胰岛素原C肽作用机制

胰岛素原C肽作用机制 ( ) 文章编号 :100021336 20010220099204 胰岛素和 C 肽 ,然后分泌并进入血液 。C 肽 的种族差 异 很 大 , 其 中 人 C 肽 含 31 个 氨 基 酸 。在胰岛 素 原 分 子 中 C 肽 对 胰 岛 素 原 分 胰岛素原 C 肽作用机制 子的折叠 、二硫键的正确配对等分子结构的 形成起重要作用 ,而血液中游离 C 肽的生理 刘智慧 崔大敷 ( )中国科学院生物化学与细胞生物学研究所 ,上海 200031 功能却一直不清楚 。近来的研究发现 ,给予 I 型糖尿病大鼠超生理剂量的人 C 肽配伍胰 1 关键词 : C 肽 ;糖尿病并发症 ; G 蛋白偶联受体 岛素治疗 ,能防止血管 、神经机能障碍,长 中图分类号 : Q58() 期 3 个月给予胰岛素配伍 C 肽 , 可使 I 型 糖尿病病人减少尿白蛋白排泄率 ,改善肾功 2 C 肽是胰岛素原中连接 AB 两条链的连 能和自主神经及感觉神经障碍。C 肽的这 + β 接肽 。在胰岛细胞分泌颗粒中 ,胰岛素原 些改善糖尿病并发症的作用与其刺激 Na , + 经蛋 白 酶 裂 解 , 形 成 等 摩 尔 由 AB 链 组 成 的 K 2A TPase 和 内 源 NO 合 酶 的 活 性 相 3 ,4。关 收稿日期 :2000212208 1 . C 肽及其类似物对血管功能的影响 ( ) 作者 简 介 : 刘 智 慧 1972 —, 男 , 博 士 生 ; 崔 大 敷用 30 mmol/ L 葡萄糖诱导皮室肉芽组织 ( ) 1941 —,女 ,研究员 。( 模型 从大鼠后腿下部任一侧取下一块直径 3 . 3 染色质重塑复合物影响核小体构型的研究基因的表达调控 ,染色质重塑是这个过 SW I/ SN F 引 起 的 A TP程的第一步 。将来有关的研究将主要集中在 可能 机 制有 关 () 以下几个方面 : 1新的染色质重塑复合物及 依赖的 染 色 质 重 塑 机 制 目 前 有 以 下 几 种 模 () () 其亚基的发现并了解其性质 、功能 。2基因 型 : 1SW I/ SN F 可能引起组蛋白 H2A2H2B ( ) () 特异的染色质重塑机制 。3染色质重塑的 二聚体同核小体的解离或重排 ; 2引起组蛋 ( ) ( ) 具体过程 。4染色质重塑与乙酰化修饰的 白八 聚 体 的 构 象 变 化 ; 3 SW I/ SN F 利 用 ( ) 协同关系 。5异染色质 、中心粒 、端粒及许 A TP 水解的能量使组蛋白与 DNA 解聚 , 复 多核过程中染色质结构变化与染色质重塑复 ( ) 合物 本 身 沿 DNA 链 移 动 ; 4 SW I/ SN F 与 合物的关系 。 核小体直接结合 ,利用 A TP 水解的能量改变 最终完全了解基因在适时 、适当位置开 DNA 的缠绕方式或把 DNA 从八聚体表面削 2 关的机理以及染色质 、染色质重塑复合物在 下而不影 响 组 蛋 白 八 聚 体 的 结 构。近 期 各项生命活动中所起的作用 。 的 一 些 研 究 倾 向 于 支 持 第 四 种 模 型 , 认 为 SW I/ SN F 利用 A TP 水解的能量使组蛋白与 参 考 文 献 DNA 解聚并与组蛋白八聚体一起沿 DNA 双 () MuchardCt et al . J M ol B iol ,1999 ,2932 :187— 198 1 螺旋随机转位 , 从而整个 DNA 双 链 上 的 位 () DallasP B et al. Mol Cell Bio,l200 0 ,2 09:3137 —31462 点都有机会和其它因子接触 ,呈现开放状态 。 () LaurentB C et al. Mol Cell Bio,l199 2 ,1 24:1893 —19023 在 A TP 和 SW I/ SN F 存在的情况下 ,多核小 () Tsukiyama T et al . Cell ,1995 ,836 :1011— 10204 () PazinM J et al . Cell ,1997 ,886 :737— 740体重塑表现为组蛋白八聚体在 DNA 上不断 5 () Krebs JE et al . Cell ,2000 ,1025 :587— 5986 转位的动态过程而单核小体重塑则表现为组 ( ) Lee CH et al . Proc N at l A cad S ci U S A , 1999 9, 6 22 : 7 9 ,10。蛋白八聚体滞留在 DNA 两端 12311— 12315 4 . 尚待研究的问题及研究前景() Lo gie C et al . B iochem, 1999 ,388 :2514— 25228 随着人类基因组的趋近尾声 ,功能 () BoyerL A et al . J B iol Chem ,2000 ,275 16:1154—11555 29 () J askelioffM et al . M ol Cell B iol ,2000 ,209 :3058— 306810 基因组计划逐渐展开 。其主要内容之一即是 约 2 cm 的圆形皮肤并将其边缘缝在塑料小,而是类似是与立体专一性受体结合起作用 ) 室上 ,一周后用于实验形成血管机能障碍 , 于抗菌肽如 cecropins ,非手性地与膜脂质作 1 用来行使其生理功能。 即血流量改变 ,然后给予 100 nmol/ L 浓度的1 + + 2 . C 肽及其类似物对 Na , K2ATPa se 活性 C 肽及其类似物 ,观测这些肽的活性。结 果显示 ,大鼠 C 肽和人的 C 肽活力相似 ,这 影响- 8- 6 可能与二者之间序列的高度同源性有关 ; 反 大鼠 C 肽在浓度 10 ,10 mol/ L ,同时 + 向氨基酸顺序的 C 肽效果与天然 C 肽几乎 Na 处于不饱和浓度时 ,能够增强正常大鼠肾 + + 5 一样 ;顺序打乱但氨基酸组成与天然 C 肽一 小管 Na , K2ATPase 活性。Ohtomo 等人 致时没有活力 ; 均由 D 型氨基酸构成的人 C 利用 合 成 的 大 鼠 C 肽 及 其 类 似 物 , 通 过 + + 肽 ,在放射 免 疫 分 析 中 , 对 天 然 C 肽 识 别 灵 研究其对正常大鼠近曲小管 Na , K2ATPase3 敏度高达 10 p mol/ L 的多克隆抗体无法识别 活性的影响 ,以确定其活性部位。结果显示 1 nmol/ L 的 D 型 C 肽 ,但其功效仍与天然 C 其 C 端是一个活性部位 ,其 C 端 4 肽和 5 肽有 1 ( 92 %和 103 %的 活 力 相 对 于 完 整 的 C 肽 分 肽一致 ,具体见图 1 。因此 , Ido 等人认为 ) () 决定 C 肽生物活性的是氨基酸排列顺序 ,而 子,而去 27,31后的 C 肽则无活力 。合成 ( )非肽键的方向或手性 ,从而提出 C 肽可能不 , 其 中 两 个 残 基的 人 C 端 5 肽 EGSLQ () 图 1 皮室肉芽组织中 ,人 C 肽及其片段对 30mmol/ L 葡萄糖诱导血管机能障碍 血流量的调节 100nmol/ L 肽与 30 mmol/ L 葡萄糖同时供给 。效力以 100nmol/ L 人 C 肽作 用 的 百 分 数 表 示 。因 为 各 肽 在 降 低125 30 mmol/ L 葡萄糖诱导的I2白蛋白渗透性升高及血流量增大这两方面是等效的 ,因此图中只显示血流量 。柱右 ( ) 侧括弧中数字为实验用皮室数目 。 〃,与仅用 30 mmol/ L 葡萄糖处理的大鼠有显著不同 P < 0 . 05。 ( ) 与鼠的 C 端 EVA RQ 相同 , 具有 75 %的活 、D2L G 和 L2L G 对该膜制剂没 EL GGGP EA G 力 。非末端的中部序列相对于完整的 C 肽 , 有激 活 作 用 , 证 明 C 肽 并 非 直 接 作 用 于 + + 具有 35 %, 80 %的 活 力 。中 部 的 2 个 或 3 Na , K 2A TPase , 而 是 间 接 的 , 可 能 是 通 过 + + 3 个 Gly 序列仅轻微刺激 Na , K 2A TPase 活 受体的途径。 性 ,非天然的 2 、3 、4 或 5 个 Ala 序列无可测 3 . C 肽与 G 蛋白偶联受体得的活力 ,但 D2L G 却有 72 %的活性 ,具体见 肾小管用百日咳毒素预先处理 ,则 C 肽 3 表 1 。 + + 增强肾小管 Na , K 2A TPase 活性的能力被 + + Ohto mo 等 人 制 备 了 Na , K 2A TPase 2 + ( 阻断 ,当有 F K506 Ca 2钙调蛋白依赖的磷 肽 是 否 直 接 作 用 于C , 以 证 明的膜 制 剂 ) + 酸酶 2B存在时 ,也出现这种情况 。以上结Na , + + + 果暗示 C 肽刺激 Na , K 2A TPase 活性 , 可 K 2A TPase , 结 果 显 示 大 鼠 C 肽 、EVA RQ 、 能是通过激活与对百日咳毒素敏感的 G 蛋 2 + 白偶联的受体以及 Ca依赖的细胞内信号 表 1 完 整 C 肽 , C 肽 片 段 , 非 天 然 的 短 肽 片 段 以 + + 5 及对照组对大鼠肾小管细胞Na , K2ATPase 活力的 ( 传导 途 径。通 过 荧 光 相 关 光 谱 fluo res2 影响 ) cence co rrelatio n spect rocop y技术 ,有人研究 + + 肽与氨基酸 , K 2A TPase 活性 Na 6 了 C 肽与细胞膜的结合 。在单分子检 测 - 7 ( ) ( )高于对照 %与鼠 C 肽 1 比% ( ) 5 ×10 mol/ L 100 鼠 C 肽 1 ?1 . 8 44 . 9 灵敏度的情况下测定配体与膜的结合 ,发现 鼠 C 肽 2 51 . 4 ?2 . 5 114 了荧光标记的 C 肽 特 异 地 结 合 于 几 种 人 细 2 随机序列 0 . 9 ?1 . 3 (胞表面 四甲基若丹明标记 ,通过琥珀酰亚胺 G 0 0 . 1 ?2 . 8 L 1 0 . 6 ?0 . 8 ) 酯衍生物连接,并且在低纳摩尔浓度下与细 3 EL G EL 1 . 2 ?2 . 0 胞表 面 的 结 合 就 达 到 了 饱 和 。Scatchard 作 36 GG EL 16 . 3 ?1 . 6 GGG 36 16 . 1 ?0 . 6 图它与肾小管细胞的结合 ,显示存在高 EL GGGP 46 20 . 5 ?0 . 8 9 - 1 ( ) 亲和力 , K> 3 . 3 ×10mol/ L 。过量未 ass 80 EL GGGP EA G 36 . 1 ?0 . 9 标记的 C 肽可以竞争下来荧光标记的 C 肽 , 76 EL GGP EA GDL Q 33 . 9 ?3 . 9 - 4 - 1 EL GGGPEAGDLQ TLAL E 78 34 . 8 ?7 . 7 解离常数为 4 . 5 ×10 s 。C 端五肽同样 EV ED 4 1 . 7 ?2 . 3 可以取代膜结合的 C 肽 ,表明该片段为配体 L AL GP 35 15 . 8 ?2 . 2 1 E 0 . 6 ?2 . 7 的膜结合部分 。顺序打乱但氨基酸组成与天 103 EVARQ 46 . 3 ?1 . 1 然 C 肽一致以及 D 型 C 肽不能竞争膜结合 92 VARQ 41 . 3 ?3 . 6 的荧 光 标 记 的 C 肽 。同 样 , 胰 岛 素 、I GF2I 、 75 E GSL Q 33 . 6 ?2 . 9 ( ) 2 去 27,31C 肽 1 1 . 0 ?2 . 8 I GF2I I 和胰 岛 素 原 也 不 能 竞 争 膜 结 合 的 荧 16 GG 7 . 0 ?2 . 8 光标记 C 肽 。从 C 肽与培养的肾小管细胞 、 GGG 13 5 . 9 ?3 . 8 AA 0 - 1 . 8 ?1 . 6 皮肤成纤维细胞和隐静脉的内皮细胞结合来 AAA 1 0 . 3 ?3 . 2 看 ,肾小管细胞单位细胞表面积结合位点最 L2GL 9 4 . 1 ?1 . 9 D2GL 0 多 。相反 , 脐 带 血 管 内 皮 细 胞 不 与 C 肽 结 - 1 . 2 ?1 . 1 L2L G 1 0 . 5 ?1 . 2 合 ,这与 C 肽能够刺激主动脉内皮细胞 NO 72 D2L G 32 . 3 ?4 . 0 合酶活性 ,而对脐带血管内皮细胞 NO 合酶 63 D ,L2L G 28 . 3 ?0 . 9 4 )( 63 L2L G + D2L G11? 28 . 4 ?0 . 4 ( 活性无影响是一致的。用百日咳毒素 已 6 Ac G 2 . 6 ?2 . 1 ) 知它可以修饰 G 蛋白偶联受体处理细胞 , 1 AcL G 0 . 6 ?3 . 3 3 AcQ 则这种结合停止 , C 肽结合到人细胞膜 1 . 2 ?1 . 4 6 Ac E 2 + 2 . 7 ?3 . 2 G 蛋白偶联受体 ,然后激活 Ca依赖的细胞 SF 2 . 9 ?3 . 5 6 + + 内信号通道 , 导 致 增 强 Na , K 2A TPase 和 表上为平均值 ?SEM 。每组数据代表来自三只不同的 大鼠肾小管 6,10 个片段 ,18,30 次测量的平均值 。 内源 NO 合酶的活性 。但目前的发现并不排 除超生理剂量的 C 肽 可 能 与 膜 脂 质 作 用 发,而是在 不 同 时 间 洗 脱 下 来 , 这 说 明 C 肽移 6 挥功能。 用同 位 素 标 记 的 方 法 分 析 配 体 不会和脂囊结合 。以上 CD 和凝胶过滤柱层 受 体 结 析的结果都说明 C 肽 并 非 在 膜 脂 质 上 形 成 125 合 ,即在 C 肽 N 端加上I 标记的 Tyr ,看它 离子通道发挥作用 ,这与 C 肽序列本身不含 与肾小管细胞的结合 ,结果检测不到这种结 有能够形成通道的肽的特征是一致的 。可能 合 ;而用 FCS 技术能够检测到这种结合 。这 C 肽可以与膜或膜蛋白发生瞬间的作用以调 说明用 FCS 分析方法比放射性标记更加灵 节它们的功能 ,但上面的数据表明生理浓度 67 。 下 C 肽与膜不可能形成稳定的物理联系。 敏 4 . C 肽与脂囊和脂微团的作用与脂囊和脂微团作用的实验说明 , C 肽 在 Ido 等人提出 C 肽可能通过非手性地 不是通 过 和 膜 的 非 手 性 作 用 发 挥 生 理 作 用 1 与膜脂质作用发挥生理功能后不久 ,就有 的 ,尽管它在超生理浓度下可能与膜发生瞬 7 人采 用 人 工 模 拟 细 胞 膜 的 方 法 来 验 证。 间的作用 。而荧光相关光谱技术得到的数据 7 他们制备了表 2 所示的脂囊和脂微团 , 其 支持了 C 肽通过膜 结 合 的 受 体 立 体 专 一 性 结合 起 作 用 。从 C 肽 及 类 似 物 对 肾 小 管 中相对的脂浓度以质量百分比表示 , PC 为磷 + + 脂酰胆碱 、P G 为磷脂酰甘油 、PS 为磷脂酰丝 Na , K 2A TPase 活 性 影 响 , 显 示 C 端 五 肽 氨酸 、L PC 为 溶 血 磷 脂 酰 胆 碱 、L PS 为 溶 血 具有完整 C 肽的活性 ,与其它生物活性肽类 似 ,很可能 C 端 五 肽 是 受 体 结 合 部 位 ; 中 间 磷脂酰丝氨酸 ,含有溶血磷脂的混合物形成 脂微团 ,其它的混合物形成脂囊 。为了证明 段肽有一 定 的 的 活 性 , 但 没 有 C 端 强 , 而 去 () 27, 31后的 C 肽则无活力 , 中间包含 Gly C 肽是否插入脂双层形成离子通道 ,他们用 ( ) 部分在少于 10 个残基时有活性 ,但随着向 N 圆二色散 CD技术研究 C 肽与脂囊/ 脂微团 7 存在前后 的 二 级 结 构 是 否 发 生 变 化。结 端或 C 端 延 伸 , 活 力 降 低 , 这 不 是 典 型 的 受 果显示 C 肽在水中以及在含有不同脂囊/ 脂 体作用方式 ,说明 C 肽可能通过几种复杂模 3 式或间接方式发挥作用。 微团的溶液中 ,其 CD 光谱没有明显的变化 , 即二级结构无变化 ,这说明 C 肽不会插入脂 总之 , C 肽联合胰岛素能够改善 I 型糖 双层 ,否则它从极性溶液进入非极性膜时二 尿病大鼠糖尿病并发症以及 I 型糖尿病病人 8 肾功能和自主神经及感觉神经障碍等糖尿病 级结构将发生变化。C 肽与由 PCP?S = 41? 并发症 ,说明 C 肽有望成为治疗糖尿病并发 和 10 %胆固醇组成的脂囊在 p H 5 条件下混 合 ,上凝胶过滤柱 ,C 肽与脂质体没有同时迁 症的药物 ,将为广大糖尿病患者带来福音 。 表 2 用来研究 C 肽/ 脂类相互作用的脂囊和脂微 参 考 文 献 团组成 ( )组成成分 % 混合物 1 Ido Y et al . S cience, 1997 ,277 :56—356 6 PC P G 胆固醇 PS L PC L PS () 2 JohanssonB L et al . Di abet M ed ,2000 ,173 :181— 189PC 100 3 Ohtomo Y et al . Di abetolog ai ,1998 ,41 :28—7 29110 PC + 10 %胆固醇 90 () 4 Forst T et al . Cli n S ci ,2000 ,983 :283— 290P G 100 10 P G + 10 %胆固醇 90 5 Ohtomo Y et al . Di abetolog ai ,1996 ,39 :19—9 205PS 100 ( ) 6 Rigler R et al . Proc N at l A cad S ci U S A , 1999 9, 6 23 : 90 10 PS + 10 %胆固醇 13318— 13323)( 80 20 PCP?G 41? ) (10 PCP?G 41?+ 10 %胆固醇 72 () 18 7 HenrikssonM et al . Cell M ol L if e S ci ,2000 ,572 :337— 342)( 80 20 PCP?S 41? 8 GieraschL et al . B iochem ist ry ,1989 ,28: 923 —93010 PCP?S + 10 %胆固醇 72 18 ( )L PCL?PS 41? 80 20 ) ( L PCL?PS 41?+ 10 %胆固醇 72 18 10