基因操作习题和答案

第一章 一. 名词解释: 1. Gene manipulation 基因操作。将在细胞外产生的核酸(物质)分子插入到病毒,质粒或其它载体系统中,再整合到特定的宿主中,从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 2. Interrupted genes 间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区,使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。 3 .Promotor 启动子。DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位,也就是使转录开始的部位。 4. Subcloning 亚克隆。当初始克隆中的外源DNA 片段较长,含有许多目的基因以外的DNA 片段时,在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行,将目的基因所对应的一小段DNA 找出来,这个过程叫“亚克隆”。 二. 填空题 1. 基因操作(Gene manipulation)的核心部分是基因克隆(gene cloning),gene cloning 的基本要点有(克隆基因的类型),(受体的选择)和(载体的选择)。 2. (基因)是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。它可以是连续的,也可以是(不连续的);可以是(DNA),也可以是RNA;可以存在于染色体上,也可以(存在于染色体之外(如质粒,噬菌体等))。 3. 基因操作并不是一个法律概念,除了包括基因克隆外,还包括基因的(表达)、(调控)、(检测)和(改造)等与基因研究相关的。 4. 启动子(Promotor)是指(基因转录过程中控制起始的部位)。通常一个Gene 是否表达,(转录起始)是关键的一步,是起决定作用的。在转录过程中,Promoter还是(RNA 聚合酶)的结合位点。 5. 原核生物的RNA polymerase 主要由两部分组成:(核心酶)和(σ因子),其中σ-因子并不参与RNA 的合成,它的作用主要是(识别要转录的起始位点)。 6. 从(启动区)到(终止区)的这一段距离称为一个转录单位,或者一个转录产物,其中可包括一个或者多个Gene 。 7. 转录终止子主要有两种,一种是(依赖ρ因子),另一种是(不依赖ρ因子)。 8. Gene 的书写方式,通常是写出的DNA 序列总是与(mRNA)相同的那条链,方向是从(5')到(3')。对于碱基的位置,一般自转录起始点向两个方向编号,其中转录起始点定为(+1),(在起始点上游第一个碱基)定为-1 。 9. 重叠基因(Overlapping gene)是指(一个基因的序列中,单个DNA 序列可编码一个以上的蛋白质),间隔基因(Interrupted gene)是指(在编码序列中间插入的一段无编码作用的碱基序列) 三.简答题 1.简述基因克隆的两个基本特征? 答:基因克隆的两个基本特征是一是强调外源核酸分子(一般情况下都是DNA)在不同宿主中的繁殖,打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征,基因操作的另一个重要特征是繁殖。 2 什么是gene cloning ?什么是亚克隆(subcloning)? 答:基因克隆:一定程度上等同于基因的分离,即从复杂的生物体基因组中,经过酶切,消化等步骤,分离带有目的基因的DNA 片段。基因亚克隆:初步克隆中的外源片段往往较长,含有许多目的基因片段以外的DNA 片段,在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行,因此必须将目的基因所对应的一小段DNA 找出来,这个过程叫“亚克隆”。 思考题问题:简述基因操作、基因重组和基因的关系。 思考题问题:为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物? 思考题问题:简述基因的结构组成对基因操作的影响。 1 第二章 一.名词解释 1.Restriction and modification 限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质(DNA)的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matched ends 匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列,经限制酶切割后,产生的相同的,互补的末端称为匹配粘端,亦即粘性末端(cohesive end)。 3. Blunt ends 平末端。在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链,产生的没有碱基突出的末端称为平末端。 4. Isoschizomer :同裂酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶,但它们的切割位点可能不同。 5. Isocaudiners:同尾酶。来源不同、识别序列不同,?但产生相同粘性末端的酶。 6.Site preferences位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。 7.Star activity星星活性。在极端非条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称星星活性。 8. Nicking enzyme切口酶。有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链,产生单链缺口,这种酶称为切口酶。 9. Klenow fragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段,而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。 10 .Sequenase测序酶。是改造的T7 噬菌体DNA 聚合酶,切除了99% 以上的3'--5' 外切活性。Sequenase Version2 切除了所有的3'--5' 外切活性,用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。 11.Reverse transcriptase 反转录酶。即依赖于RNA 的DNA 聚合酶,它有5'--3' 合成DNA 活性,但是无3'--5' 外切活性。它来自AMV (禽成髓细胞瘤病毒)或Mo-MLV (Moloney 鼠白血病病毒,又称M-MuLV)。12. Terminal transferase 末端转移酶。来源于小牛胸腺,是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶,在二价阳离子存在下,末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。若dNTP 为T 或C ,此二价阳离子首选钴离子;若dNTP 为A 或G,此二价阳离子首选镁离子。 13. Ligase 连接酶。催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键,将两段核酸连接起来的酶。 14. T4 polynucleotide kinase T4 多核苷酸激酶。催化A TP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。 15. Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠(Calf intestinal alkaline phosphatase),简称CIP 或CIAP,也有来自细菌(BAP)。催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。 16. S1 nuclease Sl 核酸酶。来源于米曲霉(Aspergillus oryzae),可降解单链DNA 或RNA ,产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链;对dsDNA ,dsRNA ,DNA:RNA 杂交体不敏感。 17. ExonuleaseЩ外切核酸酶Щ。来源于大肠杆菌,催化从dsDNA 3'-OH 逐一去除单核苷酸的反应,底物为dsDNA 或线状和带切口或缺口的环状DNA ,反应结果是在dsDNA 上产生长的单链区。 18. Single strand binding protein 单链结合蛋白。此蛋白能协同地与ssDNA 结合而不与dsDNA 结合,可以削弱链内二级结构的稳定性,从而加速互补多核苷酸的重新退火,并通过消除阻碍DNA 聚合酶前进的链内二级结构,而提高这些聚合酶的持续作用能力。 19. Proteinase K蛋白酶K 是具有高活性的丝氨酸蛋白酶,属枯草杆菌蛋白酶,可以水解范围广泛的肽键,尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键。K 指该蛋白酶通过水解角蛋白(keratin)可以为该霉菌提供所有所需的碳源和氮源。 二.填空题 1.Ecok 的一般分子组成为R2M2S ,在这些亚基中,R 亚基具有(限制酶)的作用,M 亚基具有(甲基化)的作用,S 亚基具有(识别DNA 序列)的作用,当该该酶发生作用时,需用到的辅因子有:(ATP)、(SAM)、(Mg2+)。 2. 限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)的命名是按属名和种名相结合的原则的,通常第一个大写字母取自(属名的第一个字母),第二、三个字母取自(种名的前两个字母),第四个字母则用(菌株名)表示。 3.Ⅱ型限制酶识别回文对称序列,在回文序列(内部)或(附近)切割DNA ,产生带3'-OH和5'-P 基团的DNA 的产物,需(Mg2+)的存在才能发挥活性,相应的修饰酶只需SAM 。 4. 从因特网上可以找到限制酶的数据库(REBASE),该网站由New England Biolabs 公司维护()。 5. 识别相同序列的限制酶称(同裂酶) 6. Ⅰ-CeuI 酶是衣滴虫叶绿体大rRNA 基因的内含子编码的产物,识别位点为(26)bp,识别的核心部位为(-12)至(+7)位置的19bp ,反应温度为37℃。 7. 位点偏爱是指:(限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率) 8. 1 单位NaeⅠ或NarⅠ的定义:(切割1μg 腺病毒2 DNA 在50ul 体系中1 小时所需的酶量) 9. 有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链,产生单链缺口,即(切口酶) 10. 个体间DNA 限制性片段长度的差异叫(限制性片段长度多态性(RFLP)) 11. DNA 载体经HindⅢ切割后产生粘性末端,能发生载体自连,影响载体与外源DNA 的连接效率,常用的防止载体自连的方法有(去磷酸化)、(部分补平)。 12. 完全的回文序列应具备两个特点即(能够在中间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对)和(两条互补链的5'--3' 的序列组成相同,即将一条链旋转180°,则两条链重叠)。 14. 分别写出以下限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)的识别序列EcoRⅠ(GAATTC)、Sau3AⅠ(GA TC)、HindⅢ(AAGCTT)。 16. 限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)通常保存在(50%)浓度的甘油溶液中。 20. Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶裂解而从全酶中除去(5'--3' 的外切活性)活性的多肽大片断,而其他活性保持不变。T4 phage DNA polymerase 分子量为(114)kDa,该酶的3'--5' 的外切活性比Klenow 酶强(200)倍,由于它不从单链DNA 模板上替换引物,故可用于(提高诱变反应)。 21. 反转录酶来自AMV 或Mo-MLV ,即依赖于RNA 的DNA 聚合酶,它有(5'--3' 合成DNA 的)活性,但无(3'--5' 的外切)活性。; 22. 末端转移酶来源于(小牛胸腺),是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶,在(Mg2+)存在下,末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。 24. E.coli DNA 连接酶与T4 DNA 连接酶相似,但需(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+))的参与,且其平端连接效率低常用于置换合成法。T4 多核苷酸激酶在高浓度的ATP 时发挥最佳活性,(NH4+)是其强烈抑制剂。 26. 绿豆核酸酶来源于绿豆芽,与S1 酶相似,但比S1 酶更温和,在(大切口)上才切割,可使DNA 突出端变成平端。 四.简答题 1.简述限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)的概念及其生物学功能? 答:定义:指识别DNA 的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA 的一类内切酶。生物学功能:保护宿主不受外来DNA 分子的感染,可降解外来的DNA 分子,从而阻止其复制和整合到细胞中。 2. PCR 引物设计引入酶切位点时,为什么需在酶切位点后加上一些碱基? 答:限制酶切割DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度要求,也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸,否则限制酶将难以发挥切割活性。因此,一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加3~4 个碱基。 3. 试回答影响限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)切割效率的因素? 答:外因:反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性;内因:位点偏爱性;甲基化;底物的构象。 4. 在酶切缓冲液中,一般需加入BSA,请问加入BSA 的作用是什么?并简述其原理? 答:作用是提供一定的蛋白质浓度,起保护限制性内切酶的作用。限制性内切酶在稀释液中会迅速变性,BSA 是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。 5. 何谓Star activity?简述Star activity 的影响因素及克服方法? 答:在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特征称为星星活性。引起星星活性的的因素:①高甘油浓度(>5%);②酶过量(>100U/ml);③低离子强度(<25mM);④高pH (>8.0);⑤有机 溶剂如PMSD (二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide)和sulphalane 等;⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+ 代替Mg2+ 。星星活性的抑制措施:①减少酶的用量,避免过量酶切,减少甘油浓度;②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇;③提高离子强度到100~150mM (在不抑制酶活性的前提下);④降低反应pH 至7.0 ;⑤使用Mg2+ 作为二价阳离子。 6.大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ,具有3'--5’外切活性和5'--3' 的聚合酶活性以及5'--3' 的外切活性,试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途? 答:①利用E.coli DNA 聚合酶的5'--3' 外切核酸酶活性,可用切口平移法标记DNA ,所有DNA 聚合酶中只有此酶有此反应;②用于cDNA 克隆中的第二链,即单纯的DNA 聚合活性;③对3' 突出端的DNA 作末端标记(交换或置换反应)。 7. 用T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记,试简述其原理? 答:T4 phage DNA 聚合酶具有3'--5' 外切活性和5'--3' 的聚合酶活性,3'--5' 的外切活性可以被5'--3' 的聚合活性所封闭,首先在反应体系中加入一种dNTP ,产生3' 凹端,然后加入经过标记的dNTP ,利用T4 phage DNA 聚合酶的聚合活性补平3' 凹端,即可得到标记了末端的DNA 片断。 8. BAP 和CIAP 有何作用?为何一般采用CIAP 而不采用BAP ? 答:作用:催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。BAP 抗性强,抗高温和去污剂。CIAP 可用蛋白酶K 消化灭活,或在5mM EDTA 下,65℃处理或75℃处理10 分钟,然后用酚氯仿抽提,纯化去磷酸化的DNA ,从而去除CIAP 的活性。相比之下,CIAP 比BAP 更易去除,因此,一般采用CIAP 。 9. 依赖于DNA 的RNA 聚合酶包括SP6 噬菌体RNA 聚合酶和T4 或T7 噬菌体RNA 聚合酶,这类聚合酶可用于表达外源基因,阐述常用的构建策略? 答:①将T7 RNA 聚合酶基因置于E.coli lacUV5 启动子之下,插入到λ噬菌体中,感染E.coli ,建立稳定的溶源菌。E.coli BL21(DE3)菌株即为将lacUV5 启动子和T7 聚合酶基因置于λ噬菌体DE3 区,该λ噬菌体DNA 整合于染色体的BL21 处。若将T7 噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中,在IPTG 诱导下,可启动外源基因的表达;②先导入带T7 噬菌体启动子控制的目的基因的质粒,再用λ噬菌体(带T7 RNA 聚合酶基因)感染E.coli ,激活目的基因的表达。 10. 简述T4 多核苷酸激酶的活性和用途? 答:T4 多核苷酸激酶的活性催化A TP 的γ-磷酸基转移到DNA 或RNA 的5' 末端。可表现为两种反应,正反应指A TP 的γ-磷酸基被转移到去磷酸化的DNA 5' 端,用于对缺乏5'-磷酸的DNA 进行磷酸化。在交换反应中,过量的ATP 可使该激酶将磷酸化的5' 端磷酸转移给ADP ,然后DNA 从【γ-32P】ATP 中获得放射性标记的γ-磷酸而重新磷酸化,因此可用于DNA 的末端标记。用途:该酶主要用于对缺乏5'-磷酸的DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。通过交换反应,用于标记5' 末端,以供Maxam-Gilbert 法测序、S1 核酸酶分析以及其它须使用末端标记DNA 的步骤。 思考题问题:限制性内切酶可划分为哪几个类型,各自有何特点? 思考题问题:哪些酶可用于DNA片段的末端标记? 思考题问题:DNA 聚合酶有哪些类型,各有什么活性? 思考题问题:在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物? 第三章 一.名词解释 1. Vehicle载体。将外源DNA 或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具称为载体。具备以下三个必须元件:复制原点、多克隆位点和筛选标记。 2. Gene clone基因克隆。克隆作动词时,指从单一祖先产生同一的DNA 分子群体或细胞群体的过程;作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA 分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。利用重组DNA 技术分离目的基因,称之为基因克隆。 3. Gene library基因文库。由大量的含有基因组DNA(即某一生物的全部DNA 顺序)的不同DNA 片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。 4. Plasmid incompatibility质粒不相容性。利用同一复制系统的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性,它是指在第二个质粒导入后,在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 5.α-complementationα-互补。指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的α-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现的互补。这两个无酶学活性的产物混合在一起时,可恢复α-半乳糖苷酶的活性。 6. X-gal/IPTG两者都是乳糖的衍生物,X-gal:乳糖操纵子底物,可以作为生色剂,被α-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物,可使菌落呈现兰色;IPTG:乳糖操纵子诱导物。 7. lytic growth 裂解生长状态。噬菌体侵染宿主细胞后,大量复制并组装成子代噬菌体颗粒,导致宿主细胞裂解的现象称裂解生长状态。 8. lysogenic state溶源状态。噬菌体侵染宿主细胞后,将λ噬菌体基因组DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA 中,并随宿主的繁殖传给子代细胞的现象称溶源状态。 9. Multiplicity of infection感染复数。指单个宿主细胞感染的噬菌体颗粒数,等于实验所用的噬菌体与细胞的数量之比。 10. Insertion vectors 插入型载体。通过特定的酶切位点允许外源DNA 片段插入的载体称为插入型载体。 11. Replacement vectors置换型载体。而允许外源DNA 片段替换载体的非必须DNA 片段的载体,称为置换型载体。 12.Cosmid 粘粒。带有将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的cos 序列的质粒。包括质粒复制起点,可以象质粒一样转化并增殖;包括cos 位点,可以象噬菌体颗粒一样包装、侵染。 13. Replicative form DNA复制型DNA 。在宿主细胞内,感染性的单链噬菌体DNA (正链)在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA ,用于DNA 的复制,这种双链DNA 称为复制型DNA 。 14. Phagemid 噬菌粒。具有ColE1 复制起点及单拷贝的丝状体噬菌体主要基因间隔区的质粒载体。此基因间隔区含病毒DNA 合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必须的全部顺式作用序列。含phagemid 的细菌被噬菌体感染后,基因Ⅱ蛋白作用于间隔区,启动滚环复制产生ssDNA 并进行包装。 15. M13K07 help phage M13KO7 辅助噬菌体。M13 单链丝状噬菌体的衍生株,基因Ⅱ带有一个G--T 的突变。M13KO7 基因组双链DNA 可表达产生子代单链DNA 所必需的所有蛋白。M13K07 中突变的基因Ⅱ产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUCll8 和pUCll9 中的病毒复制起点的作用有效,可以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA 能够占据优势。 16. Y east artificial chromosomes 酵母人工染色体载体。利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色体的复制元件来驱动外源DNA 片段复制的载体称为酵母人工染色体载体。由自主复制序列、着丝粒、复制子及选择标记等元件组成。 17. Bacterial artificial chromosomes细菌人工染色体。是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高通量低拷贝质粒载体。包括严谨型控制的复制区oriS 、启动DNA 复制的由A TP 驱动的解旋酶((RepE),以及三个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因座(parA,parB 和parC)等元件)。 18. P1 artificial chromosomes P1人工染色体载体。结合了P1 载体和BAC 载体的特性,是P1 噬菌体载体的改进载体。重组分子不能通过体外包装来感染宿主细胞,而只能通过电转化来将重组分子导入宿主细胞。 19. Shuttle vector 穿梭载体。能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体称为穿梭载体。 二.填空题 1.载体(V ehicle)的类型有(质粒载体),(噬菌体载体),(粘粒载体),(噬菌粒载体)等。 2.Gene cloning 是指(利用重组DNA技术分离目的基因),基因文库(Gene library)是指(由大量的含有基因DNA(即某一生物的全部DNA顺序)的不同DNA片段的克隆所构成的群体)。 3. Plasmid 的定义是(染色体外的遗传因子),Plasmid 能进行自我复制,大多数为(双)链(闭环)状DNA 分子,大小一般为(1~200)kb。 4. (单个细胞中所含有的质粒DNA 分子数目)即为质粒的拷贝数,按照质粒拷贝数的多少,质粒可以分为(严谨型)和(松弛型),(严谨型)质粒多数是一些具有转移能力的大质粒;(松弛型)质粒多数是一些不具有转移能力的小质粒。 填空题松弛型质粒和严谨型质粒融合以后,杂合质粒一般优先使用()的复制子。松弛型 继续阅读