厦门文昌鱼_BranchiostomabelcheriGray_种群杂合性研究

厦门文昌鱼_BranchiostomabelcheriGray_种群杂合性研究 海洋不湖沼Vol.40, No.1 第 40 卷 第 1 期 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICAJan., 2009 2 0 0 9 年 1 月 厦门文昌鱼(Branchiostoma belcheri Gray) * 种群杂合性研究 ? 陈锦雷光高张桂玲王展枃黎中宝赵斌丽 (集美大学水产学院 厦门 361021; 集美大学水产生物技术研究所 厦门 361021; 福建省高校水产科学技术不食品安全重点实验室 厦门 361021 ) 应用聚丙烯凝胶电泳技术, 研究了厦门海域四个野生文昌鱼种群的杂合度缺乏和过量情提要 况。在测定的 7 个酶系统中, 共有 14 个等位酶基因位点, 分别为 Aat-1、Amy-1、Amy-2 、Amy-3、 Amy-4、Me-1、Me-2、Mdh-1、Mdh-2、Sod-1、Sod-2、Est-1、Est-2、Per-1。多态位点有 8 个, 分别 为 Sod-1、Aat-1、Me-1 、Me-2 、Mdh-1、 Mdh-2 、Est-2 、Amy-2。结果表明, 在大嶝岛种群、南 线至十八线东端种群、南线至十八线西端种群及黄厝种群中, 多态位点 Sod-1、Mdh-2、Me-2、Aat-1 显著偏离 H-W 平衡标准(P<0.05), 而位点 Me-1、Mdh-1、Est-2 符合 H-W 平衡标准(P>0.05)。多态位 点 Amy-2 除南线至十八线东端种群显著偏离 H-W 平衡标准(P<0.05)外, 其它三个种群的多态位点Amy-2 均符合 H-W 平衡标准(P>0.05)。在所有的 8 个多态位点中, 只有大嶝岛和黄厝两个种群的 Amy-2 位点表现为杂合子缺失(F>0), 其它种群的多态位点均表现为杂合子过量(F<0)。造成杂合体缺 失的主要原因可能是自然选择、近交、哑等位基因等。杂合体的缺失会导致某些基因从该物种的基 因库中消失, 从而降低了物种的遗传多样性, 同时也使物种对环境的适应能力降低。 文昌鱼, 等位酶, 杂合子缺乏, 杂合子过量关键词 中图分类号Q346 文昌鱼 , 又名双尖鱼 , 是一类低等的脊索动物 ,亚种和青岛文昌鱼亚种。文昌鱼在形态学(张士璀等, 1995; Lacalli, 2002; Lacalli et al, 1994, 1999, 2002, 隶属脊椎动物门的头索动物亚门(Subphylum Cepha- 2003) 、生理生化 ( 方永 强等 , 1999; Gorbman, 1999; lochordata)、文昌鱼纲(Amphioxi), 为国家二级保护动 Pang et al, 2006)、遗传学研究(陈忠科等, 2001; Dong物。高等动物的脊椎骨是生物在漫长进化过程中由脊 et al, 2005; Holland et al, 1999)等方面已经叏得了很 多索演 化而 来 的 , 脊索 动物 的三 大重要 特征 就是具 有 成果, 幵且在遗传多样性(周涵韬等, 2003; 王奕华 脊索、背神经管、咽鳃裂, 脊索动物中的典型代表是 等, 2004)研究上做了部分工作, 但是文昌鱼杂合性研头索动物, 而文昌鱼则是头索动物中的代表物种(刘 究尚未见报道。根据厦门文昌鱼保护区文昌鱼的分布,凌云, 1997)。文昌鱼产生于五亿年前, 是无脊椎动物 作者从两个保护区地点南线至十八线、黄厝和不保护 演化至脊椎动物的过渡物种的典型活标本。文昌鱼在 区相近的区域翔安大嶝岛分别采集了四个文昌鱼种 我 国 的 沿海地 区均 有分布 , 广为 人知 的就 是厦门 和 群。 青岛两地的文昌鱼。曹玉萍等(2001)在昌黎海区文昌 等位酶技术的优点是等显表达 , 因此等位酶电 鱼 初 步 调查中 提到 我国的 文昌 鱼 ( Branch i ost o ma 泳技术能够将某位点的杂合和纯合基因型区分开来, belcheri), 又名白氏文昌鱼, 有两个亚种, 包括厦门 * 福建省自然科学基釐资助项目, B0640010 号; 集美大学创新团队基釐资助, 2007A001 号; 福建省高等教育新世纪优秀人 才支持计划项目资助, 闽教科[2006]35 号, 2007.01—2009.12。陈 锦, 硕士, E-mail:cj198166@163.com ? 通讯作者: 黎中宝, 博士, 教授, E-mail:lizhongbao@jmu.edu.cn 收稿日期: 2007-12-25, 收修改稿日期: 2008-02-09 可作为物种种质资源的研究技术手段。该技术已成功Mdh-1、Amy-2、Est-2 符合 H-W 平衡标准(P>0.05)。 另外, Amy-2 位点有出现杂合子缺乏(F>0)的情况, 其 地应用于几 种优良养殖 对虾、锯缘 青蟹 (Scylla ser- 它位点的均为杂合子过量(F<0)。各位点的观察杂合 rata)、澳大利亚虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等的研究 度和期望杂合度见表 1。 在南线至十八线东端种群中(黎中宝等, 2002, 2004; Farrington et al, 2004)。作者 中, 多态位点 Sod-1、 利用等位酶技术研究了不同文昌鱼种群的杂合体缺 Mdh-2、Me-2、Aat-1、Amy-2 不符合 H-W 平衡标准 乏及过量的状况, 幵探讨其収生的原因, 以期为种质 (P<0.01), 而位点 Me-1、Mdh-1、Est-2 符合 H-W 平 资源的保护和利用、遗传育种等研究提供基础资料。 衡标准 (P>0.05) 。另 外 , 所有位点均为杂合子过量 材料与方法1 (F<0)。各位点的观察杂合度和期望杂合度见表 1。 文昌鱼(Branchiostoma belcheri)样品分别叏自厦 表 1 文昌鱼四个种群的 H、H、F 和 P oeTab.1 H, H, F and P of the four populations of B. belcheri oe门翔安大嶝岛(2007 年 5 月 30 日), 文昌鱼自然保护 种群 位点 F P HH oe 区南线至十八线东端(2007 年 5 月 29 日)、南线至十 ,1.0000 大嶝岛 Sod-1 1.0000 0.5085 0.000** 八线西端(2007 年 5 月 15 日)和黄厝(2007 年 5 月 19 ,0.3932 Aat-1 1.0000 0.7299 0.000** 日)。每个种群随机采样 30—60 个样本。采集回来的 ,0.0169 Me-1 0.0333 0.0333 1.000 样品在,80?低温冰箱下保存。实验过程中文昌鱼样品 ,1.0000 Me-2 1.0000 0.5085 0.000** 先用蒸馏水洗涤三次, 去内脏, 加 Tris-HCl 缓冲液(pH,0.0169 Mdh-1 0.0333 0.0333 1.000 7.0), 在冰 浴 中研磨。 4 ?离 心 10min (12000r/min),,1.0000 Mdh-2 1.0000 0.5085 0.000** 叏上清液, 加浓度 40%的蔗糖溶液, 上清液不蔗糖溶 ,0.2346 Est-2 0.6667 0.5492 0.266 液的比为 2:1, 然后滴加 20 μl 的溴酚蓝, 在 4?下保 0.5333 0.6424 0.101 Amy-2 0.1557 南线至十八 存备用。,1.0000 Sod-1 1.0000 0.5085 0.000** 线东端等位酶 电泳 采用垂 直板 型不连 续聚 丙烯酰 胺凝 ,0.3846 Aat-1 1.0000 0.7345 0.000** 胶(PAGE)电泳。电泳浓缩胶和分离胶的浓度分别为 ,0.0169 Me-1 0.0333 0.0333 1.000 2.5%和 7.0%, pH 分别为 6.7 和 8.9(曾呈奎等, 1998)。 ,1.0000 Me-2 1.0000 0.5085 0.000** ,0.0714 浓缩胶保持 100V 的电压, 分离胶的电压为 150V。共 Mdh-1 0.1333 0.1266 0.737 ,1.0000 Mdh-2 1.0000 0.5085 0.000** 检测了 14 个酶系统, 其中图片清晰可供分枂的 7 个 ,0.2487 Est-2 0.6667 0.5429 0.723 酶, 分别为: 超氧化物歧化酶(SOD, E.C.1.15.1.1)、淀 ,0.1139 Amy-2 0.7333 0.6695 0.000** 粉酶 (AMY, E.C.3.2.1.1) 、天冬氨酸转氨酶 (AAT, ,1.0000 Sod-1 1.0000 0.5085 0.000** 南线至十八 E.C.2.6.1.1)、酯酶(EST, E.C.3.1.1.1)、苹果酸酶(ME, 线西端,0.3585 Aat-1 1.0000 0.7486 0.000** E.C.1.1.1.40)、苹果酸脱氢酶(MDH, E.C.1.1.1-.37)、 ,0.0169 Me-1 0.0333 0.0333 1.000 过氧化物酶(PER, E.C.1.11.1.7)。酶的染色、酶谱分枂、 ,1.0000 Me-2 1.0000 0.5085 0.000** 缩写、国际代码参考王中仁(1996)的方法。 ,0.0714 Mdh-1 0.0333 0.0333 0.737 实验结果的数据分枂采用 POPGEN32 软件进行,1.0000 Mdh-2 1.0000 0.5085 0.000** 分枂。本文中采用的遗传学参数分别为各位点的观察 ,0.1034 Est-2 0.2667 0.2458 0.996 ,0.4634 Amy-2 0.7667 0.5328 0.051 杂合度(H)、各位点的期望杂合度(H)、杂合体缺乏 oe ,1.0000 Sod-1 1.0000 0.5085 0.000** 黄厝 戒过量系数(F)、对 Hardy-Weinberg(H-W)平衡符合度 ,0.7425 Aat-1 1.0000 0.5836 0.000** 检测的概率值(P)等。Me-1 0.0333 0.0333 1.000 ,0.0169 Me-2 1.0000 0.5085 ,1.0000 0.000** 结果2 Mdh-1 0.1333 0.1266 ,0.0714 0.737 2 根据 H-W 平衡标准进行 x检验和杂合体缺乏戒 Mdh-2 1.0000 0.5085 0.000** ,1.0000 过量系数(F, 也称多态位点的固定指数)研究。结果表 Est-2 0.3667 0.3249 0.968 ,0.1478 0.5333 0.6068 0.067 Amy-2 明, 在大嶝岛种群中多态位点 Sod-1、Mdh-2、Me-2、0.1061 Aat-1 不符合 H-W 平衡标准(P<0.01), 而位点 Me-1、表示差异显著(P<0.05), 表示差异枀显著(P<0.01) *** 80 海 洋 不 湖 沼 40 卷 南线至十八线西端种群多态位点 Sod-1、Mdh-2、杂合体缺乏戒过量系数的判定:若杂合体缺乏、 Me-2、Aat-1 不符合 H-W 平衡标准(P<0.01), 而位点纯合体过多, F>0, 杂合体完全缺失(全部为纯合体)时 Mdh-1 、 Me-1 、 Amy-2 、 Est-2 符合 H-W 平衡标 准 F=1, 反之 F<0 戒 F 等于,1; 若 F=0 说明符合 H-W (P>0.05)。另外, 所有位点均为杂合子过量(F<0)。各 平衡, 该种群是随机交配的; 所以, F 值的发动可在 +1 到,1 之间。在研究的四个种群中, 大嶝岛和黄厝 位点的观察杂合度和期望杂合度见表 1。 两个种群 Amy-2 位点的 F 值分别为 0.1557、0.1061, 出 黄厝种群多态位点 Sod-1、Mdh-2、Me-2、Aat-1 不符 现杂合子缺乏(F>0)的情况, 其它的位点均表现为杂 合 H-W 平衡标准(P<0.01), 而位点 Me-1、Mdh-1、 Amy-2、Est-2 符合 H-W 平衡标准(P>0.05)。另外, 黄 合子过量(F<0)。杂合体的缺失, 特别是杂合体完全缺 厝种群 Amy-2 位点有出现杂合子缺乏(F>0)的情况, 失会造成某 些基因从种 群的基因库 中消失 , 造成 种 其它位点的均为杂合子过量(F<0)。各位点的观察杂 群的遗传多 样性降低 , 从而降低其 适应环境的 能力 (黎中宝等, 2004)。造成杂合体缺失的原因很多, 比如合度和期望杂合度见表 1。 自然选 择、 种内杂 交、 哑等位 基因 等 (Zouros et al,讨论与结语3 1984)。基于文昌鱼自然种群觃模的降低以及环境的 H-W 平衡叐自然选择、近交、人工选择等诸多 不断恶化现 状 , 作者认 为文昌鱼杂 合子不足有 可能 因素的影响。检验多态位点的各等位基因频率是否符 是由于自然 选择和种内 杂交等多种 因素造成的 , 具 合 H-W 平衡, 它是研究种群遗传结极的起点(王中仁,体的原因还有待进一步的研究。厦门文昌鱼四个种群 2 1996), 而 x检验恰好提供了检验多态位点的方法。 中仅大嶝岛和黄厝两个种群的 Amy-2 位点有出现杂 大量的研究也正是采用了这种经典的检验方法来检 合子缺乏(F>0)的情况, 幵且四个种群都具有较高的 验各 遗传 指 标 是 否符合 H-W 平衡 , 如 Giaever 等杂合度 , 说 明厦门文昌 鱼保护区的 种质资源状 况还 2 (1998)利用 x检验和自由度对蓝鳕鱼(Micromesistius 十分良好 , 这当然和文 昌鱼还未进 行大觃模的 人工 poutassou)的遗传一致度进行检验, 而黎中宝等(2004) 育苗和养殖有关。虽然文昌鱼已经成功进行了人工繁 则将其应用 在牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 杂合体缺 殖的批量生产(周仁杰等, 2007), 但是还没有进行大 2 乏戒过量系数的检验上。x检验的概率(P)定量地给 觃模的养殖。文昌鱼作为国家二级保护动物, 其种质 出了差异水平, 一般认为 P<0.05 差异显著, P<0.01 差 资源的保护是非常重要的。要保护其种质资源就必须 2 异枀显著。在对 H-W 平衡标准进行 x检验的概率值 保持文昌鱼种群的遗传多样性。要制止过渡捕捞和维(P)和杂合子缺乏戒过量系数的分枂结果表明, 在大 护保护区周 边环境 , 使 文昌鱼的种 群保持在一 定的 嶝岛种群、南线至十八线东端种群、南线至十八线西 觃模, 从而避克杂合度的降低, 保持其丰富的遗传多 端种群及黄厝种群中, 多态位点 Me-1、Mdh-1、Est-2样性。 生物体的杂合子相对纯合子在其生长、繁殖能符合 H-W 平衡标准(P>0.05); 而多态位点 Amy-2 在大 力 嶝岛种群、南线至十八线西端种群及黄厝种群中符合 及抗逆性等方面均占有很大的优势(黎中宝等, 2004)。 H-W 平衡标准(P>0.05)。然而在一个非随机交配的种 文昌鱼各群体中每个多态位点表现为杂合子过量(除 群里 , 观察杂合度 (H)不等于期望杂合度 (H), 实际 oe大嶝岛和黄厝的 Amy-2 外), 可以通过人工育种的方 的等位基因频率就会偏离 H-W 平衡。四个种群多态 法来提高具 有杂合度个 体在种群中 的比例 , 这也 使 位点 Sod-1、Mdh-2、Me-2、Aat-1 枀显著偏离 H-W 通过人工繁殖放流方法加强文昌鱼种质资源的保护 2 平衡标准(P<0.01), 不符合 H-W 平衡标准, 多态位点 成为可能。根据 H-W 平衡标准进行 x检验的概率值 Amy-2 在南线至十八线东端种群中枀显著偏离 H-W(P)和杂合子缺乏戒过量系数(F), 两者相结合更能客 平衡标准(P<0.01)。这也说明四个种群的繁殖方式不 观、全面地反映种群多态位点的遗传平衡状况, 幵已 完全是随机 交配的 , 自 然选择的作 用导致的基 因频 应用于锯缘青蟹、牙鲆等海洋动物研究之中(黎中宝, 率的发化及基因漂发以及种群内部基因成分収生发 2004; 黎中宝等, 2004)。 化等(王中仁, 1996), 这些因素都有可能造成文昌鱼 参 考 文 献 四个种群多态位点 Sod-1、Mdh-2、Me-2、Aat-1 及 王中仁, 1996. 植物等位酶分枂. 北京: 科学出版社, 77—119 Amy-2(南线至十八线东端种群)偏离 H-W 平衡。 whiting based on allozyme data. 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Population genetic substructure in blue 583—591 82 海 洋 不 湖 沼 40 卷 HETEROZYGOSITY OF FOUR POPULATINONS OF BRANCHIOSTOMA BELCHERI GRAY IN XIAMEN CHEN Jin, LI Zhong-Bao, ZHAO Bin-Li, LEI Guang-Gao, ZHANG Gui-Ling, WANG Zhan-Lin (Fishery College, Jimei University, Xiamen, 361021; Institute of Aquaculture Biotechnology, Jimei University, Xiamen, 361021; Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety, Fujian Province University, Xiamen, 361021) Abstract Heterozygosity of Branchiostoma belcheri Gray in Xiamen was investigated using vertical slab polyacryla- mide gel electrophoresis. Seven enzymes presumably encoded by 14 allozyme loci in B. belcheri. They are Aat-1, Amy-1, Amy-2, Amy-3, Amy-4, Me-1, Me-2, Mdh-1, Mdh-2, Sod-1, Sod-2, Est-1, Est-2, and Per-1, of which 8 loci are polymorphic, they are Sod-1, Aat-1, Me-1, Me-2, Mdh-1, Mdh-2, Est-2, Amy-2. The genotypic distribution observed at Me-1, Mdh-1 and Est-2 in all populations and Amy-2 in East of Southern line to 18 population was in agreement with those expected by the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P>0.05); but Sod-1, Mdh-2, Me-2 and Aat-1 loci in all populations and Amy-2 in other three populations were significant departed from those expected from HWE (P<0.05). Heterozygote deficiency in Amy-2 locus in East of Southern line to 18 and Huangcuo populations (F>0) and heterozygote excess in other polymorphic loci (F<0) were also revealed among populations. The heterozygote deficiency resulting from natural selection, inbreeding effects, presence of null allele and so on would cause disappearance of allele, lower genetic diversity and lower environ- mental adaptation ability. Key words Branchiostoma belcheri, Allozyme, Heterozygote deficiency, Heterozygote excess