传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆 抗体的制备 . . 第卷第期 大连海洋大学学报年月文章编号:??? 传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的 原核表达及多克隆抗体的制备 刘学光,郑怀东,郭欣硕,罗靳,蔺翠翠,王秋雨 .辽宁省水产品质量安全检验检测局,辽宁沈阳;.辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳 摘要:通过人工合成方法得到传染性造血器官坏死病毒糖蛋白蛋白基因,将该基因克隆 到表达载体一,构建重组表达质粒一/?,并转化至大肠杆菌中。 / 经?电泳及 诱导剂、?条件下诱导 后, 分析表明,在 蛋白在大肠杆菌中成功表达,得到了相对分子质量约为 的蛋白。采用直接切胶免疫小鼠的方法制 备多克隆抗体,分析结果显示,血清效价可达到: 。本试验中得到的蛋白和多抗血清可为 疫苗的研制以及胶体金试纸条快速检测方法的建立提供理论基础。 关键词:病毒;原核表达;包涵体;蛋白;抗体 文献标志码: 中图分类号:. ? 酸杂交技术? 和核酸扩增技术、? 传染性造血器官坏死病病毒 ,被归类为诺拉弹状 ?和等温扩增技术等‘”。免疫学检测 病毒属?’,属于负股病 方法操作较繁琐,试验周期长;荧光定量技 毒【。 。囊膜表面有一个糖蛋白突起,即糖 术具有高特异性、高灵敏性、线性范围宽、操作简 蛋白,又称为囊膜蛋白简称蛋白。在细胞受 单等特点引,但有其局限性,如样品的前处理复 体与病毒的识别和结合等过程中,的蛋白 杂、分析耗时且需要特殊的仪器设备,从而不易推 起着非常重要的作用,并直接关系到病毒的毒力。 广。本研究中,作者从合成抗原人手,对蛋白 蛋白还是病毒的主要抗原,可以诱导产生特异性 基因进行了原核表达,利用纯化的?免疫 小鼠制备多克隆抗体,以期为胶体金试纸条快速检 免疫中和抗体,刺激细胞免疫。】。因此,蛋白 是中非常重要的结构蛋白,对其进行基础性 测方法的建立奠定基础。 研究具有重要意义。 材料与方法 由引发的传染性造血器官坏死病? ,主要的感染宿 .材料 主为鲑科鱼类,据研究表明,它能使受感染鱼苗 含幼鱼的死亡率达到%~%。对世 克隆载体一 、大肠杆菌宿主菌界范围内的鲑鱼养殖业造成了巨大的经济损失?。 购自宝生物工程大连有 世纪年代,中国第一例在辽宁省本溪的 限公司;表达载体一由辽宁大学生命科学 院细胞生物学实验室保存;大肠杆菌 某养殖场被报道。被中国列为二类疫病,是 口岸鱼类的第一类检疫对象。目前,国内外对 感受态细胞购自天根生化科技北京有限 病的研究尚不成熟,还处在基础性研究阶段。 公司。 聚合酶、限制性核酸内切酶印 病毒的检测技术主要有两类:一类是免疫学技 和、 连接酶购自公司;质粒 提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自天根生化科技 术,如免疫荧光技术【 、中和试验一、酶联免疫 吸附试验。等;另一类是分子生物技术,如核 北京有限公司;弗氏完全佐剂’ 收稿日期:? 基金项目:辽宁省海洋与渔业厅项目 作者简介:刘学光一,男,高级工程师。:. 万方数据 第期 刘学光,等:传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体 的制备 冲液重悬菌体,在液氮中反复冻融后超声破碎 ,购自公司。 下工作 ,收集沉淀。用清洗 ,间隔 .方法 缓冲液超声清洗包涵体沉淀,然后溶解包涵体,离 .. /,装入透析袋 心后将上清稀释至.?. 目的基因的克隆及一/表达 并置于梯度复性缓冲液中,于?下缓慢透千~ 载体的构建通过检索蛋白基 。再于纯化缓冲液中透析后,进行 因序列,经优化后添加睁和酶切位点、 电泳分析。 标签,确定总长为 的?蛋白基因 .. 多克隆抗体的制备与鉴定将包涵体洗涤 序列,并由宝生物工程大连有限公司合成。 后,经?分离目的蛋白,在溶液中 将该基因连接到一 载体,转化至染色,? 后出现乳白色的目的条带,切下目 中,经扩增,检测质粒中插入片 段的长度,选取阳性克隆的菌落进行保存。 的蛋白带,用缓冲液洗去残留的 溶液, 分别用蜘和将?蛋白基因和 共洗涤次,于一?下保存。初次免疫,将切下 的蛋白凝胶磨碎,与弗氏完全佐剂按等体积比震荡 一载体进行双酶切,酶切后用胶回收试剂盒 混匀,给每只小鼠背部皮下多点注射,对照组小鼠 回收产物。回收后的基因片段和回收后的 用灭菌的缓冲液和弗氏佐剂等体积比混匀后 载体片段用。连接酶连接过夜,构建成 进行注射,注射量与试验组相同。周后,第次 /?重组表达质粒。将重组质粒转化至大 对小鼠加强免疫,将蛋白凝胶与弗氏不完全佐剂以 肠杆菌感受态细胞中,用氨苄 青霉素抗性筛选,挑单菌落进行培养。用方 等体积比混匀后给小鼠注射。每 隔周,使用上述 方法进行第次和第次加强免疫。第次加强免 法筛选阳性克隆,用双酶切法鉴定是否重组成功, 疫后周,从小鼠尾部采血,将血液置于离心管 将鉴定为阳性的重组质粒送公司测序。 .. 蛋白的诱导表达及鉴定将重组质粒转 中,在?下放置 ,然后置于冰箱 中 化至. 过夜,待血清析出后提取血清。用酶联免疫吸附法 感受态细胞中,挑 取单个菌落接种于培养基中培养过夜,次日以 检测效价:用纯化后的蛋白包被酶联反 :的比例接种于培养基中,于?下振荡 应板,稀释抗血清,第一个孔以: 的比例稀 培养 ,加入终浓度为 /的诱导 释,其余孔以:的梯度倍比稀释,同时做阴性对 剂进行诱导表达,同时做阴性对照不加 照。用辣根酶标记的羊抗鼠作为二抗, 显色,用酶标仪测定 处的吸光值。 ,表达时间分别为、、、、 。诱导 后终止培养,离心收集菌体,用超声波破碎,于 结果 ?下变性 ,分别上样进行电 泳分析,用考马斯亮蓝一染色并观察。 . /表达载体的构建 .. 蛋白的 分析将蛋白 / 用 诱导 后,超声破碎菌液,常 重组质粒经内切酶勋和酶切后得到的 规制样后取乩上样至?%分离 酶切片段见图,鉴定结果表明,目的基因插人到 胶进行电泳,按照常规方法进行转膜。为了检 表达载体中并且其读码框正确,表明一/ 测蛋白是否电转成功,采用丽春红染色,然后用蒸 ?重组质粒成功构建。 馏水洗涤数次至元色为止,用 /脱脂牛奶在室 . 蛋白的诱导表达及?分析 温封闭 ,加入抗标签单克隆抗体,室温下 结合 ,?下孵育过夜,用洗膜次 在浓度为 /、温度为?,诱 /次,加入辣根过氧化物酶标记的羊 导表达 的条件下,蛋白的表达量趋于稳定, 抗鼠抗体结合 ,再用洗膜次 在相对分子质量约 处有明显的表达条带 /次,用化学发光法显色并观察。 图,与预计的理论值相符,表明目的基因得到 .. 蛋白包涵体的制备及纯化取重组菌于 了表达。超声破碎细菌后,对上清液和沉淀进行 ?下振荡培养 ,加人终浓度为 /的 ?%分离胶电泳,可见目的蛋白在 ,于?下诱导 。大量诱导表达的菌液 上清液中的表达量很少,而在沉淀中有 大量表达 经 重悬离心后收获菌体沉淀。加入超声缓 图,表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。 万方数据 大连海洋大学学报 第卷 \ 基因 【注:为蛋白质相对分子质量;为包涵体;为裂解上 注:为 相对分子质量标准;为用蜘和 清。 双酶切后的重组质粒;为未用印和双酶切的重组质 , 粒。 ;, ;, :, . ;, 一 /? 图 蛋白包涵体的电泳图谱 ?;, 一/? . ? . 图重组质粒/?的酶切鉴定 . / 】 ?耵 秘酾 满 鬻攀辩 注:为蛋白质相对分子质量标准;为诱导表达后的重组质 注:为蛋白质相对分子质量标准;为阴性对照未诱导; 粒裂解沉淀;为阴性对 照未诱导。 ?分别为诱导、、、、 后的产物?、.? :, ;, / 。;, .:, ;, 图 蛋白的 分析 ;, ,,,, . / ,. . 图不同诱导时间下蛋白的表达 . 蛋白包涵体的制备及纯化 . 蛋白的表达产物基本上以包涵体形式存在于 . 蛋白的 分析 沉淀中。蛋白上样量为?时分析得到明显蛋白 条带,相对分子质量约为 图。 . 对蛋白进行纯化处理后,采用 超声清洗后分离沉淀,收集用尿素充分洗涤后 方法进一步进行验证。从图可见,未经 的包涵体,经梯度透析后,取纯化的目的蛋白进行 诱导的蛋白无条带,经诱导 后出现约 ?电泳分析图。结果表明,目的条 的特异性条带。结果表明,重组菌在? 带相比透析前亮度有所减弱,但杂带明显减少,起 下经诱导 后,蛋白在大肠杆菌中成功 到了纯化的目的。 表达。 万方数据 第期 刘学光,等:传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体 的制备 研制和诊断方法研究中起着非常重要的作用。 本研究中对蛋白基因的原核表达及免疫反 加? 应性进行了研究。在原核表达系统中,表达系 鲫加 统在试验中经常被使用,很多种类的异源蛋白在大 ?卯铂钔 肠杆菌中都能够成功表达【。。但是在大肠杆菌 中表达的异源蛋白经常发生错误的折叠,并聚集成 甜? 为包涵体。为了更好地得到表达的蛋白,许多科研 凹? 工作者通过降低诱导温度,改变浓度及诱导 时间等方法得到可溶性蛋白。本研究中对重组蛋白 加 进行了可溶性分析,结果表明,重组蛋白的存在形 式主要为包涵体,其内的重组蛋白质量分数普遍高 ? 如? 于%,其余的成分主要为内毒素、外膜蛋白、 注:为蛋白质相对分子质量标准;为透析前电泳结果; 质粒和多糖等。 。 为透析后电泳结果。 重组蛋白在表达的过程中,由于某些决定蛋白:, ;, 折叠的辅助因子缺乏,不能形成次级键,形成了包 ;, 涵体,然而包涵体的形成是目的蛋白表达量很高的. 表现。作者认为,蛋白基因在原核表达系统中成 图纯化后的蛋白分析 功表达的关键是有合适的受体菌,并且外源蛋白在 . 细胞中以融合蛋白的形式存在。蛋白包涵体的纯 . 多克隆抗体的制备与鉴定 化方法简便采用破碎包涵体的方法纯化目的蛋 白,将其经悬浮和适当的佐剂乳化处理后, 以纯化的蛋白包板,对制得的多克隆抗体 就可以直接用于注射免疫,制备抗体。 血清稀释后进行检测。结果表明,多抗血 本研究中合成并克隆了的蛋白基因序 清效价可达到: 图。 列,总长为 ,包含?的全长基因, 编码个氨基酸。成功构建了大肠杆菌重组表达 系统一/?,能够在较短的时间内获 得大量表达。得到了预期相对分子质量约为 互一? 的目的蛋白。切胶免疫小鼠制备多克隆抗体,经 法检验,抗体效价达: 以上。重组 蛋白具有纯度高、易于得到、实用性强等优点,本 研究中采用重组蛋白作为抗原来制备抗体,在 : : : : : 一定程度上降低了病毒传播的风险,但重组抗原在 稀释比例 抗原决定簇上与天然蛋白相比可能存在差异。 注:表示有效稀释倍数。 综上所述,?蛋白及多克隆抗体的获得 . : 为进一步研究蛋白基因提供了有利的技术支持, 图 抗血清效价的测定 也为胶体金试纸条快速检测方法的研究和试剂盒的 . 开发应用奠定了基础。 讨论 参考文献: 的不同株系在核苷酸水平上具有较高的 相似性,而在蛋白质水平上相似性较低。?? , , , . 蛋白是非常重要的蛋白,在诱导产生抗体及 . // , , ? 免疫保护机制中起着重要的作用。据文献报道,. ,:. : 蛋白基因可以诱导鲑鳟鱼类产生约%的免疫保 吴金炉,曾志南.鱼类病毒病与鱼类病毒疫苗.海洋科学, 护率?。因此,蛋白是重要的靶蛋白,在疫苗 .:?. 万方数据