反相高效液相色谱法测定厌氧菌有机酸代谢产物

反相高效液相色谱法测定厌氧菌有机酸代谢产物 1 1 1 1 2 王忠永 ,郑佳音 ,周铁丽 ,黄小侠 ,刘佳明 ( 1. 温州医学院附属一院 实验诊断中心 ,浙江 温州温州医学院环境与公共卫生学院 ,浙江 温州 325000; 2. )325035 () 【摘要 】 建立反相高效液相色谱测定厌氧菌代谢发酵有机酸产物 乙酸 、乳酸 的并用于测定乳酸菌代 谢发酵产物中的含量 。反相高效液相方法是一种简单 、准确 、灵敏的方法 ,可用于同时定量测定厌氧菌的有机酸代 谢产物 。 【关键词 】 反相高效液相色谱 ;厌氧菌 ;有机酸 【中图分类号 】Q67 【文献标识码 】A S im u ltan eou s de term ina t ion of organ ic a c id s in the m e ta bo l ic produc t ion of ana erob ic ba c ter ia by Rever sed Pha se H igh Perform an ce L iqu id C hrom a togra phy 1 WAN G Zhong2yong, ZH EN G J ia2yin, ZHOU Tie2li, HUAN G X iao2xia, L IU J ia2m ing ( )1. The F irst A ff ilia ted H ospita l of W enzhou M ed ica l College, W enzhou 325000, Ch ina 【A b stra c t】 To e stab lish a m e thod to de tec t o rgan ic ac id s in the m e tabo lic p roduc tion of anae rob ic bac te ria by R e2 ( ) ve rsed Pha se H igh Pe rfo rm ance L iqu id Ch rom a tograp hy R P2H PLC . W e u sed it to de te rm ine the concen tra tion of ace tic ac id and lac tic ac id in the m e tabo lic p roduc tion of L actobacillus. It wa s sugge sted to be a simp le, sen sitive, re liab le m e thod and we can u se it sim u ltaneou sly to de te rm ina te o rgan ic ac id s in the m e tabo lic p roduc tion of anae rob ic bac te ria. 【Key word s】 R eve rsed p ha se h igh p e rfo rm ance liqu id ch rom a tograp hy; A nae rob ic bac te ria; O rgan ic ac id 人体内的一些厌氧菌诸如乳酸菌 、双歧杆菌是维 1. 3. 1 流动相浓度的选择 将流动相分别配成含 3%甲醇的 0. 01、0. 02、0. 05、0. 10 mo l /L KHPO溶液 持人体阴道 、肠道等的主要正常菌群 ,是维护其微生 2 4 () 用 HPO调 pH 为 2. 55,对标准溶液中的乙酸 、乳酸 态平衡的重要有益菌 。其发酵产生的短链有机酸如 3 4 进行分离测定 。结果表明磷酸盐的浓度对分离与出峰 乙酸 、乳酸等对维持微生态环境的完整性和功能 ,免 影响不大 。因高浓度的盐会对色谱系统产生影响 ,因 疫系统调节等都非常关键 。对有机酸的测定研究 ,主 此选用 0. 01 mo l /L 的 KHPO溶液作为流动相 。 要有比色法 、荧光法 、薄层色谱法 、气相色谱等方法 ,2 4 [ 1 ] 1. 3. 2 流动相中甲醇含量的选择 少量甲醇能有效 但常需预分离或衍生等烦琐的前处理 。我们拟建 的改善峰形 。比较了 1 % , 3 % , 5 % , 8 %甲醇量对保 立测定厌氧菌代谢发酵有机酸产物的反相高效液相 留时间及分离度的影响 。随着甲醇浓度的增加 ,保留 色谱方法并将之用于乳酸菌代谢产物中乙酸 、乳酸的 时间提前 ,但乙酸和乳酸峰之间的分离度下降 。相对 测定 。[ 3 ] 3 %的甲醇浓度效果较好 ,选用此浓度 。 1 材料与方法 1. 3. 3 pH 值 pH 有 一 定 影 响 , 参 照 文 献 [ 4 ] , 将 1. 1 仪器及试剂 pH 选择为 2. 55。用磷酸调节 pH 为 1. 8 及 3. 0 时 , 1. 1. 1 仪器 美国 W a te rs色谱工作站 : 515 泵 , 2487 乙酸和乳酸的分离均不佳 。紫外检测器 , 717p lu s自动进样器 , M illenn ium32 色谱 1. 3. 4 柱温 柱温对保留时间及分离度有一定影 处理系统工作站 。 响 。随着柱温提高 ,保留时间提早 ,分离度降低 。但 1. 1. 2 试剂 磷酸二氢钾 、甲醇 、磷酸试剂均为国产 温度太低亦影响峰形及延长保留时间 ,其在 30 ?时色谱纯或分析纯试剂 ,所用的水均为 M illipo re公司的 峰形及分离均较佳 ,故设定柱温为 30 ?。 M illi2Q 纯水器所制 。 1. 3. 5 流速 流速对乙酸 、乳酸的出峰和分离有较 (1. 1. 3 标准品 乙酸 、乳酸试剂 上海化学试剂总 大影响 ,随着流速的提高 ,保留时间明显缩短 、两者之 )厂 用流动相进行稀释 。 间分离度下降 ,柱压上升 。但太低的流速则影响出峰 ( 1. 2 色谱条件 色谱柱 , C18 柱 H yp e rsil O SD 2 5 和峰形乃至不出峰 。在 0. 5 m l /m in时效果较佳 。 μm 4. 6 mm ×250 mm , 大连依利特科学仪器有限公 1. 4 实验方法) 司 。流动相 ,采用在十八烷基柱中应用最广的磷酸 1. 4. 1 色谱图 按优化后的色谱条件对标准品进行 盐缓冲液系统配制 3 % CHOH —0. 01 mo l /L KHPO 3 2 4[ 2 ] 测定 ,其乳酸的保留时间为 9. 10 m in,乙酸的保留时 ( ) pH 2. 55 溶液为其流动相 。流速为 0. 5 m l /m in, 间为 9. 56 m in,两峰之间基本分开但峰之间比较接近 μ 柱温 30 ? ,紫外检测波长 210 nm ,进样量 20 l。 () 见图 1 。 1. 3 色谱条件优化及确立 () 1. 4. 2 乳酸菌有机酸代谢产物 乙酸 、乳酸 的测定 1. 4. 2. 1 标本来源 5株菌来源于临床分离的阴道 【收稿日期 】2007 207 214 内的乳酸菌 ,分纯后各配成 0. 5 麦氏浊度的菌液 ,取 ( ) 【基金项目 】浙江省教育厅资助课题 20051134 μ100 l接种于 2 m l MR S液体培养基中 ,在厌氧条件 ( ) 【作者简介 】王忠 永 1975 2, 男 , 主 管 技 师 , Em a il: wangfo rever2000 @ 下培养 3、6、9、12、24、48、72 h 时分别取产物高速离 163. com ( ) 心 13 000 r /m in5 m in,取上清 - 40 ?冻存待测 。 乳酸的含量增加明显快于乙酸的含量增加 。 1. 4. 2. 2 标准应用液配制 各取乙酸 、乳酸标准品 3 讨论 3. 1 经实验 ,采用 H yp e rsilC18柱建立的高效液 用 MR S 液 体 培 养 基 配 成 0. 6、0. 3、0. 15、0. 075、 0. 0375 mo l /L 的标准应用液 。相色谱系统可以较好地分离和定量测定厌氧菌有机 酸代谢物中的乙酸和乳酸含量 。该方法具有前处理 简单 、灵敏度高 、速度快 、可同时定量检测等优点 。我 们测定了乳酸菌代谢产物中乳酸 、乙酸的含量 ,发现 这两种有机酸在乳酸菌的代谢物中均有较高含量 ,且 代谢物中乳酸的产生速率大于乙酸的产生速率 。 3. 2 产生有机酸维持微生态环境的完整性和功能是 我们体内一些益生菌的重要功能 ,在不同病理状态及 药物如抗生素的影响下 ,其产生有机酸的能力会受影 响而产生变化 ,可能是造成其微生态失衡的一个重要 原因 。本文测定了几株临床分离乳酸菌的产有机酸 能力 ,但对其与临床特别是抗生素药物作用影响的相 图 1 色谱图 ()前为乳酸 、后为乙酸 关性 ,还需更多的研究测定 。 1. 4. 2. 3 样本准备 将标准应用液及上述冻存标本 μ室温复融后 ,各取 200 l加入等量的甲醇溶液沉淀 【参考文献 】 ( ) 蛋白并高速离心 13 000 r /m in5 m in,取上清测定 。 [ 1 ] 高海燕 ,王善广 ,胡小松 , 等. 利用反相高效液相色谱法测定梨汁 2 结果 ( ) 中有机酸的种类和含量 [ J ]. 食品与发酵工业 , 2004 8 : 96 2100. [ 2 ] 宋永康 ,郭嘉 ,潘葳 ,等. 影响测定反相高效液相色谱流动相 pH 值 用上述建立的方法测定标准应用液及乳酸菌代 ( ) 的因素 [ J ]. 现代科学仪器 , 2005 1 : 95 297. 谢物中的乙酸和乳酸的含量 。以其峰高对浓度做标 [ 3 ] 高海燕 ,廖小军 ,王善广 ,等. 反相高效液相色谱法测定果汁中 11 准曲线 : 乳 酸 , y = 0. 0069 + 0. 414 x, r = 0. 9991; 乙 酸 , y =( ) 种有机酸条件的优化 [ J ]. 分析化学 , 2004 12 : 1645 21648.0. 0343 + 0. 7011x, r = 0. 9998。测定标本中的乳酸含量在 [ 4 ] 白冬梅 ,杜国民 ,赵学明 , 等. 反相高效液相色谱法测定产琥珀酸 ( ) 放线 杆 菌 发 酵 液 中 的 有 机 酸 [ J ]. 分 析 化 学 , 2003 31 : ( ( ) ) 0. 016,0. 833 mo l /L ,乙酸含量在 0. 009,0. 198 1496 21499. mo l /L ,这两种有机酸在乳酸菌的代谢产物中均有较 [ 5 ] 文姝 ,刘欣 ,袁杰利 ,等. 乳杆菌 、双歧杆菌代谢产物的气相色谱分 [ 5 ] 多含量 ,且随着培养时间的延长 ,含量增加 ,其中 ( ) 析 [ J ]. 中国微生态学杂志 , 2004 16 : 221 2222. 【参考文献 】 )(上接第 526 页 献报道一致 ,提示 Cyc linD1 改变是大肠 [ 1 ] AMBRO S NI I G, AD IDA C, S IRU GO G, e t a l. Induc tion of apop to sis 癌一个常见的分子事件 。实验发现 Cyc linD 1 阳性表 and inh ib ition of ce ll p ro life ra tion by su rvic in gene ta rge ting[ J ]. J B io l 达与各临 床 病 理 参 数 无 显 著 相 关 性 , 提 示 Cyc linD 1 Chem , 1998 , 273: 11177 211182. 在大肠癌的发生中可能是一个早期事件 ,与大肠黏膜 [ 2 ]MA SUDA M , H IRA KAWA N , NA KA SH IMA T, e t a l. Cyc linD1 ove r exp re ssion in p rim a ry hypop ha ryngea l ca rcinom a [ J ]. Cance r, 1996 , 的癌变有关 ,与 ARB ER 等人研究结果一致 。而亦有 78: 390 2396. 相反报道 , DONN ELLAN 认为 Cyc linD 1的表达与癌组 [ 3 ] SU ZU K I A , ITO T, KAWANO H , e t a l. Su rvivin in itia te s p trocap a se 3 / 织分化程 度 相 关 , 分 化 越 差 其 阳 性 表 达 率 越 高 , 故 p21 comp lex fo rm ation a s a re su lt of in te rac tion w ith CD K4 to re sist Cyc linD1与大肠癌生物学行为的关系需进一步研究 。 Fa s2m ed ia ted cell dea th [ J ]. O ncogene, 2000 , 19: 1346 21353. 在胰腺癌 、头颈部肿瘤中发现 , Cyc linD 1 表达与 [ 4 ] KAWA SA K I H , TO YODA M , SH INOHARA H , e t a l. Exp ression of [ 9 ] su rvivin co rre late s w ith apop to sis, p ro life ra tion, and angiogene sis du r2 肿瘤患者的不良预后有关 。而且 MA EDA 发现 Cy2 ing hum an co lo rtec ta l tumo rigene sis [ J ]. Cance r, 2001 , 91: c linD1过度表达是大肠癌的独立预后因素 。本研究 2026 22032. 表明 , Cyc linD1阳性表达者 5 年存活率为 35 % ,显著 [ 5 ] ROHA YEM J , D IESTEL KO ETTER P, W E IGL E B , e t a l. A n tibody re2 低于 Cyc linD 1阴性表达者的 58 % 。 Cyc linD 1 阳性表 spon se to the tum u r2a ssocia ted inh ib ito r of apop to sis p ro te in su rviving in cance r p a tien ts[ J ]. Cance r R e s, 2000 , 60: 1815 21817. 达与预后呈负相关 ,同文献结果一致 。 [ 6 ] SAR ELA A I, MACADAM R C, FARM ER Y S M , et a l. Exp re ssion of 实验显示 , Su rvivin 和 Cyc linD 1 大肠癌中的表达 the an ti2apop to sis gene su rvivin p red ic ts death from recu rren t co lo rec2 正相关 ,提示 Su rvivin、Cyc linD 1在细胞周期调控中既 ta l ca rc inom a [ J ]. Gu t, 2000 , 46: 645 2650. 有独立的功能 , 又有协同作用 ,表现调控点顺序性改[ 7 ]O KADA E, MURA I Y, MA TSU I K, e t a l. Exp re ssion in tumo r ce ll nu2 c le i sp red ic tve of a favo rab le p rogno sis in ga stric cancer p a tien ts [ J ]. 变 : Cyc linD1 表达 ,缩短 G1 2S期转换 ,在 G2 /M , Su r2 Cance r L e tt, 2001 , 163: 109 2116. vivin既抑制 Ca sp a se活性 ,抑制凋亡 ,又加速增殖 ,共 [ 8 ] X IN G N , Q IAN J , BO STW ICK D , e t a l. N euendoc rine ce lls in hum an 同导致细胞增殖与凋亡平衡破坏 、发生癌变 。研究证 p ro state ove r2exp re ss the an ti2apop to sis p ro te in su rvivin [ J ]. P ro s2 实了肿瘤的发生是多种基因及其表达产物协同作用 ta te, 2001 , 48: 7 215. 的结果 。 [ 9 ] KALLA KA KUR Y B , SH EEHAN C, AMBRO S R A , e t a l. The p rogno s2 tic sign ificance ofp34 cdc2 and Cyc linD1 p ro te in exp re ssion in p ro sta te 本实验提示通过检测 Su rvivin、Cyc linD 在 大肠adenocrconom a [ J ]. Cance r, 1997 , 80: 753 2758. 癌中的表达 ,可为临床制定合理治疗和预后评估