑选择使用哪种消毒方法。消毒剂的选择不仅能杀灭植物茎尖上的病菌，又能很容易的自行分解掉或者用蒸馏水清洗干净，而不会对花楸茎尖造成一点损伤，影响它的生长发育。 本实验通过采用不同消毒剂和不同的消毒处理时间对黑果腺肋花楸茎尖进行外植体消毒，使得在黑果腺肋花楸茎尖的组织培养过程中，明确不同消毒方法对茎尖消毒的影响，对其生长发育的差异，从而选择最佳的消毒剂和最佳的消毒处理时间，为今后黑果腺肋花楸组织培养中外植体消毒方法的选择节省了时间，也提供了技术参考。 第 4 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 2 材料与方法 2.1 实验材料 实验材料取自于海城实验园基地。取自一年生生长健壮、树干树姿优良、色泽好、 无病虫害的黑果腺肋花楸枝条，将材料取回后，用自来水冲洗，洗去附着在其表面的泥 土，然后把枝条剪成50cm左右的长度，进行水培，温度控制在25?左右。发芽之后， 剪取茎尖为组培的外植体。 2.2 实验药品 表1 实验药品 实验药品 分子式 生产公司 规格 硝酸铵 北京化工厂 分析纯试剂 NHNO 43 硝酸钾 天津市红岩化学试剂厂 优级纯试剂 KNO 3 硫酸镁 MgSO•7HO 沈阳市东兴试剂厂 分析纯试剂 42 磷酸二氢钾 沈阳试剂一厂 分析纯试剂 KHPO 24 无水氯化钙 CaCl•2HO 天津市科密欧化学试剂开发中心 分析纯试剂 22 硫酸锰 MnSO•4HO 天津市大茂化学试剂厂 分析纯试剂 42 硫酸锌 ZnSO•7HO 沈阳市东兴试剂厂 化学试剂 42 CuSO硫酸铜 •5HO 沈阳市东兴试剂厂 分析纯试剂 42 钼酸钠 NaMoO•2HO 天津市化学试剂四厂 分析纯试剂 242 碘化钾 沈阳试剂一厂 分析纯试剂 KI 乙二胺四乙酸二钠 天津市光复科技发展有限公司 分析纯试剂 Na-EDTA 2 烟酸 国药集团化学试剂有限公司 生化试剂 CHNO 6522 肌醇 北京化工厂 生化试剂 CHO 6126 氢氧化钠 天津市红岩化学试剂厂 分析纯试剂 NaOH 硝酸铵 北京化工厂 分析纯试剂 NHNO 43 甘氨酸 国药集团化学试剂有限公司 分析纯试剂 CHNO 252 次氯酸钠 沈阳市东兴试剂厂 分析纯试剂 NaClO 无水乙醇 天津博迪化工股份有限公司 化学试剂 CHCHOH 32 琼脂粉 北京奥博星生物技术有限责任公司 生物试剂 氯化汞 国药集团化学试剂有限公司 化学试剂 HgCL 2 第 5 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 2.3 实验仪器 表2 实验仪器 实验仪器 仪器功能 型号 生产厂家 电子分析天平 称取蔗糖、琼脂等物品 奥多利斯科学仪器(北BS124S 京)有限公司 超净工作台 进行接种操作等 天津市泰斯特仪器有限CJ-1S 公司 高压蒸汽灭菌锅 培养基、接种器具进行高上海申安医疗器械厂 LDZX-50KBS 压蒸汽消毒 海尔空调 调节培养室的温度 青岛海尔空调器有限公KFRd-50Lw/vB(F) 司 电磁炉 融化培养基中的琼脂 广东美的生活电器制造C21-RT2104 有限公司 温度湿度计 培养室温度、湿度的检测 北京宏海永昌仪表技术WS-A1 开发中心 电热蒸馏水器 制备蒸馏水 天津市泰斯特仪器有限TT-98-II 公司 培养架 培养室内的组织培养 天津市泰斯特仪器有限YPT 公司 2.4 实验方法 2.4.1 无菌茎尖的获得 (1)不同消毒时间处理 先用75%酒精分别浸泡六份各30~60s，用蒸馏水冲洗干净后，其中三份用浓度为8%的次氯酸钠处理不同时间，分别处理10 min、15 min、20 min，另三份则用浓度为0.1%的氯化汞分别处理不同时间，分别处理6、10、14min，再用蒸馏水各冲洗过5次之后接入培养基中，每天观察记录茎尖的生长发育状况。 (2)不同消毒剂处理 a.次氯酸钠消毒 选取水培中生长枝条的新生嫩芽，用剪刀剪下，放入培养皿中。将茎尖先用洗涤剂冲洗干净，清水清洗3~5遍，然后用无菌水冲洗3~5遍后，置于75%的乙醇当中处理 第 6 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 30~60s。然后再用蒸馏水冲洗3~5次，再将花楸茎尖置于8%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒，时间分别是10min、15min、20min。达到处理时间之后，再用蒸馏水冲洗花楸茎尖5次，保证清洗的干净，然后准备接入培养基中。 b.氯化汞消毒 选取水培中生长枝条的新生嫩芽，用剪刀剪下，放入培养皿中。将茎尖先用洗涤剂清洗干净，清水冲洗3~5遍，再蒸馏水冲洗3~5遍后，置于75%的乙醇当中浸泡60s。再用无菌水冲洗3~5次，然后再将花楸茎尖置于0.1%的氯化汞溶液中分别处理6min、10min、14min。时间到了之后，再用蒸馏水冲洗茎尖5次，保证清洗的干净，准备接入培养基中。 2.4.2 培养基的制备 本实验采用的培养基配方为:MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5 mg/L。 (1)溶解琼脂 在洁净的不锈钢锅内放入500mL蒸馏水，加热至沸腾，随后调至小火，缓慢加入8g琼脂并不断搅拌直至溶化。玻璃棒在搅拌过程中朝着一个时针方向转动，防止琼脂结块。 (2)溶解蔗糖 加入蔗糖15g，快速不断搅拌直到蔗糖完全溶入含有琼脂的蒸馏水中。 (3)加入母液 按照MS培养基的配方量取各种试剂的母液，其中大量元素母液:硝酸铵等混合液和钙盐母液各取100mL、有机物母液和微量元素母液各取10mL、量取5mL铁盐母液，再按需求加入生长调节剂50mLNAA母液和30mL6-BA母液。 (4)定容 添加蒸馏水定容到1000mL。 (5)测pH 定容煮沸关火之后，用0.1mol/L的HCL和NaOH进行调节pH值，使pH值保持在5.8~6.0之间，用pH试纸测定即可。 (6)分装 因为琼脂大约在40?左右凝结成固体，所以要趁热进行分装。选取250mL的锥形 第 7 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 瓶装培养基，分装容积在30~40mL之间。分装过程中尽量不要将培养基粘附在瓶口内壁上，以免造成污染。 (7)封口 分装完成后立即用封口膜和橡皮筋分口，避免出现菌类污染。 (8)高压灭菌 用高温高压灭菌锅对封口之后的培养基进行灭菌，121?温度下灭菌，20min的灭菌时间。灭菌后将培养基移入到培养室观察，2~3天后没有出现污染，灭菌效果好可以使用。 激素配制 0.1 mg/mL的6-BA的配制:称取100mg6-BA，用少量0.1mol/L NAOH进行溶解，然后定容到1000mL。 0.01mg/L的NAA的配制:称量10mgNAA，用少量0.1mol/L NAOH进行溶解，随后定容到1000mL。 2.4.3 无菌室及培养基的灭菌 无菌室的灭菌 无菌室的组成有两部分，无菌操作室和无菌培养室。无菌室的灭菌，首先要到无菌操作室里，对超净工作台进行灭菌处理，连接好电源线，在实验准备接种前的约20分钟，要先打开超净工作台的风机和紫外灯。然后再打开无菌操作室和无菌培养室的紫外灯对室内进行杀菌，时间在20min以上。时间达到以后，先关闭无菌室的紫外灯，再关闭超净工作台的紫外灯和风机，然后将超净工作台的开关打开，大约15min过后即可进入进行实验操作。 培养基的灭菌 培养基在制备过程中会携带多种杂菌，因为培养基里含有的蔗糖是高浓度的，这种情况是有利于细菌和微生物滋生的。如果灭菌不当，就会照成微生物的污染，这种情况下，接种的组织会受到微生物的毒害，所以实验就不会成功。因此，在这种情况下，培养基完成分装后应该马上灭菌处理。常用的仪器设备是高温高压灭菌锅。在操作高温高压灭菌锅之前要仔细的检查各个部位是否正常，比如灭菌锅的温度表、压力表、放气阀、安全阀等等。然后检查锅底的水量是否足够，如果不够，倒入一定量的蒸馏水，避免空 第 8 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 烧或者干锅的现象出现。装锅的时候，要将盛有培养基的锥形瓶垂直的放进金属筐中，然后放入高温高压蒸气灭菌锅内。码放完毕后盖上锅盖。在消毒的当中，要排除锅内的冷空气，因为只有完全排除了灭菌锅内的空气后，在锅内全部是蒸汽的情况下，锅 2内的温度达到121?，压力为1.1kg/cm。在这个温度下是可以杀死各种细菌的，一般杀菌的时间设定在20min。设定的灭菌时间达到后，关闭灭菌锅的电源开关，打开放气阀进行放气处理，当压力下降到 0.00MPa后，放气阀再没有蒸汽排出的时候，便可以开启灭菌锅锅盖。在操作实验仪器灭菌的过程中，应注意安全，避免蒸汽烫伤。 2.4.4 培养步骤 首先穿好实验服带好口罩，用75%的酒精清洗超净工作台的台面，接种用的镊子放在盛有75%的酒精的烧杯中浸泡，其次将装有花楸茎尖的培养皿、滤纸、消毒的镊子、盛有75%酒精的烧杯和酒精灯放在超净工作台的台面上，再用酒精浸泡过后的棉球擦洗双手，点燃在超净工作台上的酒精灯，在超净工作台上的任何步骤都要保证酒精灯是点燃的，然后开始接种。将接种用的镊子全身过一遍火，之后在酒精灯的火苗上灼烧几次尖端处即可。然后用镊子夹起花楸茎尖在滤纸上吸吸表面附着的水，锥形瓶开封后瓶口要在酒精灯火苗处旋转几圈，起到杀菌的效果。再用镊子夹起黑果腺肋花楸茎尖插入培养基中，茎尖要求直立插入到培养基中，且最好一次成功，镊子也最好不要碰到瓶壁，避免带入病菌，污染培养基。如果一个培养基上接种两个或者三个，要注意茎尖之前的距离不能太近。在接种的过程中要经常过火接种用的镊子，防止交叉污染的发生。在超净工作台上接种时，接种人员的一切操作步骤都不能离开超净工作台，尽量避免语言交流、肢体交流等。接种完成后将接种放进装有酒精的容器内。然后将锥形瓶封口即可。最后要清理干净超净工作台，关闭其电源。将接种完毕后的锥形瓶放到无菌培养室的培养台上，整齐摆放，每天需要到培养室中开空调控制室温，浇水，观察记录茎尖的发育情况。 2.4.5 培养条件 将接种完毕的锥形瓶放在温度为24?的无菌培养室里连续培养，每天的光照时间是16小时，光源是白炽日光灯，强度大约是2000~2500Lx。培养室的湿度保持在60%~80%。 第 9 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 2.4.6测定方法 每天观察记录黑果腺肋花楸茎尖的变化情况。 得苗情况(%)=得苗数/该处理接种外植体数×100 污染情况(%)=污染数/该处理接种外植体数×100 褐化情况(%)=褐化数/该处理接种外植体数×100 第 10 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 3 结果与分析 3.1 次氯酸钠不同消毒时间对茎尖生长发育的影响 在预先使用75%无水乙醇消毒60s的情况下，利用8%次氯酸钠对黑果腺肋花楸茎尖消毒不同时间进行比较研究，研究结果由表3看出:在接种数都为30的情况下，从得苗情况来看，效果从好到坏依次为15min好于20min好于10min。从污染情况来看，效果好坏依次是浸泡15min好于浸泡20min好于处理10min。从褐化情况来看，效果好坏依次为15min好于10min好于20min。所以用8%的次氯酸钠消毒15min过后的黑果 褐化情况也为最小水平，分别腺肋花楸茎尖效果最好，得苗情况高达90%，污染情况与 是6.67%和3.33%。 表3 次氯酸钠不同消毒时间对茎尖生长发育的影响 接种外植体数 得苗数 污染数 褐化数 得苗情况 污染情况 褐化情况 8%NaClO 10min 30 9 18 3 30% 60% 10% 15min 30 27 2 1 90% 6.67% 3.33% 20min 30 16 3 11 53.33% 10% 36.67% 3.2 氯化汞不同消毒时间对茎尖生长发育的影响 在先使用75%无水乙醇的消毒30s~60s的情况下，通过对0.1%氯化汞对花楸茎尖消毒的不同时间进行研究，研究见表4:在接种数都为30的情况下，从得苗率来看，效果从好到坏依次为10min好于14min好于6min。从污染情况来看，效果好坏依次是10min好于14min好于6min。从褐化情况来看，消毒处理10min的效果好于处理6min和处理14min的效果。所以用0.1%的氯化汞溶液消毒10min过后的花楸茎尖整体效果最佳，得苗情况高达83.33%，污染情况与褐化情况也为最低水平，分别为13.34%和3.33%。 第 11 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 表4 氯化汞不同消毒时间对茎尖生长发育的影响 接种外植体数 得苗数 污染数 褐化数 得苗情况 污染情况 褐化情况 0.1%HgCl 2 6min 30 1 26 3 3.33 86.67 10 10min 30 25 4 1 83.33 13.34 3.33 14min 30 14 13 3 46.67 43.33 10 3.3 不同剂和不同消毒处理时间对茎尖生长发育的影响 结合以上两种消毒剂不同消毒处理时间对黑果腺肋花楸茎尖组培诱导的影响结果，综合比较每一种消毒剂消毒处理的最佳效果，优选出黑果腺肋花楸茎尖组培诱导的最适消毒剂和最佳消毒处理时间。由表5可见，在接种外植体数都为30的情况下，8%的次氯酸钠作为消毒剂来处理黑果腺肋花楸茎尖15min，其中得苗情况为90%，污染情况为6.67%，褐化情况为3.33%。0.1%的氯化汞作为消毒剂来浸泡黑果腺肋花楸茎尖10min，其中得苗情况为83.33%，污染情况为13.34%，褐化情况为3.33%。在得苗情况方面，8%的次氯酸钠好过0.1%的氯化汞;污染情况来看，8%的次氯酸钠好于0.1%的氯化汞;而褐化情况则是0.1%的氯化汞与8%的次氯酸钠持平。综合数据比较，8%的次氯酸钠消毒处理过后的黑果腺肋花楸茎尖生长发育情况更好。 表5 不同剂和不同消毒处理时间对茎尖生长发育的影响 消毒方法 消毒时间 接种外得苗数 污染数 褐化数 得苗情污染情褐化情 植体数 况 况 况 8%NaClO 15min 30 27 2 1 90 6.67 3.33 0.1%HgCl 10min 30 25 4 1 83.33 13.34 3.33 2 在花楸茎尖的整个组培过程中，最重要的就是消毒方法的选择。根据表3、表4和表5的结果来分析，应该选择8%的次氯酸钠，由表5能看出，次氯酸钠90%的得苗情况比氯化汞的83.33%的得苗情况好，所以消毒溶液应该选择8%的次氯酸钠。再通过表3能看出，15min的消毒时间对花楸茎尖的效果最好，因为得苗率高达90%，远远超过10min的30%和20min的53.33%。而在污染情况和褐化情况来看也是最低的，远远低于10min和20min。 第 12 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 4 结 论 植物组织培养即植物无菌培养技术，又称为离体培养。在组织培养的整个过程中，污染常常发生，所以在操作实验开始时，必须首先对该实验所需的外植体进行全面彻底的灭菌消毒，不仅要将外植体表面的微生物彻底杀死，而且还不能对外植体的组织和表层细胞功能造成影响，这样才能得到不污染外植体而且能使外植体存活。所以选择最好的消毒处理方法对实验所需外植体进行消毒是组培整个过程中最关键的一步。 该实验用不同的消毒剂和消毒时间处理黑果腺肋花楸茎尖，对于控制污染有很好的效果。先用75%的酒精浸泡黑果腺肋花楸茎尖30,60s，达到一个表面杀菌的效果，然后用不一样的消毒剂对其进行处理，每种溶剂处理的消毒时间也不相同。从消毒方法来看，8%的次氯酸钠消毒处理应该选择15min，因为在得苗情况方面高出了消毒10min和消毒20min之后很多，从污染情况和褐化情况方面，又好于消毒处理10min和20min很多。0.1%氯化汞消毒时间应选择10min，因为消毒处理10min时，无论是得苗情况或者是污染情况亦或者褐化情况，都比处理6min和14min好太多。在消毒时间方面，当消毒时间达不到标准时，其得苗率不高，污染率和褐化率反而不低，茎尖生长发育效果及其不好，但是消毒时间过长也会带来相似的情况。所以应该选择最合适的消毒时间。其中8%的次氯酸钠最佳的处理时间为15min时效果最好，0.1%的氯化汞最佳浸泡时间为10min时效果最佳。在比较两种最佳的消毒时间后再比较两种的处理效果，得苗情况来看，8%次氯酸钠消毒15min之后的得苗情况为90%，大于0.1%氯化汞浸泡处理10min之后的83.33%。在污染情况方面8%的次氯酸钠也比较好，比氯化汞消毒过后的污染数少了一半。褐化情况两种方法相持平。总体来说，8%的次氯酸钠消毒效果更好，所以在消毒剂的选择上来说应选择8%的次氯酸钠。 综上所述，本实验的结论是:最好的消毒方法是8%的次氯酸钠消毒对茎尖处理15min，黑果腺肋花楸茎尖培养的效果达到最好。 第 13 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 参考文献 [1] 孔繁轼.黑果腺助花楸的开发与栽培[M].中国花卉园艺,2006,(10):38-39. 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[11] 姜镇荣.黑果腺肋花楸产业化高效栽培技术研究的展望[J].辽宁林业科技,2013,(2):42-43. 第 14 页 共 15 页 黑果腺肋花楸茎尖培养中不同消毒方法的比较研究 致 谢 将近两个月的时间完成了这篇毕业，这是一个充满奋斗的过程，给我的学生生涯带来了无限的激情和收获。而这篇论文的完成也标志着我在鞍山师范学院化学与生命科学学院生物技术专业的学习生涯即将结束，大学四年的本科生活转瞬即逝，四年的大学学习生活也即将划上一个句号，我将开始面对一个全新的人生征程。 首先要感谢我的导师孙晓泽老师，该实验和论文正是在孙晓泽老师的悉心的指导和亲切的关怀下完成的。孙老师在实验过程中既用言语来教导我们，又用行动来给我们做示范。毕业论文完成的每一个阶段都伴随着孙老师的心血，从选题到初稿到定稿再到答辩的每一个步骤，孙老师给予我无微不至的关怀和最大程度的支持。孙老师给我的影响是巨大而深远的。这种影响并不是一朝的迸发，而是日就月将的，使我逐渐形成正确的、成熟的人生观和价值观。为此，我觉得有这样的一位优秀的导师是我学生生涯的一大幸事～还要特别感谢孙老师在怀孕期间仍然带领我们做实验，为我们解决实验方面的各种问题。在此，我要发自内心的对孙老师说一句:“谢谢您～” 感谢呵护我成长的父母，感谢他们无私的关爱和谆谆的教诲，感谢他们给予我物质和精神上的支持。 感谢和我一个实验室的刘月、王小东、张颖、权梅华等同学，与她们在实验过程中的交流探讨，对我完成论文工作提供了很大的帮助。 感谢我的室友李云政、陈百应、叶志楠，和他们一起度过了一段难以忘记的美好的寝室时光。 感谢11级生物技术专业的全体同学，与你们共度了充满青春、充满活力、充满激情、充满快乐的大学四年时光。 感谢化学与生命科学学院的全体授课教师，是你们教给我文化知识，是你们培养出一批又一批的人才，更是你们，让我终身受益。 最后，谨向参加本论文评阅和答辩的专家致以最诚挚的谢意～ 第 15 页 共 15 页