吖啶橙梯度染色法检测伯氏疟原虫的实验研究

吖啶橙梯度染色法检测伯氏疟原虫的实验研究 1232 1 1姜素华 刘佩娜 付云朝 廖 琳唐 慧刘振忠 1 新疆石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室,石河子 832002; 2 华西医科大学病原生物学教研室,成都 610041; 3 云南红河州金平县卫生防疫站,金平 661500 关键词: 伯氏疟原虫 AO染色法 瑞氏染色法 疟疾是广泛分布于热带、亚热带及温带边缘地区的一种重要蚊媒传染病,引起世界范围内的显著发病率和死亡率。世界卫生组织热带病特别规划署,TDR,将其列为防治的六类主要热带病之一。除恶性疟暴发流行造成的大量死亡外,疟疾流行时对健康及经济上的损失亦非常严重。因此,寻求简便、快速和可靠的检测手段对提高临床疗效和控制流行具有重要意义。本研究采用以显微镜检为基础的瑞氏和吖啶橙梯度 [1234]、、、染色法,对血传伯氏疟原虫小鼠进行检出原虫时间的差异及检出原虫的最低密度的对比研究,以期明吖啶橙染色法是检测人体疟原虫的一种简便、快速、敏感、实用的。 1 与方法 1.1 材料 1.1.1 疟原虫株 鼠伯氏疟原虫,Plasmodium berghei,系1989年自第四军医大学寄生虫学教研室引进,本实验室血传保种,全鼠-70?低温冰箱冻存212d后复苏,血并经液腹腔转种第7,8代。 1.1.2 实验动物 封闭群昆明小鼠,雄性,4-5周龄,体重18,22g。由本校实验动物中心供应。 1.2 方法 1.2.1 感染接种方法 采用腹腔注射法。在无菌条件下断尾取血,肝素、,50IU/ml,抗凝,生理盐水稀释 7感染血成每毫升含5×10个被寄生红细胞,每只小鼠分别腹腔接种0.2ml。共接种60只昆明小鼠。 1.2.2 薄血片AO法与瑞氏染色法检查 接种后第4,6d断尾取血,并以正常小鼠新鲜血10倍倍比稀释,123456同时制薄血片,相应作为10、10、10、10、10、10不同稀释倍数组。计算原虫密度,并用AO法和瑞 [24]、氏法染色后分别以荧光和光学显微镜,湿片,高倍镜检 ,每片发现三次疟原虫的平均时间。5min观察300个视野未发现疟原虫者为阴性。 1.2.3 实验鼠原虫密度计算 接种后第4,6d,采实验鼠眼球或尾静脉血制成薄血片,瑞氏染色,油镜观察,计算红细胞的疟原虫感染率。同时用血球计数室按上述方法计算每立方毫米血液中的红细胞数。原虫密度,每立方毫米血液中红细胞数×红细胞的疟原虫感染率。 1.2.4 统计学处理方法 配对差值的符号秩和检验、Spearman等级相关、百分位数。 2 结 果 2.1 AO法和瑞氏法染色阳性检出率结果 123410稀释倍数组两法均能立即查见许多原虫,10、10组两法均能检测到原虫,10组AO与瑞氏法的 56阳性检出率分别为98.3%、93.3%,10组分别为58.3%、41.7%,10组分别为16.7%、3.3%。 2.2 各组AO-瑞氏法检出时间配对设计差值的符号秩和检验结果 2345 经SPSS统计软件分析,10、10、10、10稀释倍数组P值均<0.0001,有统计学意义,说明不同稀释 1倍数组两种方法检测发现疟原虫的时间有差别,见表1,。10稀释倍数组两法均能立即查见许多原虫,故不列入统计。 表1 不同稀释倍数组AO-瑞氏法配对设计差值的符号秩和检验 2345 10 10 10 10 检验统计量u值 3.925 5.509 6.277 4.207 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 2.3 不同稀释倍数组时原虫密度与每种方法及两法间检出时间的等级相关分析结果 34 10、10稀释倍数组原虫密度与各法检出时间均为负相关,说明两法能检测到原虫的时间随原虫密度 24减小而延长。10-10四个稀释倍数组AO 法与瑞氏法检测时间均为正相关,见表2,。说明检测同一原虫密度时,若AO法 检出的时间长,则瑞氏法需时也长。 表2 不同稀释倍数组时原虫密度与每种方法及两法间检出时间的等级 相关分析结果,相关系数,P值, 稀释倍数组 原虫密度-AO法 原虫密度-瑞氏法 AO法-瑞氏法 310 -0.635(0.000) -0.662(0.000) 0.863(0.000) 410 -0.384(0.005) -0.543(0.000) 0.707(0.000) 2.4 AO、瑞氏法检测伯氏疟原虫的最低原虫密度 将AO法和瑞氏法能检测出的原虫密度中第5个百分位数作为建议的能检出的疟原虫最低原虫密度。经SPSS统计软件分析,AO法P=11,虫/μl,、瑞氏法P=19,虫/μl,,则两法能检测出的最低原虫密度分55 别为11虫/μl、19虫/μl 。 3 讨 论 伯氏疟原虫系Vincke和Lips于1948年在非洲扎伊尔加丹加山区森林中,从捕获的丛林鼠,Grammonys surdaster,血内发现。它与人体间日疟原虫形态和生活史相似,对小白鼠和大白鼠均易感,因此,被广泛应用于抗疟药物、疟原虫抗药性、疟疾免疫和诊断方法等研究。 以往国内外学者在现场和实验室研究中发现AO法检测疟原虫快速,检出原虫的机率高于传统方法,[5] 如朱声华等采用该法对210例门诊就医发热病人进行疟原虫检测的现场应用研究,与姬氏染色相比,AO法的敏感性为97.2%,特异性为91.2%,两法的符合率为94.3%。检测速度提高2倍以上。但AO法是在低倍或高倍镜下观察,传统法则为油镜,时间上无可比性。本研究伯氏疟感染小鼠血涂片经AO法和瑞氏法染色后均在高倍下检查,瑞氏法观察湿片,更利于两种方法的比较研究。经统计软件分析,当原虫密度在25一定的范围内时,10-10倍稀释,,两法检测发现疟原虫的时间有差别,说明AO法的检出效率比瑞氏法高。 1634当原虫密度很高或很低时,10、10,两法检出时间上无差异。10、10倍稀释时,原虫密度与各法检出时间为负相关。而其它组无相关关系。这是因为原虫密度很高时,镜检即见,两法检出无时间差,高密度原6虫血片仅限于实验室研究及疟疾危重患者,临床上难以遇见。原虫密度等于或低于10稀释倍数组的原虫密度时,镜检均难以检测到或均需较长时间,检测结果也带有很大的机遇性,故统计结果难以反映两法检24测时间的差别或其相关关系。AO法与瑞氏法在10-10倍稀释时检测时间为正相关。两法能检测到的最低原虫密度分别为11虫/μl、19虫/μl,与间日疟发热阈值10-500虫/μl相似。 与瑞氏染色法相比,AO法将染液滴加于血膜即可镜检,且在低倍或高倍镜下检测疟原虫,大大节省时间,在暗色背景下观察,能迅速而可靠地鉴别红黄色的疟原虫,大大减少漏检机会,染色技术简单,稍加训练检验者即可检测与鉴别原虫,每片仅需30μl AO染液,蓄电池和汽车电瓶可作电源。因而具有快速、准确、简单、经济、实用的优点,可推广作为疟疾流行病学调查及后期监测的手段。 参考文献 〔1〕 吴开琛,富秀兰,林宝英,等. 荧光素吖啶橙染色检查疟原虫方法的评价. 中华内科杂志,1978,(4):250~251 〔2〕 Kawamoto F, Billingsley PF. Rapid diagnosis of malaria by fluorescence microscopy. Parasitology Today,1992,8(2):69~71 〔3〕 Lema OE, Carter JY, Nagelkerke N, et al. Comparison of five methods of malaria detection in the outpatient setting. Am J Trop Med Hyg, 1999,60(2):177~182 〔4〕 陈佩惠主编.人体寄生虫学.第四版. 北京:人民卫生出版社,1995:274~276 〔5〕 朱声华,刘 庆,王兴振,等. 吖啶橙染色法检测间日疟原虫的现场应用. 实用寄生虫病杂志,1995,3(3):117~119 作者简介 姜素华,女,37岁,病原生物学与免疫学副教授,华西医科大学98级研究生。新疆石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室,832002,Tel: 2057155,E-mail: jshjane@yahoo.com.cn 。