癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂的研制（可编辑）

癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂的研制（可编辑） 癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫 分析试剂的研制 南方医科大学级硕士学位论文 癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光 免疫分析试剂的研制? 课题来源: 国家科技重大专项? 业 称 专 名 免疫学 学位申请人 贺 安 指 导 教 师 吴英松教授 答辩委员会主席 朱家勇教授 答辩委员会成员 刘培庆教授 彭 涛教授 罗树红教授 董文其教授 李学荣教授 论文评阅人 ~硕士学位论文 癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化 学发光免疫分析试剂的研制 硕士研究生:贺安 指导教师:吴英松教授 摘 要 研究背景及目的 标记免疫学是将标记技术和免疫学技术相结合而建立起来的一门不断发展 的综合学科,也是当代免疫分析的主流核心技术。利用标记免疫学原理建立 的 标记免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强等优点,已被广泛应用于基础医 学 和临床医学领域。近年来,由于新原理、新技术的应用越来越广泛,标记免疫 技术得到了一定的发展。目前最常用的标记免疫分析技术是酶联免疫分析 . ,、化学发光免疫分析 ,、电化学发光免疫分析 ,和时间分辨荧光免疫分析 ,。但、、和 在应用中存在着一些固有的缺陷:酶容易失活,导致的灵敏度不高,被 标记物的空间结构易受到酶的大分子标记影响,使得灵敏度的提高受到限 制;影响因素较多,例如易受环境干扰,发光时间短,化学反应后样品只 可检测一次,无法重复测量,并且为非开放性试剂,试剂价格高;尽管有 一定优势,但也为非开放性试剂,试剂价格高;江测量方式复杂,仪器成本 及维修费用高,环境及样品中同位元素可导致本底受到干扰;另一方面,以上 技术均有一共同的缺点:需通过洗涤分离结合标记与游离标记。因此,有必要 开发出能避免以上缺陷的新型标记技术。由此光激化学发光免疫分析中文摘要,技术应运而生。该技术起 源于年发明的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术,,后美国公司生产相关试剂 。作为近年兴起的新型定量均相免疫学检测技术,它克服了传 统标记免疫学技术需洗涤分离结合标记与游离标记的缺点的同时,还克服了 稳定性差、及无法重复测量及成本高等缺点。它结合激光技术、单 线态氧半衰期短和纳米材料等优势,实现了在均相中进行反应的操作过程。光 激化学发光免疫分析技术具有高通量、高灵敏度、不需分离结合标记与游离标 记、无放射性污染、检测重复性好、操作简单、易于自动化、背景信号低等优 势,已广泛应用于生物医学研究,代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。 血清癌胚抗原. ,为一种传统的广谱肿瘤 标志物,一直受到广泛的研究。它属于胚胎期和胎儿形成期产生的胎儿癌性抗 原。首先发现于胎儿体内和结肠癌组织,是由胎儿胃肠道上皮组织、胰腺和肝 脏细胞合成的一种相对分子量约为 的复杂的可溶性糖蛋白。正常人组 织内含量很低,但在胃肠道恶性肿瘤患者的血清中含量明显升高。此外, 在妇科肿瘤、肺癌及其他恶性肿瘤患者的血清中也有所升高。虽然不能作 为特异性指标诊断某种恶性肿瘤,但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测及疗效 评价等方面仍有重要的临床价值。本研究主要是研制癌胚抗原光激化学发光免 疫分析试剂,探讨其用于临床检测的可行性。 神经元特异性烯醇化酶 ,是由唧、丫丫组成 的肝糖分解酶,主要分布于神经元、神经内分泌细胞。在起源于神经外胚层或 神经内分泌组织的肿瘤病人血清、脑脊液中水平升高,其中患小细胞肺癌 和神经母细胞瘤的患者尤为明显。目前被认为是脑损伤神经母细胞瘤、 急性脑血管疾病、缺氧性损伤等和小细胞肺癌的一项高特异性和高敏感性的 生化指标,对小细胞肺癌病人和颅脑损伤病人的早期诊断、病情监测、疗效评 价等有重要价值。本研究主要是研制神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫 ?硕士学位论文 分析试剂,探讨其用于临床检测的可行性。 方法: 采用双抗体夹心法研制癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免 疫分析试剂。 .受体微球与抗体连接:将. 抗体加入到带有滤膜的离心管中,以 . 重复洗涤次后,在抗体 ,用缓冲液. 离心 /, 溶液中加入 用上述缓冲液配受体微球、 制、. %,用上述缓冲液将体积补充到 ,? 配制封闭未结合 振荡孵育 。加入 用. 位点,?振荡孵育 后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体 微球浓度为 幽。 .生物素与抗体连接:将另一株 抗体加入到带有滤膜的离心管中,以 . /棚 。用缓冲液含.%的. /, 离心 重复洗涤次后,将 抗体溶液中加入肛 /生物素中用 。利用带有滤膜的离心管去除多余的生物素,并将其 配制,室温振动孵育 抗体浓度调整为. 。 .参考品的制备:用标准品缓冲液将抗原配制成 /、 /、 分装冻干, /、 /系列浓度,每瓶. /、 /、 ?保存备用;用标准品缓冲液将抗原配制成 /、 /、 /、 分装冻干,?保存 /、 /、啦系列浓度,每瓶. . 备用。 .试剂性能指标的评价 .准确度实验:试剂参考标准品用相应浓度的国家标准品进行多次分析测定, 并以国家标准品为对照品,并以自制标准品的实测浓度与标示浓度的比值 在...之间作为评价准确性合格的标准。 .标准曲线的绘制:以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值 中文摘要 计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型.函数处理。 .标准曲线工作范围及效应:将参考标准品抗原稀释成不同浓度进行测 定。 .灵敏度实验:将零参考标准品当作样品测量次,计算其均值及标准差。 以其测定值的均值加上倍标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线 方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。 .回收率实验:将参考标准品中某一点按:加入到质控品、、?之中, 计算其理论值及实测值的比值,即回收率。 .精密度实验:重复测定、、个血清质控品各次,得到各质控品 检测值的均数、标准差及值。 .特异性实验:将一定浓度的干扰物质作为样本检测得到的相应浓度即为特 异性。 .干扰性实验:对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定, 计算其回收率。 .正常参考值范围:以自制的试剂检测健康人血清,统计其血清水平的分布 情况。 .与国外试剂的比较实验:样本用自制试剂与对照试剂检测后将所测浓度值 进行阴阳性比较、配对非参数秩和检验及相关性分析。 结果: 以国家标准品为对照品,试剂参考标准品实测浓度与标示浓度的比值 在..之间;自制试剂灵敏度为. /,标准曲线工作范围为 /;试剂分析内变异系数为.%?.%,分析间变异系数为 、 .%.%与、 .、人血清白蛋白无交叉反应:检测血清样本时不受血红蛋 白、甘油三酯、胆红素的干扰;推荐血清水平的正常参考值范围为. /;将份血清标本用本试剂与国外罗氏电化学发光试剂同时检测,配 对非参数秩和检验结果如下:.,..,表明两试剂在检测 硕士学位论文 浓度上无统计学差异;进行相关性分析,其相关系数,.为.。 自制试剂灵敏度为. /,标准曲线工作范围为 / 回收率为.%.%;试剂分析内变异系数为.%.%,分析间变异 系数为.%一.%;与一 、 无交叉反应;检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三 酯、胆红素的干扰;推荐血清水平的正常参考值范围为.. /;将 份血清标本用本试剂与国外罗氏电化学发光试剂同时检测,进行配对非参 数秩和检验,结果显示:..,..,表明两试剂在检测血清中 上无统计学差异;进行相关性分析,其相关系数,.为.。 结论: 上述结果表明本研究研制的癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶光激化学发 光免疫分析试剂的各项指标准确性、灵敏度、精密度、特异性等均达到临 床检测试剂要求,有望替代国外昂贵试剂应用于临床检测和基础医学的研 究。 光激化学发光免疫分析癌胚抗原神经元特异性烯醇化酶检测 关键词: 硕士学位论文 : . . ., . , , . /. , . ,. , , . ,.? . 勰 . :. . . , : ., . ’ ?. . . ,.,., , , .. .. . . . , . . . .项士学位论文 , . . 、. , ., , . ?? . : .:. . ., . / . .%. / / . 肛. , 巧 . .. .. :. ., / . .% . % /. ? ., ?? 、, . . . / .: , . ,,,, /. ,, ,, /. 硕士学位论文 .:舱 . ,, . . . : . :.. . : .., . ~ . : . . . :, . ,, . :, . . . .: . , . ? : . .. ./. ? ... .. . /. . /. .%..% 伍 .%..%.. ?、析?., . /. .妒..硕士学位论文 目 录 摘 要??.??. 前 月 言?. 吾?.上 第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制?.. .材料? .方法?....结果? .讨论?. 第二章神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试 剂的研制?。 .材料? ? .方法? .结果? .讨论? 参考文献?。 中英文缩略词. 硕士期间论文发表情况?。 致 谢学位论文原创性声明??. 统计学证明.硕士学位论文 ? .? 刖 吾 标记免疫学,是将标记技术和免疫学技术相结合进行分析测定的学科, 是集基础医学、实验技术和临床应用于一体的学科,其基本原理是利用抗原 抗 体反应的高度特异性和各标记物的高灵敏可测量性来检查体内各种生物活 性物 质的活性和浓度。随着标记技术、单克隆抗体技术和分子生物学技术的不断 发 展与完善,标记免疫学已广泛应用于医学、农业、环境及食品检测等多个领 域【司。 免疫分析由常量分析向微量分析转变,技术上由放射免疫分析技术向非放射 免 疫分析技术、非均相免疫技术向均相免疫技术发展,是不断发展的学科。 目前该学科包括一系列的免疫分析技术:荧光免疫分析 ,、放射免疫分析,、酶免疫分析 ,、胶体金免疫分析,、化学发光免疫分析 ,及新兴的电化学发光免疫分析 ,、荧光偏振免疫分析 , ,、时 、微粒子酶联免疫分析 间分辨荧光免疫分析. ,和光激化学发 光免疫分析, 等。 最早产生的是在荧光显微镜下直接观察到的特异性荧光的抗原抗体复 合物,但用普通荧光分子女作为标记物容易受到散射光、不同来源的背景 荧光及荧光淬灭等多种因素的干扰【,,从而导致的灵敏度较低,一般仅为。 ? 蚜,传统的在实际应用中也只限于测定一些对灵敏度要求不高的 待测物的检测,很难适应微量抗原抗体检测的需要。年美国学者和 用放射免疫法成功测定血浆胰岛素,由此开创了标记免疫学的新纪元, 使得生物化学分析进入了一个真正的超微量分析时代,在产生后的几十年前 言 ,?一直是免疫分析的主导方法。然而同位素作为标记物也为带来了一 些不可避免的缺陷:试剂的生产、运输及使用必须采用相应的射线防护 ,使用后的废物必须经过特殊的处理;由于放射性同位素的自身衰变 作用,决定了试剂的有效期较短;同位素标记物的稳定性差,导致试剂 分析间、分析内的变异较大;标准曲线有效期短,必须每次定标,造成浪费; 难以实现操作和测量的自动化。更重要的是,其半衰期与比活度之间的矛盾 决 定了其有限的可检测性。随着越来越多含量极微而又具有生物学意义的物质 需 要精确的定量,较低的比活度已明显不能满足超灵敏免疫分析的需要。在 年代末年代初,非放射性核素标记免疫分析. , 在的基础上迅速发展起来,并形成试剂与仪器的商品规模化生产, 迅速降低了在免疫诊断技术中的地位。年瑞典学者和 、荷兰学者 和分别报道将免疫技术发展为检 测体液中微量物质的固相免疫测定技术,即,它是将抗原、抗体的特异性免 疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析技术。酶标试剂制 备 简单、稳定、有效期长,酶催化底物生成的有色产物可直接用肉眼观察,也可 借助于简单的仪器作定量测定,由于酶的高效催化作用是一个强的信号放大系 统,其灵敏度接近,因此有望代替成为一种新的方法,但是随着 的应用人们发现:通过测量酶反应产物.值对酶活性定量是一种不够灵敏 的定量方式,至多为半定量检测;酶反应产物.值仅在低浓度范围与酶活 性呈线性关系,对于血清中高浓度值的待测物如、,效应严 重,降低了待测物测量值的准确性;酶的活性容易受各种因素如样品或 者缓冲液中的成分、值、温度等的影响而失活,导致灵敏度不高; 的大分子标记容易影响被标记物的空间结构,使得的灵敏度进一步受到限 制。年,趾【等将高特异性的抗原.抗体反应与高灵敏度的的化学发光 反应相结合,建立了化学发光免疫分析技术,经过三十多年的不断发展,在方 法学研究和仪器研制方面取得了很大成功,直接以化学发光物质如鲁米诺 为标记物,具有灵敏度高、特异性强、标记有效期长、检测范围宽、自动化程 硕士学位论文 度高的特点,但是其影响因素较多,易受环境因素的干扰,发光时间短,无法 重复测量【,且为非开放性系统,试剂价格高。新型的电化学发光免疫分析技 术是基于化学发光免疫分析技术上发展起来的新型免疫诊断技术,它是利用三 联吡啶钌”】和三丙胺在电场触发下产生化学发光反应,具有灵敏度高、 检测程序简单、快速等特点,易于做均相免疫测定【】,但是目前仍然面 临同样的问题。作为年代标记免疫分析中的佼佼者,是将镧系元 素标记和时间分辨荧光测量相结合【】,具有灵敏度高 /孑、标准曲 线范围宽、标记物制备简单且稳定、无放射性污染、多标记等优势,但是其测 量方式复杂,需通过洗涤分离结合标记与游离标记,仪器成本及维修费用高, 环境及样品中同位元素可导致本底受到干扰【】。光激化学发光免疫分析技术起 源于年由提出的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术【 公司生产 ,,后主相关试剂。该技术采用了纳米级微球,这大大增加了生物分子的 包被面积,同时借助于生物素.链霉亲和素放大系统,使单位体积反应体系中含 有更高浓度的生物分子,另外微球上的高密度的光敏剂极大的扩增了信号,为 实现超高敏感性、减少标本用量和试剂用量奠定了基础;另外,这种纳米微球 在液相中保持稳定的悬浮状态,并借助于“结合则发光”原理,实现了均柜、 一步、免清洗和高通量的检测。】,并以其高灵敏度和高特异性等突出检测性 能为世人所瞩目。目前己应用于蛋白质、多肽激素、酶活性、核苷酸等研究领 域,并能够用来研究受体/配体、蛋白质/蛋白质、蛋白质/之间相互作 用。 一光激化学发光免疫分析的原理 光激化学发光免疫分析技术为一种新型微量定量免疫分析检测技术,是一 种通过化学发光检测微球间的结合,进而检测待分析物含量的方法。在均相条 件下将带有染料的供体微球、包被有活性分子且带有发光化合物的受体微球以 及检测样本混合。此时供体微球和包被有活性分子的受体微球可迅速有效地捕 捉靶分子而形成免疫夹心复合物。在 的激光照射下,供体微球中的光敏前言 物质受到激发并催化周围的氧分子形成高能态的单线态氧,该高能态的单线态 氧扩散至受体微球,产生一系列的化学发光反应,最后将能量传递给铕,发射 出波长为 的信号。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短约“, 只能扩散约 的距离,因此只有那些通过待测物质连接在一起的受体微球 和供体微球才能产生信号,当生物分子不存在特异的相互作用时,单线态氧无 法扩散到受体微球,则不会产生信号【】见图。 棚科?蝴日?一 图光激化学发光免疫分析原理图. 二光激化学发光免疫分析的优势 .高通量,高效率 可在孔板、孑板、孑板、孑板中进行反应,样本 量用量少低至止,实现了小型化、高通量。由于反应在均相环境中进行, 反应进行得非常彻底和迅速。反应所需的孵育时间比酶联免疫吸附技术和时间 分辨荧光免疫技术等非均相反应要短。通常一步孵育时间在 左右,而酶联 免疫吸附测定技术等通常需要 以上。另外由于反应在均相中进行,无需洗涤, 操作简便,自动化程度高,减少了人力资源的安排以及工作人员的交叉感染机 石 .灵敏度高 硕士学位论文 是目前灵敏度最高的检测技术之一,灵敏度约可达到。 孔的水平,主要有以下几方面的原因:供体微球含有高密度的光敏剂,每 个微球每秒可释放高达个单线态氧分子,极大的扩增了信号;同时 受体微球上连接上许多抗原、抗体或核酸分子,因此参与反应的分子多; 采用了生物素.链霉亲和素放大系统;反应在均相条件下进行。 .线性范围宽,稳定性强 检测的线性范围可达到.个数量级,而酶标只能达到.个数量级。均相反 应会使反应更加充分,同时实现了一步化检测,使随机误差及交叉污染降至最 低;单线态氧的能量传递不易受到样本常见干扰物质、值、离子强度及温度 等因素的影响,保证了检测稳定性?。 .背景低,抗淬灭能力强 ,几乎不存在生物分子和反应底物的 激发光波长较长 发光干扰,发射光较短 ,远远低于激发光波长,避免了激发光对测量 ,非常尖锐,基本没有来自样品的淬灭干 的干扰。发射波长为 扰,是进行复杂样品检测的理想选择,如血浆和血清等?。由于从供体微球 受到激发到受体微球产生发射光的整个反应的半衰期为. ,可使用时间分辨 的 检测模式,进一步降低了本底信号,确保了结果的真实性。实验中使用的感光 物质和发光物质包埋在微球之中,因而免受环境干扰,有利于减少本底信号。 .适合生物大分子及相互作用的检测 的距 单线态氧分子在溶液中可以扩散到 的距离,故在小于 离供体微球与受体微球之间的相互作用均可以被检测到,因此应用光激化学 发 光技术可检测完整蛋白质、酶复合体、噬菌体等复杂的生物大分子及相互间 的 作用。其他均相技术,如时间分辨荧光、荧光偏振,仅限于直径为 以内 的分子的检测。 .检测方式灵活多样前言 技术非常灵活,可进行多种形式的实验,包括竞争性实验、结合试 验、解聚实验、检测实验等。可以使用直接检测的方式,也可以选择间接检 测 的方式。 综上所述,由激光技术、纳米微球技术、单线态氧等相结合的光激化学发 光免疫分析技术,有区别于其他免疫标记技术的特点和优势表.。 表光激化学发光免疫分析法与酶联免疫分析法比较 . 光激化学发光免疫分析 酶联免疫分析 . .。 力法 线性范围 .个数量级 .个数量级 精密度 好 一般 检测性质 均相,无需洗涤 非均相,至少个洗涤步骤 高通量 ///孔板均可 孔板 抗体要求高/低亲和力抗体均可应用 高亲和力抗体 上样量 .止 .止硕士学位论文 检测性质 均相,无需洗涤 非均相,需洗涤 高通量 // /孔板均可 ,孔板 自动化 易自动化 不易自动化 本底噪声 零本底 易受干扰 待检测物大小 小分子到细胞均可 小分子到蛋白质,细胞需进行处理方可检测 上样量 ? ?止 抗体要求 高/低亲和力抗体均可应用 高亲和力抗体 犍, 三光激化学发光免疫分析技术的应用 光激化学发光免疫分析技术目前已得到广泛应用,包括了蛋白质、多肽激 素、酶活性、核苷酸等研究领域,在临床疾病的诊断及治疗上有重要价值, 在 受体/配体、蛋白质/蛋白质、蛋白质/之间相互作用方面的研究成果对 发病机制和新药开发研究具有重要指导意义。 旦一 .小分子半抗原 .地高辛 地高辛中毒患者的病情十分危急,因此要求我们快速并准确的做出诊断。 ,而 目前,临床多采用化学发光免疫分析技术进行检测,整个反应过程约 采用技术,时间将缩短为. ,而且两者的检测性能相仿【。 .环孢霉素 传统方法高压液相、放免分析等一般在全血样本溶解后,需要离心去除细 胞碎片;方法可直接在上述混合溶液中进行,由此简化了操作步骤,减少 了实验误差,其有效检测范围为嵋/捌。 .其他 其他小分子物质包括雌二醇、游离甲状腺素、叶酸等,都可以采用方 前言 法检测。与传统分析方法比较,具有反应时间短、样本用量少、操作简便等 优 点【捌。 .抗原分子 .促甲状腺素 利用化学发光免疫分析技术检钡的灵敏度为. 肌,而采用方 法灵敏度更高. /,,这对于亚临床甲状腺机能亢进的诊断与治疗更为 有利。例垂体切除后患者期望值为零检测浓度与 /浓度差异 显著性检验无统计学意义【捌。为适应高通量、多项目和小型化芯片技术, 等将样本用量由常规的 一般免疫分析技术用量为?此减少至 此,虽然检测灵敏度有所下降 /和 /,但是仍满足临床要求。 .绒毛膜促性腺激素 临床上进行检测时,其浓度常超过 /。目前绝大多数免疫分析技 术的检测上限达不到,因此样本需要稀释后重新检测,甚至多次稀释,这不仅 造成试剂浪费,而且增加了工作量。等用技术检钡,与常规免 疫检测技术比较,其线性范围更宽. /,样本用量更少 、 检测时间更短. ,这便于穿刺液量少和急诊患者的检测【】。 .胰岛素 和应用技术在孑板上测定人血浆胰岛素,样本用量 仅此,分析灵敏度为. /,最高浓度可以达到 /,功能灵敏度为./。同时具有较高的精密度,其分析内的变异系数范围 为.%..%, 分析间变异系数范围为.%..%;中度溶血、黄疸、脂血、生物素、维生素 对检测无明显影响;、枸橼酸盐及肝素抗凝血浆和血清检测结果无差异; 与同类试剂相比具有很好的相关性。 . 淀粉样蛋白 等采用技术检测血清淀粉样蛋白和,其灵敏度 ,较分析技术灵敏更高,适用于老年性痴呆病的早 期诊断【剐。 硕士学位论文 .其他 国内将光激化学发光检测技术原理应用于多种抗原物质的检测,如肌红蛋 白【、肌钙蛋白【】、肿瘤坏死因子【、.人绒毛膜促性腺激素阎等等,其方 法 学特性和临床检测性能均满足临床检测试剂的要求,有望应用于临床检测和 基 础医学的研究。 .核苷酸 等采用技术对目标分别进行实时.和终点 测量,目标浓度的检测范围可达到倍和倍,对单链扩 增片段的检测灵敏度可达到. /。等【】利用技术建立了单核 苷酸多态性分析平台,对基因组每个基因型进行精确定量,其灵敏度 心。与传统分析方法比较,该技术省去了扩增后产物纯化和酶反应 过程,操作简便、快速,而且样本用量减少至/.,应用前景广阔。 罄 .配体与受体 . 和 属于肿瘤坏死因子受体超家族,其配体与具 有同源性,与淋巴细胞介导的炎症效应有关。因此,高通量筛选与 特异性结合干扰物拮抗剂在药物开发抗炎领域具有非常重要的价值。 等【】应用该技术发现,苏拉明和肽可拮抗和的特异性结 合,这对抗炎药物的开发有意义重大。 .其他 许多学者将该技术应用于其他受体一配体结合研究,如孤儿核受体型类固 醇生成因子.和.】等。 .蛋白激酶及其抑制物 蛋白激酶与多种人类疾病有关,因此,对蛋白激酶活性及其抑制物的研究 同样在药物开发领域具有重要意义。等利用该技术对细胞溶解液内的 .氨基端激酶?活性进行研究,发现能抑制细胞因子对重组或内源性 的激活作用的抑制物有和抑制物】。 前言 四本论文的研究内容 癌胚抗原 ,升高常见于结肠癌、直肠癌、 癌和肺癌患者,为一种广谱肿瘤标志物;神经元特异性烯醇化酶 ,是神经母细胞癌和小细胞肺癌的肿瘤标志物, 床上常用于小细胞肺癌和非小细胞肺癌的鉴别诊断。本文对光激化学发光免 分析技术进行了详细的论述,并采用双抗体夹心法建立了癌胚抗原和神经元 异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析法并研制了其相应的诊断试剂,对其相 反应条件做了摸索,同时对其性能指标和临床应用价值做了初探,以期用于 床疾病的诊断与鉴别诊断、病情监测及疗效评价,为快速、准确、高通量检 血清标志物提供了一种崭新的技术手段。 硕士学位论文 第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制 利用光激化学发光免疫分析技术、采用双抗体夹心法研制人血清癌胚抗原 的快速检测试剂,并对试剂的各项性能指标进行评估。试剂的准确度、 灵敏度及精密度等均符合体外诊断试剂的要求,与罗氏电化学发光免疫分析 试 剂进行比较,自制的.试剂与其并无明显差异,而且具有操作快 速简便、价格相对较低、易实现自动化等优点,具有极大的科研及临床应用 潜 力。 .材料 ..主要试剂和材料 两株配对单克隆抗体和为本科室自制,抗原购自美国 公司;国家参考标准品及质控血清购自中国药品生物制品检定 所;生物素购自于公司,批号为;受体微球、链霉亲和素化的供 体微球为美国公司产品;电化学发光免疫分析对照试剂为瑞士罗氏 产品;蛋白定量分析试剂为美国公司产品;超滤离心管为美国 公司产品;孔乳白色微孔板为美国公司产品 规格:孔,孔透明微孔板为广州洁特生物过滤制品 有限公司产品。 实验用水:要求是去离子亚沸三蒸水,严格避免稀土元素污染,采用经过 公司 纯水制备系统处理后的纯净水,值范围 .?.,电导. .,总有机碳含量 。 ,本底信号值 ..血清标本 份人血清标本均来自广州南方医院,其中健康者血清标本份,血 清标本相关资料由医院提供。 ..主要溶液第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制 。 受体微球与抗体的连接缓冲液:. . /、 .配制 受体微球与抗体的连接溶液:用. /, ,现配现用。 / 封闭液: /用. /配制,现配现用。 . 受体微球化抗体保存缓冲液:. , .%.。 . 生物素与抗体连接缓冲液:含.%的. /, 。 生物素溶液:生物素用溶解,并将生物素浓度配置成 /, 现配现用。 /, 生物素化抗体保存缓冲液:. . ..%。 / 、 、 / 、 分析缓冲液: / .%、.%牛丫球蛋白、.%.、.%、.%庆大 霉素加入 / .缓冲液中充分溶解,过滤,?保存。 标准品缓冲液:.%、.%、.%.、.% / 一加入到 ..的缓冲液中,过滤,?保存。 ..主要实验仪器 计、..电子天平均购自公司; 型冻干机冻干面积. 为美国公司产品; 超纯水制备系统购自美国公司;.型微量振荡器购自江苏 康健医疗用品有限公司;.型微孔板恒温振荡器购自杭州奥胜仪 器有限公司;.型磁力搅拌器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公 司; .离心机购自美国公司:酶标仪为美国. 公司产品; 矗?检测仪为美国公司产品图.。 硕士学位论文 图.光激化学发光免疫分析系统 ...方法 ..反应模式的选择 采用夹心法反应模式,见图.:第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的 研制 抗体的预处理:由于保存抗体的缓冲液中一般含有叠氮钠 或一级胺,这些物质需要去除,同时抗体要达到一定的浓度如连接 的受 体微球,抗体浓度至少应达到 /才有良好的连接效果,故首先需对抗 体进行浓缩和去除杂质处理。目前常采用的有两种抗体预处理方法:采用 透析袋透析处理;采用美国公司的带有滤膜的离心管处理。 表两种抗体预处理方法的比较 . 经过比较可以看出,滤膜过滤法远较透析袋透析法理想。在成本可以接受 的情况下,选择滤膜过滤法进行标记抗体的预处理,所以我们选择了方法, 步骤如下: 抗体的浓缩:将一定量抗体加入美国公司的带有滤膜的离心管 中, 离心 。将浓缩后的抗体加入 此缓冲液, 离心 后弃掉滤液,再加入肚缓冲液, 按上述方法离心 ,此步骤重复次,此过程中可适当减少 , 加入的缓冲液。 抗体的收集:将几次离心后的离心管取出,弃掉滤液,把离心管的滤膜反 转, ,收集所得滤液即所需要的抗体。完成后再次将滤 离心 膜反转,加入止缓冲液,静置片刻,使滤膜将待连接抗体缓冲液吸收, 留在滤膜上的残余抗体溶解下来,将滤膜重新反转过来, , 离心 硕士学位论文 收集滤膜上的液体,以上步骤重复.次,以使滤膜上的抗体尽可能多的被回 收,重复离心过程中可适当减少加入的缓冲液。整个过程完成后收集抗体 大约. 左右。 抗体浓度的测定:采用蛋白定量分析试剂确定该抗体的浓度,按照说 明书进行操作,具体步骤如下: 配置标准品系列浓度:用去离子水将标准品稀释成以下系列浓度: /、. /、 /、. /、. /、. /、. /、. /、 /; 配置工作液:根据标准品和样品数量配置工作液,将液、 液按体积比为:的比例进行配置,充分混匀混合时可能会有浑浊,但 混匀后就会消失。工作液室温数天内仍稳定; 待检测样品用去离子水作适当稀释,将 上述标准品及样品分别加入到 。 孔透明板的样品孔中。各孔加入 工作液,?孵育 将板条放置室温数分钟,将其冷却至室温,用酶标仪 波长测定,根 据标准曲线计算抗体浓度,并将抗体浓度调整成 /。 受体微球的预处理:由于保存受体微球的缓冲液中一般存在防腐剂和 去污剂等,这些物质影响受体微球与抗体的连接效率,需要去除,故将保存受 体微球的缓冲液换成缓冲液。在此,我们采用离心的方法,取一定量受体 微球溶液至离心管中, 后去上清,再加入一定量的缓冲 离心 后去上清,重复此步骤 液将受体微球重悬,再次 离心 三次,最后用缓冲液将沉淀超声重悬,调整受体微球浓度为 /。 受体微球与抗体的连接:受体微球与抗体的连接要求连接效率高,并 且不能对抗体的活性造成大的影响。待连接抗体和待连接受体微球完成预处 理 % 后,取出. 抗体溶液和 受体微球、“溶液、. 将其混匀,用缓冲液将体积补充到 ,?避光振荡孵育。 封闭:待上述反应完成后再在其中加入“溶液封闭未结合 。. 位点,?避光振荡孵育第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制 纯化:为去除未反应的抗体,我们采用离心去上清的方法, 离心 后去上清,再加入一定量的缓冲液将受体微球重悬,再次 后去上清,重复此步骤三次,最后用缓冲液将其沉淀超 离心 声重悬,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为 /。 保存:按照受体微球化抗体的工作浓度:用分析缓冲液对抗 体进行稀释,置?保存。 ..生物素与抗体的连接 抗体的预处理:具体操作同..,但缓冲体系换成缓冲液, 将抗体浓度调整为 /; 生物素与抗体的连接:按照公司说明书将抗体溶液与生物素溶 液按体积比:进行混匀,室温振荡孵育 ; 纯化:采用美国公司的带有滤膜的离心管去除多余的生物 素。具体操作同..,但缓冲体系换成缓冲液。 抗体浓度的测定:采用蛋白定量分析试剂确定生物素化抗体的浓度, 具体操作同上,并将其抗体浓度调整为. /。 ..生物素化抗体的过滤除菌及保存 按照生物素化抗体的工作浓度:用分析缓冲液对抗体进行稀释,. .滤膜过滤除茵,置?保存。 ..链霉亲和素化供体微球的制备、分装及保存 按照链霉亲和素化供体微球的工作浓度 ./用分析缓冲液对其进 行稀释,分装于 的棕色塑料瓶中并加贴标签,置?避光保存。 ..受体微球化抗体和生物素化抗体的制备、分装及保存 按照人份标准,对受体微球化抗体和生物素化抗体按工作浓度进行稀 释,生物素化抗体稀释后经过.岬滤膜过滤,分别分装于 的塑料管中 . /瓶并加贴标签,置?避光保存。 ..参考标准品的制备 用标准品缓冲液将抗原配制成 /、 /、 /、 /、 硕士学位论文 分装冻干,?保存备用。 /、 /系列浓度,每瓶. ..分析操作方法 将试剂放置室温平衡;向微孔条中依次加入 待 测样品、此生物素化抗体、此受体微球化抗体,加贴封片;微孔反 应条在?恒温振荡仪内振荡孵育 在避光条件下加入链霉亲和素 化供体微球 ; ;微孔反应条在?恒温振荡仪内振荡孵育 检测仪上检测信号值。 ..方法学评价 ...准确度实验 试剂参考标准品用相应浓度的国家标准品进行多次分析测定,并以国 家标准品为对照品,计算试剂参考标准品的实测浓度与标示浓度的比值。 ...标准曲线的绘制 磺域 以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值计数的对数 为纵坐标,由双对数数学模型?函数处理。 抽 ~. ? ...标准曲线工作范围及效应 将参考标准品抗原稀释成不同浓度进行测定。 一 ...灵敏度实验 以零参考标准品当作样品测量次,计算其均值及标准差。以其测定值的 均值加上倍的标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所 得出的浓度,即为其灵敏度。 ...精密度实验 以中国药品生物制品检定所提供的、、?个血清质控品,对各血清 质控品进行测定,各设个复孔,计算各质控品检测值的均数、标准差及 值。按照版生物制品检定规程,分析内%,分析间%。 ...特异性实验 将、、.及人血清白蛋白稀释至一定浓度进行测定。 ...干扰性实验 第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制 检测本实验研发的光激化学发光免疫分析试剂在干扰性物质溶血、高血 脂、高胆红素存在的情况下检测标本的准确性。 将血红蛋白溶液 的阳性血清标 /分别取适量加入到 本中,使血清中血红蛋白的含量分别为 /、. /。 将甘油三酯溶液 的阳性血清标 /分别取适量加入到 本中,使血清中甘油三酯的含量分别为 /、. /。 将胆红素溶液 的阳性血清标本 /分别取适量加入到 中,使血清中胆红素的含量分别为 /、 /。 按试剂操作说明书对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本 进行测定,计算其回收率。 ...正常参考值范围 以自制的.试剂检测份健康人血清,统计血清水 .进行处理。 平的分布情况。数据采用统计软件 ...与国外试剂的比较实验 用自制试剂检测阴、阳性血清各份,按试剂中的 说明书进行操作,评估该试剂检测的灵敏度及特异度等值。同时,采用 试剂及自制.试剂检测这份血清样本,使用统计软件 .进行数据处理并进行配对非参数秩和检验及相关性分析。 .结果 ..准确度实验 以国家标准品为对照品,试剂参考标准实测浓度与标示浓度的比值 在...之间结果见表.,符合国家准确性合格...的标准。 ???????????????’??????’ ?’??????????????????????????????????????????一一?? 硕士学位论文 表自制试剂准确度考核结果 .?..剂量.反应曲线 以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值计数的对数 为纵坐标,由双对数数学模型函数处理,测得试剂剂量.反应曲 线线性相关系数为.见图,表明自制试剂具有良好的剂量反应钱 性关系。 翊 资 趣 浓度值/ 图 试剂剂量一反应曲线 . .标准曲线工作范围及效应 由图?和.可见,标准曲线工作范围为 /。当浓度超 过 /时,所得信号值不再按线性升高,当浓度达到 / 时信号值反而下降效应。 第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制 警 佘 犟 浓度值 图 ?试剂效应 . ..灵敏度实验 以零参考标准品次测定值的均值加上倍的标准差所得的信号值扣除本 线方程计算所得最小测定值的浓度为. /。 用自制试剂进行检测,利用统计软件 .分析 变异系数为.%..%结果见表.,和分析间 结果见表,均符合试剂的检定要求。硕士学位论文 表分析间精密度测试结果 . ..特异性实验 将一定浓度的、、.、人血清白蛋白等作为样品用自制 试剂测定,检测结果均低于自制试剂的分析灵敏度水平,表明上述物质与 均无交叉反应结果见表.。 表?自制试剂特异性实验结果 . ..干扰性实验 将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率,回收率在./.%之间。 表明自制试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰结 第一章癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂的研制 果见表.。 表血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰实验 ., ..正常参考值范围的确定 用自制试剂检测份健康者血清,检测的最低值为 /,最高值为 . /,平均浓度为. /,标准差.妨. /。从表 .及图.结果可以看出,大多数标本的浓度值在. /以下.%, 均值加倍标准差等于. /,而当浓度值在. /以下时,包含了 .%的标本。综合其他人的研究及临床现行参考值,建议设定本试剂检测时的 血清正常参考值范围为. /。硕士学位论文 表.正常人血清水平检测结果统计分析 . 图. 检测健康者血样浓度分布图 ...与国外同类试剂的比较实验 阴阳性血清标本各份电化学发光诊断试剂 测定 用自制试剂测定,结果两种诊断试剂的阳性符合率和阴性符合 率均为%。这份临床血样同时用自制试剂与罗氏电化学发光诊断试剂进 行平行检测,测定的数值属于非正态分布,将其进行配对非参数秩和检验,结 果如下:.,..,表明两试剂在检测上无统计学差异;同 时进行相关性分析,结果如下:..,.,. 图,显示自制试剂与罗氏电化学发光试剂所测得的数值有显著相关性。