急速冷冻_冷冻置换方法保存的肾小球毛细血管袢的超微结构

急速冷冻_冷冻置换方法保存的肾小球毛细血管袢的超微结构 电 子 显 微 学 报 Vol220 ,No12 第 20 卷 第 2 期 200124 2001 年 4 月Journal of Chinese Electron Microscopy Society () 文章编号 :100026281 20010220093205 急速冷冻 冷冻置换方法保存的肾小球 毛细血管袢的超微结构 3 颖 ,冷重光 于 ()沈阳市儿童医院 ,沈阳 110032 , 3 沈阳市骨科医院 ,沈阳 110044 摘 要 : 目的 :用急速冷冻 - 冷冻置换法与普通的化学固定技术研究比较肾小球毛细血管袢在相同 灌流压条件下的超微结构 。方法 :用 150cm HO 压力灌流活体状态下大白鼠的肾脏 ,用急速冷冻 - 冷2 冻置换法及普通的化学固定法制作电镜超薄切片 。结果 :在相同的压力下用急速冷冻 - 冷冻置换法 所观察到的肾小球毛细血管袢上皮细胞足突裂孔膜的宽度比普通的固定方法所观察到的窄 ,另外用 急速冷冻 - 冷冻置换方法观察到的肾小球毛细血管袢的其它超微结构也与普通的化学固定方法所观 察到的有所不同 。结论 :用急速冷冻 - 冷冻置换法所观察到的超微结构比用普通的化学固定法观察 到的超微结构更接近活体状态 。 关键词 : 急速冷冻 - 冷冻置换 ;肾小球 ;超微结构 ;电子显微镜 中图分类号 : R32216 ; TN16 ;Q336 文献标识码 : A 许多研究传统的化学固定方法能够引起生物组织的收缩和细胞成分的丢失 ,导致人工 1 产物的生成。冷冻技术是能较好地保存生物组织的方法之一 ,但在我国的应用还较少 。我们 采用急速冷冻 - 冷冻置换法制作超薄切片 ,用透射电子显微镜观察肾小球毛细血管袢在最接近 活体状态下的超微结构并比较两种不同的固定条件下超微结构的差异 。 材料与方法 将 28 只体重 120,200g 雄性 Wister 大白鼠分成两组 。设定 150cm HO 灌流压 ,在活体状态 2 下经腹主动脉灌流固定大白鼠肾脏 ,用急速冷冻 - 冷冻置换法和普通的化学固定方法制作电镜 超薄切片 。 1 急速冷冻 - 冷冻置换法( QF - FS) 用 2 %多聚甲醛灌流 15min 后 ,切除肾脏 ,将肾皮质切成 1mm 厚的组织片 。在用液氮冷却的 ) ( Liquid isopentan2propane - 193 ?混合液中迅速冷冻 。然后在 2 %四氧化锇与纯丙酮混合液中 ( ) - 80 ?,20h ; - 20 ?,2h ;4 ?2h冷冻置换固定后 ,室温下纯丙酮液 3 次洗净 。常规环氧树脂 8122 ,3 包埋。 2 普通化学固定方法 先用 019 %生理盐水再用 215 %戊二醛灌流肾脏 15min ,然后切除肾脏将其皮质切成小碎块 再用 215 %戊二醛及 1 %四氧化锇分别固定 1h ,中间用 011molΠL 磷酸缓冲液充分漂洗 。酒精逐级 脱水 ,常规环氧树脂 812 包埋 。 上述标本半薄切片 ,光镜观察定位 。超薄切片 ,经醋酸铀 、柠檬酸铅双重电子染色 ,日立 600 或 8100 型透射电子显微镜观察 。 3 统计学 形态学的测量是在肾小球毛细血管壁的三个部位进行的 。每张电镜照片放大倍率为 72 000 收稿日期 :1999212227 ;修订日期 :2000204224 倍 。每一种固定方法均在不同点上测量 50 次 。对形态学的资料进行统计学处理 。数据用 X? ?s ( 表示 ,根据方差齐性检验结果 ,用 t 检验 。比较两种方法所测得的部分数据 ,有显著性差异 P <) 0101。 结果 ( 电镜所见在灌流压相同的条件下 ,固定方法不同肾小球毛细血管壁的超微结构不同 图 1 , ) 2。 F :足突 ;BM :基底膜 ;单箭头 :足突裂孔膜 ;双箭头 :冻结面 F :foot processes ;BM : basement membrane ;Arrow :glomerular slitdiaphragms ;Double Arrow :frozen face . 用普通固定方法观察到的肾小球超微结构 ,足突表面不光滑 ,外型不规则具有收缩感 。毛细血管基底 膜较图 1 (μ) 薄 ,并有清晰的内 、外疏松层的三层构造 Bar = 015m。 Electron micrographs of glomerular capillary loops prepared by the conventional fixation method. The surface Fig. 1 ( ) () contours of foot processes Fwere uneven , and the widths of glomerular slit diaphragms arrowswere wide . In the glomerular basement membranes there was a lamina lucida on both sides of the lamina densa . 用急速冷冻 - 冷冻置换法所观察到的肾小球上皮足突表面光滑 ,外型圆滑饱满 ,足突与足突之间的距 图 2 离比用普通化学固定方法所观察到的距离稍窄 。肾小球毛细血管基底膜相对较厚 ,其内 、外疏松层不 (μ) 清晰 Bar = 0. 5m。 Electron micrographs of glomerular capillary loops prepared by the quick2 freezing and freeze2substitution fixation. Fig. 2 ( ) The surface contours of foot processes were smooth , and the widths of glomerular slit diaphragms arrowswere narrow. The lamina lucida of glomerular basement membranes was not clearly. 第 2 期 于 颖等 : 急速冷冻 —冷冻置换方法保存的肾小球毛细血管袢的超微结构 95 () ( ) 1用化学固定方法所观察到的足突表面不光滑 ,外型不规则具有收缩感 图 1,而急速冷冻 - () 冷冻置换法观察到的上皮细胞足突表面光滑 ,外型圆滑饱满 图 2。 () ( ( ) 2急速冷冻 - 冷冻置换法所观察到的上皮细胞足突裂孔膜 图 3 A和足突与足突间的距离 图 ) 3 B均比用化学固定方法所观察到的距离稍窄 。 () ( 3用急速冷冻 - 冷冻置换法所观察到的肾小球毛细血管基底膜相对较厚 ,其内 、外疏松层 透明 ) () 层不清晰 图 2,不像在普通化学固定方法中所见到的相对较薄 ,有着清晰的三层构造的基底 () 膜 图 1。 () 两种方法的形态计量统计学资料证明 表 1用急速冷冻 - 冷冻置换法所观察到的上皮细胞 ( ( ) 足突与足突间的距离 图 3 B与普通固定方法所测量到的 B 的距离相比 , 有显著性差异 P < ) 0101。 表 1 两种不同方法的测量比较 Ta b. 1 The comparison bet ween t wo tissue preparation methods 测 量 部 位 方 法 A B BM 3333急速冷冻 - 冷冻置换法 n = 50 2816 ?417 3818 ?121616919 ?2919 18 ?418 6013 ?1111 16710 ?2117 31普通固定方法 n = 50 ()33 P < 0101 3 P < 0105 X? ?s 单位 : nm 图 3 为了便于测量和统计 ,我们设定在肾小球毛细血管壁上测量三个部位 。A : 上皮细胞足突裂孔膜幅 ;B : 距离 A 50nm 足突与足突之间的距离 ;BM :肾小球 - 基底膜的宽度 。 Fig. 3 Schematic represention of measured parts in the glomerular capillary wall . A = width of slit diaphragms ; B = distance between neighboring foot processes at 50nm from slit diaphragms ; BM = width of glomerular basement ( ) membranes. Morphometric data were expressed as the mean ? SD. Statistical significance P < 0101 was checked by Student’s test . 讨论 肾小球是一个由内皮 、上皮以及系膜细胞等成分组成的特殊微血管结构 ,从而使血液通过后 4 能有效而又有选择性地超滤出特殊成分的超滤液。近年来用各种冷冻技术保存生物组织已得 5 3 到世界公认 , 其中包括生体内冷冻技术、急速冷冻 - 冷冻置换法、急速冷冻 - 冷冻蚀刻法 63 等。急速冷冻 - 冷冻置换法广泛用于肾脏超微结构的研究,用这种方法保存的生物组织的 7 ,8 超微结构比较接近活体状态下的超微结构。相反 ,普通的固定方法所使用的戊二醛 、四氧化 1 锇等固定剂会引起肾小球超微结构的脱水 、破坏或使它们的细胞成分丢失,使用酒精和丙酮在 ( ) 室温条件下逐级脱水也会引起组织超微结构的收缩并发生各种变化 图 1。生物组织在急速冷 ( ) 冻后 ,在低温条件下进行缓慢的 、轻柔的置换过程 ,使组织细胞的收缩降到最低程度 图 2而又 3 ,9 ,10 。所以急速冷冻 - 冷冻置换法比化学固定方法能更好地保存生物组织接近 不易形成冰晶 1 , 9 活体状态的超微结构。在这个试验中 ,用急速冷冻 - 冷冻置换法在相同灌流压条件下观察 () () 到的上皮细胞足突裂孔膜幅 A 图 3和足突与足突之间的距离 B 图 3都比化学固定方法所观察 ( ) 到的窄 ,其中两种方法的 B 相比有显著性差异 P < 0101 表 1。而且上皮细胞足突的外型比较光 滑 、饱满 ,说明化学固定方法引起上皮细胞 、足突等超微结构收缩和变形 。同时我们还观察到用 急速冷冻 - 冷冻置换法 ,其肾小球基底膜较厚 。这也说明肾小球毛细血管壁上皮细胞层 、内皮细 胞层及基底膜等组织的超微结构由于化学固定所产生的收缩 、变形及形成人工产物 。1990 年 , 11 Reale 和 Luciano等学者报告了用戊二醛和多聚甲醛固定后 ,用冷冻置换法观察到的肾小球基 () 底膜不存在两侧的疏松层 内 、外透明层,所以他们认为肾小球基底膜的内 、外疏松层是人工产 物 。我们用急速冷冻 - 冷冻置换的方法所观察到的肾小球基底膜的三层结构也是不清晰的 ,我 们认为我们使用的这种方法把引起组织细胞的脱水 、收缩等降到了最低程度 。用这种方法所观 察到的超微结构也是比较接近活体状态条件下的超微结构 。 参 考 文 献 1 Elder H Y. Cryofixation. In : Bullock G R , Pretusz P eds. Techniques in immunocytochemistry. Vol 4. San Diego : Academic Press ,1989. 1228. 2 Ohno S , Hora K ,Fulukawa T ,Oguchi H. Ultrastructural study of the glomerular slit diaphragm in fresh unfixed kidneys by a quick2freezing method. Virchows Arch B Cell Pathol ,1992 ,61 :3512358. 3 Fulukawa T ,Ohno S ,Oguchi H , Hora K ,Tokunaga S ,Furuta S. Morphomietric study of glomerular slit diaphragm fixed by rapid freezing and freeze2substitution. Kidney Int ,1991 ,40 :6212624. () 4 林善锬 . 肾脏生理 . 见 :王海燕主编 . 肾脏病学 第二版. 北京 :人民卫生出版社 ,1996. 3218 ,28240. 5 Ohno S ,Terada N ,Fujii Y ,Ueda H ,Takayama I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique . Virchrows Arch ,1996 ,427 :5192527. 6 Hora K ,Ohno S ,Oguchi H ,Furukawa T ,Furuta S. Three 2 dimensional study of glomerular slit diaphagm by quick2freezing and deep2etching replica method. Eur J Cell Biol ,1990 ,53 :4022406. 7 Yu Y ,Leng C G , Kato Y ,Terada N ,Ohno S. Ultrastructural study of anionic sites in glomerular basement membranes at different perfusion pressures by quick2freezing and deep2etching method. Nephron ,1998 ,78 :88295. 8 Yu Y , Leng C G , Terada N , Ohno S. Scanning electron microscopic study of the renal glomerulus by an in vivo cryotechnique combined with freeze2substitution. Jounal of Anat ,1998 ,192 :5952603. 9 Chan F L , Inoue S ,Leblond C P. The basement membranes of cryo 2 fixed or aldehyde2fixed , freeze2substitution tissues are composed of a lamina densa and do not contain a lamina lucida . Cell Tissue Res ,1993 ,273 :41252. 10 Adler S. Characterization of glomerular epithelial cell matrix receptors. Am J Pathol ,1992 ,141 :571 2578. 11 Reale E ,Luciano L . The laminae rarae of the glomerular basement membranes. Their manifestation depends on the histochemical and histological techniques. In : Sessa A ,Meroni M ,Battini G eds. Hereditary Nephritis. Contrib Nephron. Basel , Karger ,1990 ,80 :32240. 第 2 期 于 颖等 : 急速冷冻 —冷冻置换方法保存的肾小球毛细血管袢的超微结构 97 Ultra structural study of glomerular ca pillary loops by quick2freezing and freeze2substitution method 3YU Ying , L ENG Chong2guang (Department of otorhinolaryngology ,Children’s Hospital ,Shenyang 110032 ,China . )3 Orthopaedics Hospitol of Shen Yang ,Shenyang 110044 ,China . Abstract : Objectives : Ultrastructural study of glomerular capillary loops as revealed by quick2freezing and freeze2substitution ( ) method. Methods :Wister rat kidneys were perfused and were studied by the quick2freezing and freeze2substitution QF2FSmethod , in addition to the conventional perfusion fixation method. Results : By the quick2freezing and freeze2substitution methods , the foot processes showed different shapes from those revealed by the conventional preparation methods , even at the same perfusion pressures. Conclusions : It is concluded that the tissue preparation for the quick2freezing and freeze2substitution method has been designed to preserve the morphology in a condition approximating to the live state . Key words : quick2freezing and freeze2substitution ; renal glomerulus ; ultrastructure ;electron microscopy