大鼠提睾肌神经损伤后血管内皮细胞的凋亡.doc

大鼠提睾肌神经损伤后血管内皮细胞的凋亡.doc 大鼠提睾肌神经损伤后血管内皮细胞的凋 亡 【关键词】 提睾肌 关键词: 提睾肌;内皮，血管;脱噬作用 摘 要:目的 研究大鼠提睾肌神经损伤后血管内皮细胞的凋亡. 以免疫组织化学SP法，对大鼠提睾肌神经损伤后的血管内皮细胞 Bcl-2，Bax和p53表达进行研究. 结果 支配提睾肌的神经损伤后， Bcl-2，Bax和p53的表达均有增强，但Bax和p53的表达明显强于 Bcl-2(P<0.01和P<0.05).神经损伤1wk后凋亡水平最高(与 24h组比较P<0.01). 结论 大鼠提睾肌血管内皮细胞失去神经支 配后可产生过度凋亡，并可能对微循环产生不利影响. Keywords:cremaster;endothelium，vascular;apoptosis Abstract:AIM To study the apoptosis of vascular endothe-lial cell with injured cremaster nerve of the rat.METHODS The expression of Bcl-2， Bax and p53in endothelial cells with injured cremaster nerve was investigated by means of immunohistochemical SP method.RESULTS The expres-sion of Bcl-2，Bax and p53in endothelial cell of injured cre-master merve increased obviously，and reached the hightest level I weak after operation(P<0.01vs24h group)But the number of positive cell of Bax and p53was larger than that of Bcl-2(P<0.01and P<0.05).CONCLUSION Cremaster Nerve injury could result in apoptosis of the endothelial cells and might play an important role in the dysfunction of micro-circulation. 0 引言 血管内皮细胞具 有复杂的生物学功能，其中包括促凝、抗凝、调节血管张力、影响 血管生成、合成基质及调节和加重炎症等,1-3, .血管内皮细胞的 正常生理功能除因创伤、内毒素等，氧自由基及Ca2+ 超载等因素 遭受损伤和影响外，血管内皮细胞凋亡则是已受到重视的影响其存 活及一系列病理生理改变的重要因素之一,4-6, .有关研究显示， 大鼠提睾肌血管内皮细胞有CGRP，NPY等肽类神经递质的分布， 并认为对其生理功能有重要作用,7, .在血管创伤和手术修复中， 有关神经常可遭受损伤，失去神经支配的血管内皮细胞是否出现过 度凋亡，参与微循环障碍，目前尚未见报道.我们以大鼠提睾肌神经 损伤微循环模型，对血管内皮细胞的Bal-2，Bax及p53表达情况进 行研究，以探讨神经损伤后血管内皮细胞的凋亡及其对微循环的影 响和作用. 1 材料和方法 1.1 材料 成年雄性SD大 鼠35只，体质量(250?30)g，由本校实验动物中心标准饲养室提 供.其中30只平均分为术后24，72h及1wk3个实验组，另5只为对 照组.实验动物以10g L-1 ，ip戊巴比妥钠溶液麻醉后，切开一侧腹 股沟区皮肤，显露提睾肌.于提睾肌根部切断所有分布该处的神经和 分支.其中包括:分布到提睾肌近侧部的髂腹下神经和髂腹股沟神经、发自股部分布于提睾肌外侧部的股外侧及皮神经支、走行于精索后面分布于提睾肌远侧部的生殖股神经.上述所有神经均切断后两断端丝线结扎.对照组动物不做任何手术.手术后24，72h及1wk将动物麻醉后，经主动脉插管依次用9g L-1 生理盐水及40g L-1 多聚甲醛磷酸缓冲液灌注固定.将各组动物双侧提睾肌整体切下，置固定液后固定备用.Bcl-2，Bax及p53鼠抗单克隆抗体为MBI公司产品，链霉菌抗生素―过氧化酶免疫组织化学染色超敏试剂盒购自福州迈新生物技术公司. 1.2 方法 与血管纵轴垂直切取提睾肌，组织块脱水、包埋及石蜡切片，片厚5μm.切片经脱蜡和水化后，依次以氧化酶阻断剂和非免疫血清室温孵育10min，Bcl-2，Bax(1 40)和p53(1 100)单克隆抗体室温孵育60min，生物素标记第二抗体和链霉菌抗生物素-过氧化酶(三抗)各室温孵育10min.最后以DAB呈色反应5,10min.自来水冲洗终止反应.除部分p53切片外，其余切片均以苏木精复染.切片脱水、透明及封片.对照组动物和实验组动物非手术侧提睾肌标本切片实验方法步骤同上.用PBS分别代替第一、二、三抗体做阴性对照. 结果判定及统计学分析:条状血管内皮细胞胞质出现棕黄色颗粒为Bcl-2及Bax阳性细胞，血管内皮细胞核出现棕黄色颗粒为p53阳性细胞.观察10个连续切片，选血管密集处中的5个400倍视野计数平均100个细胞中的阳性细胞作为调亡指数，以反映调亡程度.所得各组数据以x ?s表示，采用χ2 检验分析. 2 结果 2.1 Bcl?2，Bax和p53在血管内皮细胞的表达 Bcl-2，Bax和p53阳性细胞位于血管壁内表面的内皮细胞层，镜下可见Bcl-2和Bax阳性内皮细胞核两侧扁平窄条状细胞质内充满棕黄色颗粒，但在细胞膜内外侧也有同样的阳性颗粒(Fig1,3).p53阳性细胞表现为突入血管腔的棱形或椭圆形细胞核为棕黄色颗粒，但胞质也可见到(Fig4).对照组动物仅能见到少量阳性细胞.阴性代替试验结果均为阴性.在实验组动物，Bcl-2，Bax和p53均有大量表达，在血管密集处，许多血管和毛细血管的内皮细胞几乎全为阳性.但出现阳性细胞的血管分布不均，常呈束状分布，在肌束间血管束和毛细血管阳性细胞十分密集，且着色很深.Bcl-2与Bax和p53的阳性细胞数量及表达强度比有所不同，在术后各个时间，Bax和p53的阳性表达明显大于Bcl-2(P<0.01，Tab1).表1 Bcl-2，Bax及p53在血管内皮细胞的表达(略) 2.2 神经损伤后不同时间的Bcl?2，Bax及p53表达 Bcl-2，Bax及p53在神经损伤后的不同时间表达情况不同.神经损伤24h，阳性细胞已较明显，但是神经损伤后72h阳性细胞的数量可达非常显著，术后1wk，阳性细胞的表达达最高水平(P<0.01，Tab1)，成束的血管 和毛细血管内皮细胞几乎全为阳性. 3 讨论 血管内皮细胞损伤是游离组织的移植及断肢再植后微循环障碍，导致手术失败的主要原因之一.目前认为其机制是血管内皮细胞损伤后，引起胶原暴露，血小板及白细胞凝集，形成微血栓进而产生微循环障碍.血管内皮细胞损伤因素除创伤、内毒素、氧自由基及Ca2+ 超载外，细胞凋亡的失调可引起有关的病理生理改变和功能紊乱.有关研究表明，在大鼠提睾肌血管壁上有多种含肽类神经递质的神经纤维的分布并直接与血管内皮细胞接触，认为这些神经对血管的舒缩功能、血管内皮细胞正常生物学特性有重要作用,6, .我们发现，大鼠提睾肌在失去神经支配后，细胞凋亡相关基因Bcl-2，Bax及p53的表达均有增加，但Bax和p53的阳性细胞数量和表达强度明显大于Bcl-2(P<0.01，P<0.05).已有研究，Bcl-2和Bax通常以二聚体的形式存在，Bcl-2/Bax的比率决定细胞的凋亡与否，高水平的Bcl-2表达说明存在大量的Bcl-2/Bax杂合体，从而维持细胞的活性，而高水平的Bax表达表明存在更多的Bax同源二聚体，故能诱导细胞凋亡.p53作为一个重要的凋亡转录调节物，它的靶基因就有bcl-2和bax，它的增加可诱导凋亡.本实验的Bax和p53的高表达提示，大鼠提睾肌在失去神经支配后能引起血管内皮细胞的凋亡.在创伤及血管等相关手术中造成神经损伤后有可能导致血管内皮细胞凋亡，因此导致了微循环障碍过程.另外本文的结果进一步证明神经对血管及内皮细胞功能的重要调节作用. 本研究还发现Bcl-2，Bax和p53的表达与神经损伤后的时间有正相关关系.神经损伤后24h已有明显的凋亡基因表达改变，但随着时间的延长至72h甚至1wk，血管内皮细胞的阳性细胞数量达最高水平.在单纯血管吻合区肽能神经变化研究中发现，吻合区局部的神经损伤至术后30d吻合口两侧的神经纤维才能再生与正常血管相似,8, ，故其间可能因神经损伤使血管内皮细胞受到的影响而出现凋亡，而参与血管及毛细血管的微循环障碍和功能紊乱，导致手术失败.