农药残留检测方法

农药残留检测方法 蔬菜中农药残留检测方法汇总 2010-01-28 15:30:48 来源:实验室设备信息网 浏览:40 次 农药残留监测体系的建立，对农药残留的监测手段和检测水平提出了更高要求，并促进了农药残留快速检测方法的研究和应用进展，使农药残留检测技术朝着更加快速方便、灵敏可靠的方向发展，逐渐以农药残留专业检测机构的少量检测为中心，向现场检测及实验室的大量检测辐射。 1 仪器分析法(Apparatus Analysis) 1.1 固相萃取技术(Solid Phase Extraction，SPE) 固相萃取法是1种基于液相色谱分离机制的样品制备方法，已广泛应用于农药残留检测工作。它根据液相分离、解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱子后，样品中某一组分保留在柱中，选择合适的溶剂把保留在柱中的组分冼脱下来，从而达到分离、净化的目的。SPE克服了液-液萃取技术及一般柱层析的缺点，具有高效、简便、快速、安全、重复性好、便于前处理自动化等特点。根据柱中填料大体可分为吸附型(如硅胶、大孔吸附树脂等)、分配型(C8，C 18、苯基柱等)和离子交换型。R.Rodriguez等人采用固相萃取法通过改变移动相中缓冲液的浓度、pH值、表面活性剂的浓度和类型对蔬菜中的木精、笨基苯酚、锑比灵和有机磷残留量进行分析，结果表明:pH9.2，缓冲液中含有4mmol/L硼酸和75mmol/L胆酸钠能够得到最好的结果。 1.2 固相微萃取(Solid Phase Micro-extraction，SPME) 加拿大Waterloo大学Pawliszyn 1990年首创的一种无需溶剂的萃取技术，它是在固相萃取的基础上发展起来的一种新型的预处理技术。SPME技术由固相萃取技术(SPE)发展而来，对目标化合物有较好的选择性，并且有较高的灵敏度，适用于微量、痕量分析。到目前为止，SPME在农药残留分析上的应用70%以上集中于有机氛、有机磷和三嗪类农药，60%以上集中于水环境样品，也有涉及蔬菜、土壤、生物等基质。H.Berada等人应用固相微萃取法对胡萝卜、洋葱和土豆3种蔬菜12个标样中利谷隆和精胺残留量进行检测，发现仅有土豆3种标样的残留含量低于最大残留量。 1.3 微波辅助萃取(Micro-wave Assistant Extraction，MAE) 利用不同的化学物质吸收微波的能力不同，对样品进行处理，MAE技术是惟一可以使所需组分直接从基体浸出的萃取方法。该技术是对样品进行微波加热，利用极性分子可迅速吸收微波能量的特性来加热一些具有极性的溶剂，达到萃取样品中目标化合物、分离杂质的目的。与传统的振荡提取法相比，微波辅助萃取蔬菜中农药残留量具有高效、安全、快速、试剂用量少和易于自动控制等优点。ShashiB.Singh等人应用微波辅助萃取法对甘蓝和土豆中统扑净和汽 75%，而统扑化器进行分析，发现气化器恢复度在69%, 净却没有恢复。 1.4 气相色谱法(Gas Chromatography，GC) 气相色谱法是利用试样中各组分在气相和固定相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次分配，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱 峰。使用气相色谱法，多种农药可以一次进样，得到完全的分离、定性和定量，再配置高性能的检测器，使分析速度更快，结果更可靠。目前气相色谱法多采用填充毛细管。Alfono Di Muccio等人应用气相色谱法对蔬菜中的拟除虫菊酯的残留量进行检测，方法简单，省时，可以对几个标样同时进行分析。 1.5 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chro matography，HPLC) 高效液相色谱法也是1种传统的检测方法。它可以分离检测极性强、分子量大的离子型农药，尤其适用于对不易气化或受热易分解农药的检测。近年来，采用高效色谱柱、高压泵和高灵敏度的检测器、柱前或柱后衍生化技术以及计算机联用等，大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度，现已成为农药残留检侧不可缺少的重要方法。Mohammde等人应用高效液相色谱法对黄瓜、茄子、辣椒和西红柿4种蔬菜瓜果中CM的残留量进行检测，发现黄瓜由于生长速度快，使得CM在其中残留量的消失时间短于其他3种。 1.6 超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE) SFE技术于1986年由Capriel等应用于农药残留分析，目前应用于植物样品、动物组织、果实、土壤、水等样品中多种杀虫剂、杀菌剂和除草剂的萃取。SFE主要是以超临界流体代替各种溶剂来萃取样品中待测组分的萃取方法。目前最常用的超临界流体为CO2，它兼有气体的渗透能力和液态的分配作用，流出液中的CO2在常压下挥发。待测物用溶剂溶解后进行分析。也可以加入适量极性调节剂，如甲醇、乙醇、丙醛等来调节其极性，据此可最大限度地提取不同极性的农药残留而最低限度地减少杂质的提取。其特点是避免了使用大量的有机溶剂、提高萃取的选择性、减少了分析时间、实现操作自动化。Noboru Motohashi应用超临界流体萃取技术对蔬菜、瓜果、土壤和生化织品中有机农药进行测定，发现其是一种理想的分离方法。 1.7 分子印迹合成受体技术(Molecular Imprinting Syn thetic Receptor，MISR) MISR原理是:将模板分子(待分离、识别的分子)同具有适合官能团的功能单体相互作用，在交联剂和引发剂的作用下形成具有大孔、网状的聚合物，通过溶剂洗脱或在一定条件下水解除去模板分子，聚合物中就留下了空间、形状及官能基团与原来模板分子完全匹配的“记忆”空穴，这样的空穴便可以与混合物中待分离的分析物进行可逆的特异性结合，从而达到分离、纯化、富集的目的。分子印迹技术可以用于药物、激素、蛋白质、农药、氨基酸、多肤、碳水化合物、辅酶、核酸碱基、甾醇、涂料、金属离子等各种化合物的分离工作。Hui Sun等人采用分析印迹合成受体技术对蔬菜中抗蚜威进行分析，当抗蚜威的浓度在8.0×106,2.0×104mol/L时，理想的恢复度在96%,103%，重现率(n=5)为4.6%,7.1%。 1.8 毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE) 毛细管电泳技术是在电泳技术的基础上发展的1种分离技术。其工作原理是使毛细管内的不同带电粒子(离子、分子或衍生物)在高压场作用下以不同的速度在背景缓冲液中定向迁移，从而进行分离。自20世纪80年代Jorgenson把CE应用于分析化学以来，这一技术已发展成为分离科 学中最活跃的领域之一。它具有灵敏度高、耗资少、样品消耗量很小(每次进样只是纳升级)、分离柱效高、使用方便等优点，非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析，其分离效率可达数百万理论塔板数。R.Rodriguez等人用毛细管电泳对草莓、西红柿、梨子、苹果、葡萄和桔子中的涕比灵残留量进行分离，当甲酸胺和蚁酸缓冲液的pH值3.5和含有2%甲醇时，分离效果达到75%。Fanggui Ye等人用加压毛细管电泳法对甘蓝中拟除虫菊酯残留进行分析，在最佳的缓冲液浓度、pH值、有机溶剂的条件下，能够在20min内分离6个标样。 2 酶抑制法 酶抑制法是研究最多且相对成熟的1种对部分农药进行残留快速检测技术。酶抑制法是利用有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，破坏神经的正常传导，使昆虫中毒致死这一毒理学原理，将AChE与样品反应，根据AChE活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有有机磷与氨基甲酸酯类农药。但是酶抑制法测定样品和农药种类有限，目前只用于蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药的 残留检测，且不能给出定性和定量结果。AmadeoR.FernandezAlba在对辣椒中procymidone残留量进行研究发现，和气相色谱法相比同时检测下限在8μg/kg，但是低于2μg/kg却只能用酶抑制法。 3 生物传感器法 生物传感器法是目前农药残留速测技术中的研究热点，生物传感器是生物反应技术与传感技术有机结合的产物，是用生物活性物质如酶、抗体、抗原、细胞等作识别元件，配以适当的物理或化学信息转换器所构成的分析工具。传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的分析物之间如酶与底物、抗体与抗原、外源凝集索与糖、核酸与其互补片段之间的识别反应会产生一些物理化学信息如光、热、声、颜色、电化学等的变化，这些变化通过不同原理的传感器如光敏答、压电装置、热敏电阻、离子选择性电极等转换成第一信号，经仪表放大显示，从而达到分析监测的目的。用于研究农药残留检测的生物传感器所使用的生物物质主要为酶、全细胞、细胞器、受体或抗体等，相应有酶传感器、全细胞传感器和免疫传感器等，尤其是免疫传感器的应用可大大提高检测灵敏度并大大缩短了检测时间。Ashok MulChanda ni等采用有机磷水解酶结合电化学、光学转换器检测有机磷农药，可达到快速、简单、灵敏、高效。 4 免疫分析法 免疫分析法就是基于抗原抗体的特异性识别和结合反应为基础的分析方法。分子量大的农药可以直接作为抗原免疫动物，动物的免疫系统对进入体内的异源大分子量物质发生保护性应答反应。分子量小的农药(MW<2500)一般不具备免疫原性，不能刺激机体产生免疫反应，但有与相应抗体在体外发生吸附反应的能力，即有反应原性，这类小分子物质在免疫学上称为半抗原。将农药小分子以半抗原的形式连接到分子量大的载体蛋白上，形成农药载体蛋白结合物免疫原，即人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对该农药具有特异性的活性物质——免疫球蛋白(即抗体)，来识别该农药分子与之结合，这种反应不仅可在体内进行，也可在体外进行。它集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一体，在某些重要生物活性物质(如蛋白质、激素、药物等)的痕量检测方面取得了很大成就。免疫分析法可分为荧光免疫测定法、酶免疫测定法、放射免疫测定法和流动注射免疫测定法，其中流动注射免疫分析是 农药残留分析中较为先进的技术。Eiki Watanabe等人用酶免疫测定法对黄瓜、茄子、生菜、菠菜和辣椒中亚胺残留量进行分析表明:相对高效液相色谱法其无须清洗，省时、重现率好等优点。 5 活体检测法 活体检测法是使用活的生物直接测定。如农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，通过测定细菌发光情况，则可测出农药残留量。又如农药残留会导致家蝇中毒，使用敏感品系的家蝇为，用样本喂食敏感家蝇后，根据家蝇死亡率便可测出农药残留量，一般在4,6h内可测出蔬菜是否含超量农药。但该法只对少数药剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低。使用家蝇检测蔬菜中的农药残留，过程简单，无须复杂仪器，农户便可自行检测，缺点是检测时间较长，仅适于田间未采收的蔬菜。 6 实验室机器人 实验室机器人现已商品化，但在农药残留量分析和环境监测方面的应用还处于起步阶段，主要是因为机器人工作程序的变更缺乏灵活性和实验室检测方法缺乏标准化所造 成;另外，机器人系统动作缓慢，一般要求宽阔的空间。当实验室机器人变得更方便、灵活，实验方法也更加标准化时，它的使用将会增加。Baoxin Lin应用人造神经网络标尺在连续发光的前提下对蔬菜中的有机磷进行分析，当有机磷被分解成正磷酸盐时，正磷酸盐能够与钼酸生成分子结构不同的物质，从而来氧化发光胺来产生不同强度的光谱，通过检测光谱强度来确定残留量，该种方法已成功的应用于3种蔬菜标样中有机磷残留量的测定。 农产品农药残留检测技术 首先～无公害农产品生产过程中控制的重点是农药使用。一是品种控制～二是安全间隔期的控制。其次～无公害农产品标准中检测的重点是农药残留,种植业产品,。 一、农药残留检测技术类别 1.农药残留的生物测定技术 利用指示生物的生理生化反应来判断农药残留及其污 染情况。例如～可以用实验室养的敏感性家蝇为测定材料～以其接触待测样品后的中毒程度来表示该样品中的杀虫剂残留,以病菌生长受抑制的程度来检测杀菌剂的残留～以玉米或其它指示植物根长受抑制的程度来检测土壤中磺酰脲类除草剂残留等。该方法无需对样品前处理比较简单快速或无需进行前处理～但对指示生物要求较高～测定结果不能确定农药品种～并且可能出现假阳性或假阴性的情况～该方法可作为快速检验方法用于农产品引起中毒或在现场使用。 2.农药残留的理化检测 用于农药残留的化学检测方法有分光光度法、极谱法、原子吸收光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、色质联用法等。自二十世纪九十年代以来～现代化学分析技术日新月异～许多新技术已进入实用阶段～如毛细管电脉仪技术,CZE,～色质联用技术,GC-MS、HPLC-MS,超临界流体色谱技术,SFC,～直接光谱分析技术等。这些新技术的应用～大大提高农药残留分析的灵敏度～简化分析步骤～提高了分析效率。但是～这些分析方法有的灵敏度不高～如分光光度法、薄层层析法等。有的需要昂贵的仪器～如色质联用法、核磁共振波谱法等。还有的需要特殊的设备～如同位素标记法等。因此～目前～普遍采用的还是气相色谱法和液相色谱法～它们具有简便、快速、灵敏以及稳定性和重现性好～线性范围宽、耗资低等优点。 ,1,气相色谱法,GC, 采用气体作流动相的色谱法～用于挥发性农药的检测～ 具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速和特点～是农药残留量检测最常用的方法之一～目前用于农药残留检测的检测器主要有电子捕获检测器,ECD,、微池电子捕获检测器,u-ECD,、火焰光度检测器,FPD,、脉冲火焰光度检测器,P-FPD,、氮磷检测器,NPD,等。 ,2,液相色谱法,HPLC, 采用液体作流动相的一种色谱法～它可以分离检测极性强、分子量大及离子型农药～可用于不易气化或受热易分解的农药的检测。近年来～采用新型高效固定相、高压泵和高灵敏度的检测器～柱前和柱后衍生技术、以及计算机联用等～大大提高了检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度。目前用于农药残留检测最多是紫外吸收检测器,UV,、两极管阵列检测器,DAD,和荧光检测器,FLD, ,3,色质联用法,GC-MS,HPLC-MS, 气相或液相与质谱联用～它既具备了色谱的高分离效能优点～而且具备了质谱准确鉴定化合物结构的特点～可同时达到定性、定量的检测目的～特别适合于农药代谢物、降解物的检测和多残留检测等～不过此法需要贵重仪器且操作繁杂困难～不适合于经常性的检测。一般可用来做最后的确认工作。 ,4,超临界流体色谱,SFC, 是以超临界流体作为流动相的色谱体系～超临界流体是指物质处于临界温度和临界压力时的状态～介于气、液态之间～兼有气体和液体的某些物理特性～因此～超临界流体色谱既有气谱的快速、高效、灵敏的特点～又有能检测对热不 稳定和大分子化合物的液谱的特点。 ,5,毛细管电泳法,CE, 该方法是利用毛细管及高电压(15-30KW)分离各种农药残留物～非常适合于一些难于用传统色谱法分离的离子化样品的分离和分析～比HPLC有高10-1000倍的分析能力～而且所需之缓冲液具有不危害环境之特点～在短时间(30分钟)内就可以完成定性及定量分析。 3.常用农药残留的快速检测方法 ,1,酶抑制法:有机磷与氨基甲酸酯农药共为神经系统乙酰胆碱脂酶抑制物～因此可以利用农药靶标酶-乙酰胆用碱酯酶,AChE,受抑制的程度来检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。该方法目前已开发出了相应的各种速测卡和速测仪。该方法检测时～蔬菜中的水份、碳水化合物、蛋白质、脂等物质不会对农药残留物的检测造成干扰～不必进行分离去杂～节省了大量预处理时间～从而能达到快速检测的目的～因此该方法具有快速方便、前处理简单、无需仪器或仪器相对简单～适用于现场的定性和半定量测定～目前的农药残留快速检测就是用了该方法～已上升为农业部行业标准。但该方法只能用于测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂～其灵敏度和所使用的酶、显色反应时间和温度密切相关～经酶法检测出阳性后～需用标准仪器检验方法进一步检测～以鉴定残留农药品种及准确残留量。 ,2,免疫分析法:有放射性免疫分析、酶免疫分析、多组份分析物免疫分析、免疫传感器分析等。最为常用的是酶联免疫法,ELISA法,～它主要是以抗原与抗体的特异性、 可逆性结合反应为基础的农药残留检测方法。该法利用化学物质在动物体内能产生免疫抗体的原理～先将小分子农药化合物与大分子生物物质结合成大分子～做成抗原～并使之在动物体内产生抗体～对抗体筛选制成试剂盒～通过抗原与抗体之间发生的酶联免疫反应～依靠比色来确定农药残留～它具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点～试剂盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测～可准确定性、定量。但由于受到农药种类多～抗体制备难度大、在不能肯定样本中的农药残留种类时检测有一定的盲目性以及抗体依赖国外进口等影响～酶联免疫法的应用范围受到较大的限制～目前～我国市场上酶联免疫法成品试剂盒依赖从国外进口。 ,3,化学法—速测灵法 “速测灵”法应用的原理是具有强催化作用的金属离子催化剂～使各类有机磷农药,磷酸酯、二硫代酸酯、磷酸胺,在催化作用下水解为磷酸与醇～水解产物与显色剂反应～使显色剂的紫红色退去变成无色。主要针对的是有机磷农药的残留检测～特别是甲胺磷、对硫磷农药。这种方法采用化学反应原理～避免了通常所使用生化方法,酶法,的缺点,酶的制备、保存以及反应需比较严格的条件,～灵敏度也达到一定的要求。但是此方法主要针对的是甲胺磷、对硫磷等较高毒性的有机磷农药残留的定性检测。 该方法的特点是操作简便、价格便宜、检测速度快～通过进一步改善试剂性能～规范测定技术～可提高检测的灵敏度和准确性～从而为当前广大城乡农产品生产和销售者所青 睐。 二、几种检测农药残留方法的比较 气相色谱仪 是目前比较权威的方法～可以精确定量～可测出多种不同种类农药。但检测成本高～仪器操作须专业人员～前处理要求较高～时间长。 活体生物检测 不需要仪器～无须前处理～对各种毒物都可以测定。但难以找到与该产品同时种植的未施农药产品做对照～只能估算～不能精确定量分析～受很多因素影响。 免疫法检测 特异性强～灵敏度高～快速简便～可准确定性～定量～适用于现场检测。但抗体制备比较困难～不能肯定试样中的农药品种时～有一定的盲目性～易出现假阴～假阳性现象。 酶抑制法检测 使用残毒速测箱～无须大型设备和专业人员～成本较低～酶片保存时间长～灵敏度低～不能定量。 比色法 灵敏度高～操作简便～检测快～可检测多种残毒综合量,酶易失活～不易保存～检测时受温度影响～需要控制的条件较多。 传感器 灵敏度高～仪器自动化程度高～响应时间短～适合现场检测。但方法选择性有限～原理单一,仅限于胆碱酯酶的功能被抑制,生物材料固定化易失活。 化学法 速度快、成本低、操作简便、针对性强～尤其适合于现场检测。但适用范围小～仅限于果蔬的有机磷农药残留检测。 三、农药残留检测发展趋势 农药残留分析是分析化学中最复杂的领域～其原因主要 是: -91.需分离和测定的残留农药量往往是在ng(10g)、pg -12-15,10g,甚至在fg(10g)级～一次成功的分析需要有许多操作条件的正确结合和选择～尤其是萃取和净化方法的成功应用, 2.分析样品用药历史的未知性即污染源的未知性和样品种类的多样性, 3.一次样品测定能分析多种农药残留～即多残留分析的要求。 农药残留的萃取、净化技术是农药残留分析的关键。 1.固相萃取,SPE,技术, 2.超临界流体萃取技术(SFE), 3.固相微萃取技术,SPME,, 4.凝胶萃取技术,GPC:凝胶渗透色谱,, 5.快速溶剂萃取,PSE,。 随着高新分析技术引入农药残留检测之中～发达国家目前经常采用如气相色谱与质谱联用技术、液相色谱与质谱联用技术、毛细管电泳与质谱联用、以及气相、液相色谱与多级质谱联用技术等。这些技术的应用大大提高了农药残留检测的定性能力和检测的灵敏度、检测限和检测覆盖范围。 采用气相色谱与质谱联用技术或液相色谱与质谱联用技术～首先对样品中的农药种类进行定性分析～对确定的农药残留量再利用气相色谱进行定量分析。此种方法可以一次排除样品中许多农药～节省了大量的时间和操作。而我国目前的检测方法正好与之相反。 作者:江苏省农产品质量检验测试中心 田子华 摘自《江苏省昆虫学会2004年学术研讨会论文汇编》 ??????????????????????????????????? 编委会主任:支苏平 主编:戴起伟 电话:84390280 E-mail:dqw@jaas.ac.cn 编辑部地址:南京市孝陵卫江苏省农业科学院科技情报所内,www.jsrde.cn,