【doc】肿瘤浸润淋巴细胞研究进展

【doc】肿瘤浸润淋巴细胞研究进展 肿瘤浸润淋巴细胞研究进展 江西医学检验1996年第l4卷第3期 HCV?J.和美国的HCV?I的nt和aa序列 在NSa和NS.区均有差异,而且这种差异除5, ' 端非编码区外,存在于整个基因组中HCV 基因多样性提示存在多种基因型.Moris等从 泰国分离到二个HCVNS基因片段,同已知 的HCV序列同源性仅达60%左右aa同源 性也仅有7O上下.故推测HCV基因型可能 存在6种不同(I,?,?,N,V,?)类型.但 目前尚无统一的亚型分类方法.RNA病毒这 种变异是由于RNA复制过程中高度的错误 '3' 参入所致. 鉴于上述资料介绍.输血后丙型肝炎.典 型的病例都有抗HCV和HCVRNA阳性,伴 有肝功异常(ALT升高).部分患者抗HCV出 现迟缓.须经动态观察.单纯抗HCV阳性伴 有肝功异常者,则要慎重对待,除反复检查抗 HCV和HCVRNA,以确定是否HC,同时要 排除甲型,乙型,丁型或戊型肝炎和EB病毒, 巨细胞病毒感染的可能.单纯抗HCV阳性, 不能诊断为现症丙型肝炎. 肿瘤浸润淋巴细胞研究进展 江西省肺科医院熊国亮 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL,tumorinfil. tralinglymphocyte)是八十年代早期由美国 国立癌症研究院(NCI,NationalCancerInsti— tute)的Rosonbcrg等首先分离出的一种特殊 类型的淋巴细胞.因为发现TIL抗肿瘤的活 性是外周血淋巴细胞(PBL,Peripharalblood lymphocyte)的50—1?倍.被誉为继PBL来 源的淋巴因子激活的杀伤(1ymphokine activatedkiller)细胞,即LAK细胞之后的第 二代抗肿瘤效应细胞,因而更为人们所重视. 由于TIL具有良好的肿瘤病灶趋向性以及很 高的杀瘤细胞活性.因此也是肿瘤基因治疗最 为重要的靶细胞之一.以外源基因转导TIL 进行抗肿瘤基因治疗,一方面利用TIL的肿 瘤病灶趋向性以达到肿瘤导向治疗目的另一 方面,一些外源基因的表达还可大大提高TIL 杀伤肿瘤细胞的活性因此人们称外源基因转 导的TIL细胞为第三代抗肿瘤的LAK细胞. 一 ,TIL的分离培养 由于生物技术和免疫学技术的不断 发展.分离制备TIL的技术不断改进.目前分 离TIL的.包括多种人体实体瘤组织以 及癌性胸水,腹水等.从肿瘤组织块获得TIL, 一 般要经过肿瘤组织用机械和酶消化法制备 单细胞悬液,不连续密度梯度离心法获取富含 TIL的细胞悬液,以及在白细胞介素n刺激下 获得优势增长等三个步骤.一般情况下每克 肿瘤组织可分离10TIL细胞. TIL体外培养严防污染,除加入IL?2.以 及完全RPMI1640培养基以外,还需要加入 一 定比例的条件培养液,每4—6天可以扩增 2—10倍平均培养30天左右时,TIL平均扩 增65000倍. 二,TIL生长动力学 了解认识TIL生长的动力学,有助于翩 备高抗瘤活性,数量足够的抗肿瘤效应细胞以 用于实验和临床研究.TIL的抗瘤活性也与其 增殖动力学密切相关.培养的早期(4一l5天) 活性较低,20—30天时其杀伤活性最强,继续 培养,其抗肿瘤活性降低,至8O天时达最低水 平. 影响体外TIL培养的生长动力学的因 素,除了细胞悬液中肿瘤细胞及其分泌的某些 抑制因子可抑制TIL生长以外,TIL膜表面 的IL一2受体数量,以及先前是否经过治疗有 关.如果TIL膜表面的IL一2受体数目较少, 难以获IL一2的有效激活,TIL会慢慢死 去.如果TIL分离之前经过放疗,大量瘤细胞 ?4? 死亡.使瘤细胞诱导的抑制细胞或抑制因子大 .影响 大减少?因而TIL增殖的潜伏期缩短 TIL生长的动力学. 三,TIL的表型 经荧光激活细胞分检器(FACS)分析TIL 的表型标志.新鲜制备的单细胞悬液中,均以 T细胞为主.除黑色素瘤,头颈部肿瘤分离的 TIL中cD细胞明显多于cD细胞外.从其 它肿瘤组织中制备液中细胞表型不同.一方面 反映了肿瘤原位TIL细胞亚群的实际情况; 另一方面可能是肿瘤本身导致了一种或多种 已知的具有重要抗肿瘤细胞毒性的效应细胞 亚群的缺失.抑或分离过程中某些细胞亚群的 丢失所致 目前已公认在细胞培养的过程中.肿瘤细 胞,B淋巴细胞等逐渐消失,T淋巴细胞可选 择性地进行扩增.但对选择性的扩增的亚群, 其实验结果并不十分一致某些肿瘤类型中选 择性扩增的是cD细胞.而另一些肿瘤中则 是cD细胞.目前对导致某一细胞亚群选择 性扩增的原因并不清楚,但一般认为.随着培 养的时间延长.CD;绍胞的比例逐渐增多.而 CD:细胞的比例逐渐减少.提示细胞亚群的比 倒与培养时阃存在着一定的关系. 四,TIL的体外激活 肿瘤宿主的免疫抑制是主动免疫治疗不 能奏效的主要原因.抗体的转输不能转移它的 抗肿瘤免疫性.而非特异刺激荆的效应有赖于 宿主高水平的免疫功能.免疫活性细胞的转输 却可以转移抗肿瘤免疫性.同时对宿主的免疫 功能的完整性要求不高因此,细胞过继转输 从理论上讲应是一条理想的免疫治疗途径.从 患者体内获得TIL,经培养.解除抑制,获得活 性,反复传代.大量扩增后才能满足过继免疫 治疗的需要.肿瘤对TIL的免疫抑制解除远 比PBL困难.TIL免疫激活的主要方法是:体 外免疫细胞与刺激剂共同孵育.反复刺激. TIL在刺激剂的作用下仍然要经历一个短暂 江西医学检验1996年第l{卷幕3期 的迟滞期(4—40天不等),然后才开始扩增. 均可达到大于10的数量级.而其杀伤活性亦 随增殖率的提高而提高.目前研究的TIL的 刺激剂包括血凝索类,细胞因子包括白细胞介 索系统,同基因混合淋巴细胞,肿瘤细胞或上 清等.其中以IL一2最为重要.它可以解除 TIL的受抑制状态.赋予其活性.诱导杀伤细 胞的增殖,井促使免疫细胞产生活性因子,如 淋巴毒索(LT)和白细胞介素(IL)类等,协同 介导致敏细胞的LAK活性 五,TIL杀伤肿瘤细胞的机理 原位分析见炎性细胞多聚积在肿瘤实体 周围或问质中,呈套状围绕癌巢.而在肿瘤实 质中分布较步.说明TIL聚集是具有一定免 疫学意义的浸润,而不是简单的从血流中渗 出. TIL效应细胞对肿瘤细胞杀伤具有肿瘤 性质的特异性和自体特异性.目前认为细胞毒 效应机制分前后两阶段.首先是效应靶细胞对 通过它们各自的细胞表面分子进行特异识别 结合,这些表面分子有:细胞粘附分子(Cellu— Iaradhesinmolecu/es).分布在效应靶细胞 上}FrancoP等发现蛋白聚糖类物质CD.(透 明质酸盐受体)同时表达在效应靶细胞上.通 过透明质酸盐桥接可形成效应靶细胞闻的粘 附结合;此外TIL细胞表面受体可与肿瘤细 胞表达的MHC—I型肿瘤相关抗原(TAA)结 合.其后非特异地导致效应细胞膜信号改变, 激活产生后效应—一释放细胞毒效应物质. Perforin.BILCN—a—benzyIOxycafbOnyl—l — lysinethiobenzylester)醣酶.丝氨酸蛋白酶 等.从而杀伤靶细胞.TIL分泌的细胞因子IL 一 2.IFN—a.TFN—v,TNF一口等在TIL杀伤靶 细胞时也起着直接杀伤或免疫调节作用. 六,TIL细胞的临床应用 目前肿瘤的治疗大多采用手术.放疗,化 疗等方法.作为第二代的抗肿瘤杀伤细胞一 TIL.国内外都有应用于临床的报道.从而进 江西医学检验1996年第1d善第3期 , 步为生物治疗肿瘤开辟了新途径.1989年 美国的Rosenberg首次采用自体分离,活化 TIL回输体内.联合应用IL?2治疗晚期黑色 素瘤,使半数患者的肿瘤消失.1990年 Yaman用TIL联合应用IL?2治疗.使一例 晚期胃癌部分缓解.I例胰腺癌完全缓解.刘 思波从b例晚期肿瘤患者癌性胸腹水中分离 出TIL,经体外IL-2刺激培养2—3周后.将 扩增后的TIL充分洗涤.混悬在含l人血白 蛋白WS中,给患者胸腔或腹腔内回注.无一 铡出现副作用.有效地控制了胸腹水,减轻了 症状. 七,TIL——运载目的基因理想细胞 TIL是抗肿瘤基因治疗研究中运载目的 基因的理想细胞.用逆转录病毒介导淋巴因子 基因转移.可使细胞因子在体内得到表达逆 转录病毒具有广泛的感染宿主细胞(如TIL 细胞)?但在肿瘤转基因治疗中.首先要求进入 体内作为运载目的基因的细胞要有足够的数 量,因为抗肿瘤免疫反应要取得根除肿瘤的效 果必须有大量免疫活性细胞参与.另外逆转录 病毒DNA整合作用只能在分裂旺盛的细胞 中产生.因此,理想的运载细胞应当能在体外 ?5? 大量繁殖?回输体内能存活较长时间.且能聚 集在肿瘤发生部位t对机体无害.而从肿瘤组 织中分离的TIL体外培养在IL一2刺激下能 大量扩增.最多可达10"倍,存活时间可超过 100天?回辅体内后能通过某些机制聚集在肿 瘤发生部位.发挥较强的杀瘤效应,因而成为 较理想的基因运载细胞.目前Neor基因(新 霉素抗性基因)因巳在TIL中得到表达,并证 明带有Neor基因的部分TIL在患者体内可 聚集于肿瘤部位长达三周至两个月.而人体接 受这种带有外源插入基因的TIL后无任何副 反应 1990年10月.美国(NCD应用逆转录病 毒介导人TNF—a基因转移TIL治疗50倒晚 期恶性黑色索瘤患者.使逆转录病毒介导的淋 巴因子基因转移的抗肿瘤基因治疗首次应用 到人体.整个治疗计划.正在进行之中. 以外源基因转导TIL进行抗肿瘤基因治 疗.一方面利用TIL的肿瘤病灶趋向性.以达 到肿瘤导向治疗目的;另一方面,一些外源基 因的表达还可大大提高TIL杀伤肿瘤的细胞 活性.因此可望外源基因转导的TIL细胞成 为第三代抗肿瘤的LAK细胞. 孕妇外周血胎儿细胞PCR扩增技术在产前基因诊断的应用 江西省萍当市医院邓日謇(337055) DNA体外扩增技术是近年来创立和发展 起来的高效DNA技术.它通过聚合酶链反应 PoiymeraseChainReaction?PCR)?能够快速 特异地扩增任何所希望的基因或DNA片段, 因此它广泛应用于基因分离,克隆,DNA序列 分析.DNA突变和重组,基因的表达和多态分 析.技誉为基因工程技术上的一个新的里程 碑.目前此项技术已应用于遗传病的产前诊 断.其特点是DNA用量少(只需一个细胞,一 根绒毛.一滴血).而且还可以通过干纸血片送 到有条件的实验室检测. 1969年Waiknowska在研究孕妇外周淋 巴细胞核型时发现46.xy细胞,通过进一步 研究,认为这些46.xy细胞是男性胎儿细胞 经过胎盘转移到母体循环中.孕妇外周血胎儿 细胞的性质至今尚无定性.Kulozik应用免疫 荧光直接染色法观察胎儿细胞是淋巴细胞. covone等采用免疫荧光技术及流式细胞技 术,检测到滋养叶细胞.1985年Millar等通过 形态学观察和应用红细胞表面特异性抗原的 单克隆抗体作为标记.结合流式细胞技术,检 测到胎儿有核红细胞.根据以上所述+通过胎