人源抗肿瘤坏死因子_噬菌体抗体的基因结构分析

人源抗肿瘤坏死因子_噬菌体抗体的基因结构分析 α 人源抗肿瘤坏死因子Ο 噬菌体抗体的基因结构分析 袁 斌 何 君 俞晓峰 王 慧 刘怀田 周育森 黄 策 ()军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071 α摘要 从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人 TNF的人源单克隆抗体 ,并对筛选到的抗体基因 α进行了序列测定和分析 。结果明 ,筛选到的 4 个特异性抗 TNF噬菌体抗体克隆的重链基因序列 相同 ,该重链基因长 681 bp ,编码 227 个氨基酸残基 ,属于人免疫球蛋白第 ?家族 ,其中 1,119 位氨 () ( ) 基酸残基为重链可变区 VH,120,227 位为重链恒定区 1 CH1。4 个噬菌体抗体克隆的轻链均缺 失 ,因此实际上筛选到的是单重链抗体 。对重链基因编码的重链蛋白的特性进行了分析 。 关键词 肿瘤坏死因子 ;噬菌体显示 ;单克隆抗体 ;重链 ;测序 αThe gene sequencing and analysis of antiΟTNF human monoclonal antibodies Yuan Bin , He J un , Yu Xiaofeng , Wang Hui , Liu Huaitian , Zhou Yushen , Huang Ce ( )Institute of Microbiology and Epidemiology , Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100071 α Abstract Human antiΟTNFmonoclonal antibodies were selected from pooled human antibody combinatorial libraries using phage display technology , and their genes were sequenced and analyzed. The results showed αthat the genes encoding heavy chains of the four antiΟTNFantibodies were the same , which comprised 681 nu2 cleotides and encoded a protein of 217 amino acids , belonging to human IgG ? gene family , wherein 1Ο119 () amino acids constituted the V region of the heavy chain VHand 120Ο227 amino acids constituted the C1 re2 ( ) gion of the heavy chain CH1. All of the four antibodies lacked the light chain , showing that they were all the same mono heavy chain antibody. The characteristics of heavy chain protein encoded by the heavy chain gene were also analyzed. Key words tumor necrosis factor ; phage display ; monoclonal antibody ; heavy chain ; sequencing 1 抗体库技术自 1989 年问世以来,发展很快 ,HIV 、HAV 、HBV 噬菌体抗体库由王海涛教授赠送 。 它与传统的杂交瘤技术相比 ,具有制作周期短 、操作 菌株 XL1ΟBlue 、质 粒 p TNF 、pComb3 、pBluescript 简便 、成本低等优点 ,特别是该技术可以不经免疫而 及辅助噬菌体 VCSM13 均为本实验室保存 。直接制备人源抗体 ,这对于制备针对于人自身抗原 1 . 2 主要试剂α( α) 组分如肿瘤坏死因子ΟTNF来说 ,具有其他抗体 各种限制性内切酶均购自 Promega 公司 , 兔抗 制备方法不可比拟的优势 。我们利用这种技术从混 α合的噬菌体抗体库中直接筛选到了抗 TNF的人源 α M13 IgGΟHRP 由毛春生博士赠送 。重组人 TNF按 2 抗体 ,并对抗体的重链和轻链基因进行了克隆和测 文献从 p TNF 菌株中提取和纯化。 序 。 1 . 3 混合噬菌体抗体库的制备 分别取 HIV 、HAV 、HBV 噬菌体抗体库保存液各 μ10l ,分别按文献 3 的方法制备噬菌体抗体 。用 ( PBS 缓 冲 液 50 mmol/ L 磷 酸 缓 冲 液 , p H 7 . 2 、1 % 1 材料和方法 ) BSA 、150 mmol/ L NaCl将 3 种噬菌体抗体库适量稀 12释为 10cpu ,并等量混合 ,冻存于Ο70 ?。 1 . 1 噬菌体抗体库 、菌株及质粒 ) α1 . 4 噬菌体抗体的筛选及鉴定,说明它们是人重组 TNF的特异性抗体 。 文发表 α 以纯化的人重组 TNF为固相抗原按文献 3 的 2 . 2 重链轻链基因的序列测定 α方法用混合的噬菌体抗体库进行 5 轮筛选 ,筛选到 选取 4 个特异性抗 TNF噬菌体抗体克隆 ,分别 的阳性克隆按文献 4 的方法进行鉴定 。 克隆其重链和轻链基因 , 并进行两端测序 , 结果发 现 ,4 个克隆的重链基因序列完全一致 ,将两端序列 1 . 5 噬菌体抗体克隆质粒 DNA 的提取与纯化 用经过鉴定的噬菌体感染 XL1ΟBlue 后铺板 ,过 测定的结果合并后得到图 1 的基因序列 。4 个克隆 夜培养后挑取单 菌 落 接 种 于 含 50 mg/ L 羧 苄 青 霉 的轻链基因序列不一致 ,序列分析表明这 4 个基因 ( ) 素 、10 mg/ L 四 环 素 的 LB 培 养 基 中 培 养 过 夜 , 用 均不能编码完整的多肽链 测序结果略,因此 ,这 4 Promega A7100 试剂盒提取和纯化质粒 。 个噬菌体抗体克隆的轻链实际上是缺失 。 2 . 3 重链基因结构分析1 . 6 重链 、轻链基因的克隆 将提 取 和 纯 化 的 质 粒 分 别 用 Spe I/ Xho I 和 对图 1 的重链基因序列进行分析表明 ,重链基 S al I/ Xba I 双酶切 , 用低熔点胶法回收约 660 bp 大 因长 度 为 681 bp , 编 码 227 个 氨 基 酸 残 基 , 经 与 小的 DNA 片 段 , 并 与 用 相 同 酶 切 的 pBluescript KS GeneBank 的已知序列对照分析 ,它与已知的几种人 + (?连接 ,转化 XL1ΟBlue 后 ,在含 XΟgal 、IPTG 的 LB IgG ?家族的重链基因恒定区同源性高达 98 % 检索 ) 平板上挑取白色转化子 ,并用 PCR 和酶切方法鉴定 结果略, 因此我们获得的抗体重链基因片段属于 IgG第 ?家族 。对照已知的抗体序列 , 我们发现该 插入了重链和轻链基因片段的转化子 。 1 . 7 重链和轻链基因序列的测定重链基因的第 1,119 位的氨基酸残基为抗体重链 将带有重链轻链插入基因的转化子接种于含的可变区 ,120,227 位氨基酸残基为抗体重链的恒 50 mg/ L 羧苄青霉素 、10 mg/ L 四环素的 LB 培养基 定区 。我们在检索中没有发现与该抗体重链可变区 中培养过夜 ,用 Promega A7100 试剂盒提取和纯化质 部分有高同源性的已知基因 ,因此该重链基因片段 粒 。在 Beckman 373A 型 DNA 自动测序仪上从两端 为新发现的抗体重链基因 。 2 . 4 抗体重链基因编码的重链蛋白的特性分析进行 DNA 序列测定 。 我们在计算机上用 ProtParam Tool 预测了重链 基因编码的蛋白质的特性 ,结果表明 ,重链基因编码 2 结果 的蛋白含 227 个氨基酸残基 ,其中带负电荷的氨基 酸残基有 12 个 ,带正电荷的氨基酸残基有 20 个 ,各 2 . 1 阳性克隆的筛选及鉴定 氨基酸的含量和占总蛋白的百分比如表 1 所示 。其 从最后一次淘筛洗脱下来的噬菌体克隆中随机 相对分子质量为 2395 . 8 ,理论等电点为 9 . 28 。该蛋 选取 64 个克隆 ,制备噬菌体抗体进行鉴定 ,有 61 个 α白在哺乳动物细胞 、酵母和大肠杆菌中的理论半衰 克隆能与 TNF结合 ,通过其他多种方法确定其中 7 α(期分别为 5 . 5h 、3min 和 2min 。 个克隆对 TNF具有高亲和性和特异性结合能力 另 图 1 重链测序结果及分析 人源噬菌体抗体 ,经过基因序列测定表明 ,该抗体的 3 讨论 重链基因与已报道的人免疫球蛋白重链基因序列同 αTNF是人体的一种正常成分 ,如何获取针对它 源性高达 98 % ,并且其可变区框架区和恒定区与多 的高亲和性单克隆抗体一直是难题 。噬菌体抗体库 个已报道的人免疫球蛋白第 ?家族的框架区和恒定 技术的出现为解决这一难题提供了新的途径 。我们 区相同 。因此 ,我们筛选到的噬菌体抗体片段属于 α从混合的噬菌体抗体库中直接筛选到了抗 TNF的 人免疫球蛋白第 ?家族 ,这说明该基因编码的确实 是一种人源单克隆抗体 ,有广泛的临床应用前景 。 ,克隆选择的压力很强 ,混合抗体库中可能还有 筛选 α基因测序结果表明我们筛选到的 4 株抗体重链 其它能与 TNF结合的抗体克隆 ,但亲和性较低 ,因 6 的 DNA 序列相同 ,均为 681 bp ,编码 227 个氨基酸残 而在克隆选择中也被淘汰 。由过去的报道也可看 () 基 ,其中 1,119 残基位氨基酸为重链可变区 VH, 出 ,在进行较少轮次的筛选时 ,可以获得较多的克隆 ( ) 种类 ,但如果加强克隆选择的压力 ,或增加选择的次 120,227 位为重链恒定区 1 CH1。但在进行轻链 测序时 ,发现这 4 株噬菌体抗体的轻链序列不仅各 数 ,所获得的克隆就会减少 。对于前两个问题 ,解决 不相同 ,而且都不能表达一条完整的蛋白 。这说明 的方法是尽量提高抗体库的库容量 ,例如使用未成 我们筛选到的噬菌体抗体的轻链是缺失的 ,它们实 熟的淋巴细胞进行扩增和克隆 。我们使用混合的抗 际上是一种单重链抗体 。这说明了两个方面的问 体库也是这个目的 。对于第三个问题 ,如果我们想 题 ,一是单独的重链片段就足以与抗原结合 , 这与 获得多个抗体克隆进行研究 ,可以通过降低选择压 5 Ward 等人 报 道 的 结 果 一 致, 以 此 重 链 基 因 为 基 力 ,例如减少筛选次数的方法来解决 ,但这样获得的 础 ,我们可以方便地构建编码双特异性蛋白的基因 , 噬菌体抗体可能结合活性较低 。 6 提供更有价值的蛋白产物。另外 ,在抗原抗体结 合反应中 ,重链可变区起主导作用 ,轻链可变区为辅 参考文献 助因素 ,因此我们可以筛选的重链为基础 ,重新构建 1 Huse WD , Sastry L , Iverson SA et al . Generation of large combinatorial 相应的轻链二级库 ,进而筛选到具有更高亲和性的 library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda . Science , 抗体 。我们进行的这几方面工作结果即将发表 。 () 1989 , 246 10: 1275 沈倍奋 ,黎燕 ,赵恩峰等. 肿瘤坏死因子基因克隆表达及其抗瘤 我们从混合的抗体库中只筛选到一个重链基 2 () 活性的研究. 中国免疫学杂志 ,1993 ,9 1:22 因 ,这可能有三个方面原因 。首先是混合抗体库的 Carlos F , Burton DF. Monoclonal Antibodies from Combinatorial Li2 3 容量不够大 ,不能完全保证模拟体内所有抗体 ,因而 braries Course on Cold Spring Harbor Laboratory. 1993 刘怀田 ,王海涛 ,黄策等. 人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗 α 多样性有限 , 其中与 TNF有结合活性的噬菌体抗 4 体的筛选和基因结构特点分析. 军事医学科学院院刊 , 1996 ,20 α体种类也不够多 。其次是由于 TNF是人体在正常 () 4:255 情况下也含量较少的细胞因子 ,是人体的正常组分 。 Ward ES , Cussow D , Griffiths AD et al . Binding activities of a reper2 5 toire of single immunogolbulin variable domains secreted from Escherichia 而我们所用混合抗体库由艾滋病人的脾淋巴细胞和 coli . Nature ,1989 , 341 : 544 甲肝 、乙肝病人的外周血淋巴细胞的 IgGFab 的cDNA Marks JD , Hoogenboom HR , Bonnert TP et al . ByΟpassing immuniza2 构建而来 ,由于成熟淋巴细胞针对自身抗原的克隆 6 tion : human antibodies from VΟgene libraries displayed on phage . J Mol 在成熟过程中都基本上被删除 ,因此混合抗体库中 Biol , 1991 , 222 :581 ()1999 - 09 - 27 收稿 α的抗 TNF克隆数不会太多 。最后 ,我们进行了 5 轮