小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比较

小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比较 小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白注 射液有效成分含量和生物活性的比较 中华神经医学杂志2006年8月第5卷第8期ChinJNeuromed,August2006,Vol5,No.8 小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白 注射液有效成分含量和生物活性的比较 任淑萍 【摘要】目的通过不同的原料和生化提取,制备了小牛血清去蛋白注射液(DCSI)和小牛 血 去蛋白注射液(DCBI),比较两者在主要成分,多肽含量,生物活性等方面的差异.方法将DCSI 及 DCBI制备好后,对两者进行试验对比研究,即采用高效液相色谱法进行鉴定分析,用Lowry 法测定多 肽含量,用瓦氏微量呼吸检压仪测定呼吸活力并计算刺激指数,测定两者对小鼠耐缺氧试验 的不同影 响时间.结果DCSI与DCBI相比,前者色谱的双峰面积大于总的峰面积75%,显着区别于后 者的 60%,并且前者在多肽含量,呼吸活性及小鼠耐缺氧时间的指标上都明显高于后者 (Jp<0.05).结论 DCSI与DCBI之间的主要成分,主要成分的含量和生物活性有显着的差别,并且前者优于后 者,从药 物分析角度说明两者不是同一种产品. 【关键词】小牛血清去蛋白注射液;小牛血去蛋白注射液 【中图分类号】R392—33【文献标识码】A【文章编号】l671-8925(2006)08—767-003 Comparativestudyofactiveingredientcontentandbiologicalactivitybetweendeproteinizedcalf serunlinjectionanddeproteinizedcalfbloodinjectionRENShu-ping.DepartmentofPharmacy, TiantanHospital,CapitolUniversityofMedicalSciences,Bering100050,China 【Abstract】ObjectiveToobservethedifferencesinthepolypeptideandactiveingredientcontents andbiologicalactivitybetweendeproteinizedcalfseruminjection(DCSI)anddeproteinizedcalfblood injection(DCBI).MethodsDCSIandDCBI,prepared,Vitl1differentmaterialsandbiochemical extractionmethods,wereidentifiedwithhighperformanceliquidchromatography(HPLC)andcomparedin thecontentofactiveingredientwiththeLowry’Sway,andinthecellularrespirationandstimulationindex withthemethodofmicrorespirometeationdecreasing.Inaddition,theeffectofthe2injectionsontherat tolerancetoanoxiawasobserved.ResultsDouble-peakareaaccountedformorethan75%oftotalpeak areainHPLCofDCSI,whichwassignificantlyhigherthanthat(about60%)inHPLCofDCBI;DCSInot onlyprolongedthedurationoftolerancetoanoxiaascomparedwithDCBI,butalsohadhigherbiological activityandpolypeptidecontent(P<0.05).ConclusionThereareobviousdifferencesinthecontentsof activecomponentsandbiologicalactivitybetweenDCSIandDCBI,andDCSIisbeRerthanDCBI. 【Keywords】Deproteinizedcalfseruminjection;Deproteinizedcalfbloodinjection 神经保护治疗是脑血管病的重要治疗领域,该领 域中有许多种类的神经保护剂.目前在国内的主要种 类之一为小牛血去蛋白注射液(deproteinisedcalf bloodinjection,DCBI),该产品主要用于缺血性脑血 管病的神经保护治疗_1..2005年,国内第一个小牛血 清去蛋白注射液(deproteinisedcalfseruminjection, DCSI)问世,由于与DCBI在名称上比较相似,所以在 l临床上容易产生混淆.本实验通过测定DCSI与 DCBI的主要成分,呼吸活性,多肽含量等实验指标, 对两者的差别进行研究. 材料与方法 作者单位:100050北京,首都医科大学附属北京天坛医院药剂科 767 ? 基础研究? 一 ,实验材料 1.实验动物:SD小鼠60只,雌雄各半,体重20g 左右;雄性豚鼠10只,体重300g左右. 2.实验药品:采用出生28d内的幼牛静脉血f中 国医药生物技术协会北方牛血制品产业化基地提 供),提纯血清用于制备DCSI;采用出生4个月的小 牛血制备DCBI.采用专利技术有机溶剂提取法制备 DCSI,而采用普通提取法制备DCBI.两者均经过除 蛋白,除乙醇,粗滤,酶解,离心,超滤等工艺方法制 备,但前者增加了层析纯化和病毒灭活技术. 3.实验仪器:瓦氏微量呼吸检压仪;液相色谱仪; LDZ522型离心机;旋转蒸发仪. 二,实验方法 1.高效液相色谱分析:按照高效液相色谱法f中 中华神经医学杂志2006年8月第5卷第8期ChinJNeuromed,August2006,Vol5,No.8 国药典2005年版二部附录VD)测定.色谱条件与系 统适应性试验:以十八烷基键合硅胶为填充剂.取磷 酸二氢钾6.8g.加水l000mL溶解,用磷酸调节pH 至3.0.取820mL.加甲醇l80mL,作为流动相,流速 为0.75mL/min,检测波长293nnl.取供试品溶液l0 L注入液相色谱仪中,保留时间,重复l0次进 样.主峰保留时间的相对偏差不得过1.0%.理论塔板 数不低于4000.测定法:吸取供试品溶液l0L进 样,记录保留时间及峰面积.按面积归一化法计算. 2.多肽含量的测定:精确量取一定体积样品(含 蛋白质50g左右)于试管中,加5mL碱性铜液,混 匀,于室温放置10min,快速加入0.5mL酚试剂,摇 匀.于室温放置30min.用650am波长或红色滤光 片比色(呈色后,如发现混浊,经3000r/min离心l5 min后再比色).精确量取蛋白质溶液(100 ~g/mL)O,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,分别置于试管中. 加蒸馏水补至lmL.其余操作同样品.可得一标准曲 线.从标准曲线查出样品相当标准蛋白质溶液之mL 数A,样品蛋白质含量(g/mL)=Ax0.01%/样品mL数. 3.游离氨基酸含量的测定:取DCSI,DCBI及相 应的标准氨基酸适量,用高效液相色谱进行氨基酸分 析,分析其游离氨基酸(天门冬氨酸,谷氨酸,丝氨酸, 甘氨酸,组氨酸,精氨酸,苏氨酸,丙氨酸,脯氨酸,酪 氨酸,甲硫氨酸,胱氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,苯丙氨 酸,赖氨酸,缬氨酸)含量. 4.呼吸活性的测定口]:采用微量减压技术的方 r,\ 法.测定DCSI和DCBI促进豚鼠肝匀浆耗氧量生物 活性.用伊文斯蓝做指示剂.分别测定出对照管,检品 管及空白管的平均耗氧量(分别设为A,B,C),检品管 的刺激指数SI=(B—C)/(A—C). 5.SD小鼠耐缺氧时间的测定:按文献『4]的方法 进行.60只SD小鼠随机分成3组,每组20只,生理 盐水组小鼠经腹腔注射生理盐水2mL/kg.实验组小 鼠分别经腹腔注射DCSI和DCBI2mg/kg.给药后 20min.将小鼠分别置于放有钠石灰的250mL磨口 广口瓶内密封.观察小鼠存活时间(广口瓶用前均盛 水校正容量,每瓶放一只小鼠,以呼吸停止为指标). 6.统计学分析:所有数据以均数?标准差1 示.两组比较用t检验.多组数据运用单因素方差分 析(F检验)的统计学方法.P?0.05示差异有显着性意 义 结果 一 ,高效液相色谱分析 色谱图见图l.从DCSI的色谱图上可以看到规 律的双峰肽图.且在出峰时间和峰高上也是非常一致 的,时间分别为3.085min和4.8l1min.高度也较为 一 致,并且两个主峰面积占所有峰面积的75%以上. 而DCBI的色谱图只在2.904min出现一个单峰肽 图,且峰的高度也较DCSI的矮,出峰时间也不相同, 并且主峰只占峰面积的60%左右.这说明DCSI与 DCBI在主要成分及其含量上存在差别. DCSI组的色谱图DCBI组的色谱图 图1DCSI组与DCBI组之间高效液相色谱图的差别(n:=l0) Fig.1HighperformanceliquidchromagramsofDCSIandDCBI(凡=l0) 二,多肽含量的测定 两组多肽含量见表l.DCBI组的多肽含量明显 低于DCSI组(fk0.01). 三,游离氨基酸含量的测定 两组氨基酸含量见表l.与DCSI组相比,DCBI 组的游离氨基酸含量无显着差~Jq(P>O.o5). 四,呼吸活性的测定 呼吸活性SI见表2.与正常组相对比.DCSI组 和DCBI组的SI都显着增加(P<0.O1);与DCSI组相 比,DCBI组的SI相对减少(fk0.05). 五,小鼠耐缺氧时间的测定 表1DCSI组与DCBI组之间多肽含量及 游离氨基酸含量的差别(互,n=lO) Tab.1Contentsofpolypeptideandfreeaminoacidin DCSIandDCBIgroups,n=10) 小鼠耐缺氧时间见表3.与正常组相对比,DCSI 组和DCBI组的小鼠存活时间明显延长(P<0.05);与 中华神经医学杂志2006年8月第5卷第8期ChinJNeuromed,August2006,Vol5,No.8 表2组雄性豚鼠呼吸活性的 sI值的差别) Tab.2SIvaluesofDCSI,DCBIandcontrol groups(x.+s) 与正常组比较,P<0.01:与DCSI组比较,P(0.05 表3DCSI与DCBI对SD小鼠在缺氧条件 下存活时间的影响) Tab.3EfleetsofDCSIandDCBIonsurvival timeofSDratsinthenormalpressurehypoxia eondition(x, 与正常组比较,P<0.01;与DCSI组比较,P(0.05 DCSI组相比,DCBI组的小鼠存活时间相对减少 (P<O.05). 讨论 血清与血浆虽同为血液的液体成分.但血清没有 纤维蛋白原和少量参与血凝的其他蛋白质.却含有血 凝时由血小板释放出来的某些物质.而且刚出生不久 的牛血清中含有多种成年牛血中所不具备的促细胞 活性物质,它不含蛋白质,致热原和任何传播性感染 因子.没有血细胞中可能含有的引起副作用的物质. 通过对DCSI和DCBI的实验对比研究表明:经过层 析纯化技术制备而成的DCSI主要成分为小分子激 活肽和磷酸肌醇寡糖】.在主要成分方面.通过高效 液相色谱分析可见两者的色谱图明显不同.DCSI显 示两个主峰.且两主峰面积之和大于75%.而DCBI 显示为一个主峰.峰面积也小于DCBI组.同时.在出 峰时间上也不相同.说明两者的有效成分不同.并且 DCSI在纯度和含量上都明显优于DCBI.从多肽含 量测定结果上比较.两者之间也有明显的区别.DCSI 组多肽含量高于DCBI组.多肽是小牛血制品中重要 的生物活性物质.它作为蛋白质合成的成份.参与代 谢过程,特别是通过激活细胞代谢S6一激酶活性参与 缺氧状态下细胞的修复过程.在呼吸活性方面,DCSI 组的SI值(3.30)高于DCBI组SI值(2.03),且P<0.05, 说明在促进细胞能量代谢和细胞修复方面.DCSI组 要强于DCBI组.由于以上这些差异性,造成了在小 鼠耐缺氧试验时小鼠存活时间的不同.综上所述. DCSI与DCBI相比.在有效成分.含量及生物活性上 都具有明显的不同.从基础医学的角度证明两者是不 同的物质.前者并具有显着的优势.这种优势是否会 转化为临床疗效的差异,需要进一步临床实验证实. 参考文献 lMychkaVB,ChazovaIE,GomostaevW,eta1.Primaryprophylaxis ofcerebrovascularcomplicationsinpatientswithmetabolic syndrome[J].TerArkh,2005,77(10】:20—24. 2MacheretIeL.KhanenkoNV.Drugtherapyofpatients,?ith dyscirculatoryencephalopathy[J].LikSprava,2002,hpr-Jun,(3.4): 84—87. 3于鸿儒,肖剑英,刘用璋,等.小牛血去蛋白提取物的生化性质及 药效学的实验研究【J】.药物生物技术,1998,5(I):34—37. 4李义奎.中药药理实验方法学【M】.上海:上海科学技术出版社, l991.110.150. 5Obermaier-KusserB,MUhIbacherC,MushaekJ,eta1.Further evidenceforatwo-stepmodelofucose-transportregulation【J]. BiochemJ,l989,261(3):699—705. 6SmolianinovAB.Actovegintreatmentofduodenalulcerassociated ,vithischemicheartdiseaseanddiabetesmellitus『J1.KIinMcd (Mosk),2000,78(6):24-28. 7吕媛.小牛血清去蛋白注射液对脑细胞缺血缺氧的保护作用及临 床应用【J】.中国临床药理学杂志,2006,22(2):141-144. (收稿日期:2006.04.01) (本文编辑:刘凯)