【doc】无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆抗体分泌

【doc】无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆抗体分泌 无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆 抗体分泌 免疫学杂志第l8卷第5期2002年9月IMMUNOLOGICAIJOURNALVoll8No5pt.2002.389. [文章编号]1000—8861(2002)05—0389—05 无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆抗体分泌 马刚,余兴龙,李作生,张茂林,涂长春 (解放军军需大学军事兽医研究所病毒研究室,吉林长春130062) [摘要]目的建立应用无蛋白培养基大量制备单克隆抗体(McAb)的生产方法.方法本实验以3株猪瘟病毒特异 单抗杂交瘤细胞为研究对象,通过与常规的有血清培养法比较,研究了无蛋白培养基中杂交瘤细胞的生长特性,抗体分泌效 率,活性与纯度.结果无蛋白培养基中单抗的产量与效价比有血清培养的单抗高2,4倍,而且单抗的纯度显着提高.结 论无蛋白培养肇可完全取代常规的有血清培养基,用于生产高滴度,高纯度单克隆抗体. [关键词]无蛋白培养基;杂交瘤细胞;单克隆抗体 [中图分类号]R392.11[文献标识码]A Hybridomagrowthandantibodyproductioninprotein—freemedium MAGang,YUXing—long,LIZuo—sheng,ZHANGMao—lin,TUChang—ehun (DepartmentofVirology,MilitaryVeterinaryInstitute,QuarternutsterUniversityofPIA,Ch angchun130062,China) lAbstract]ObjectiveToestablishamethodforproductionofmonoclonalantibodies(McAb) bygrowinghybridomacellsinprotein— freemedium.MethodsThreehybridomassecretingMeAbsdirectedspecificallyagainstE2i mmunogenieproteinofclassicalswinefevervirus werestudiedfortheirgrowth,antibodysecretionandpurityinprotein— fi'eechemicallydefinedmediumofGIBCO/BRL(CDmedium)through compmisonwithroutineserunl—containingmedium(RPMI+15%NCS).ResultsFheresultsshowedthattheyield,titerandpu rityofthose McAbswere2—4timeshigherthanthoseproduceditlsertml—containingmediumConclusionsCDmediumisabletoreplacesertlm—con'taining mediumandverysuitableforproductionofhighqu.,dityMcAb. [Keywords]CDprotein—freemedium;hybridoma;McAb 目前体外细胞培养技术用于大规模生产单抗已 经受到广泛重视.传统的体外细胞培养是用商业化 的培养基加入一定浓度的新生小牛或胎牛血清,但 由于动物血清成分复杂,对目标产品的生产和纯化 造成极大的困难.随后,研究应用了无血清的细胞 培养基,不过此类培养基必需佐以一些促进细胞生 长的蛋白质成分,如胰岛素,转铁蛋白,白蛋白和/或 一 些蛋白水解成分等J,这些无关蛋白的存在依然 为目标产品的纯化带来了困难.于是,一种限定化 学成分的无蛋白培养基(chemicallydefinedinedium, CD培养基)问世并逐渐试用于细胞培养,且取得了 较好的结果.因为无蛋白培养基不含任何蛋白成 分,便于培养条件的标准化及培养液中目标产品的 分离纯化,而且在价格成本上比无血清或有血清培 养基更经济J,近年米已开始用于杂交瘤细胞的培 养和单抗生产.此外,无蛋白培养还适应于其 它种类细胞的培养,如卵母细胞J,淋巴细胞和传 代细胞如BHK一21等,展现出用于各种细胞培养的 光明前景.本实验探讨了应用限定化学成分的无蛋 白培养基培养杂交瘤细胞和生产单抗的可行性,并 对培养过程中细胞生长状态,单抗的产率,活性和纯 净度的变化进行了研究.获得的数据充分表明杂交 瘤细胞在无蛋白培养基中的生长状态和抗体分泌能 力明显优于有血清培养基.本研究为应用CD培养 基生产单抗打下了坚实的技术基础. 1材料与方法 1.1杂交瘤细胞株应用以前融合制备的3株分 泌抗猪瘟病毒(classicalswinefevervicus,CSFV)McAb 杂交瘤细胞A11,B2和E3为研究对象J,其中单抗 B2为1只G,A11和E3为IgM. 1.2培养基培养杂交瘤细胞所用的培养基是限 [收稿日期]2002—03—18;[修回日期]2002—06-03 [基金项目]国家自然科学基金重大项目(39893290一1)和"973"项目(G19990119—03)资助 [作者简介]马刚(1977一),男,安徽安庆市人,硕士生,主要从事肿瘤免疫的研究Tel:(o431)7960009: E-mail:ehangchun—tu@hotmail.eom *通信作者 ? 390?第l8卷免疫学杂志2002年9月 定化学成分的无蛋白培养基(chemicallydefinedhybri- domamedium,CD培养基)和RPMI1640培养基均为 Gibco/BRL公司产品;新生小牛血清(NewbornCalfSe. nlin,NCS)为Hyclone公司产品. 1.3杂交瘤细胞培养与单抗效价测定复苏上述 3株杂交瘤细胞,用15%NCS的RPMI1640培养至长 满单层,每株细胞生长旺盛时传代,按每毫升2.0× 105个细胞分至10个100InL培养瓶,37?培养 24h,待细胞完全贴壁后,将其中5瓶细胞先用无血 清RPMI1640培养基洗涤3遍,再用CD培养基洗涤 2遍,以除去残留的小牛血清,最后换以CD培养基, 并添加至终浓度为8mmol/L的谷氨酰胺和1%双 抗.另外5瓶细胞换以新鲜的15%NCSRPMI1640 培养基.换液24h后(记为第1天),2种培养基各 取一瓶细胞,收集单抗上清液,同时经台盼蓝染色进 行活细胞记数.然后依次于第2—5天重复上述操 作,分别收集单抗上清和进行活细胞记数.最后以 间接ELISA检测各份上清中的抗体效价_1... 1.4单抗纯化与产率分析由于3株杂交瘤中 只有B2细胞分泌IgG单抗,为了便于纯化,我们取 B2单抗进行纯化与产率分析.根据1.3中测得的 B2单抗效价的变化规律,分别取2种培养基最高效 价的培养上清液,用蛋白A琼脂糖凝胶(Amersham PharmaciaBiotech)进行纯化,Bradford法测蛋白浓 度.同时测定纯化前培养液中总蛋白浓度,最后比 较在2种培养条件下单克隆抗体的产率. 1.5电泳鉴定培养上清液中抗体蛋白纯度取CD 一 20 l5 一 兰10 警 喜5 童 0 12 0,8 呈0,6 — 0.4 O.2 0 .r1...rLl2345 t/d 2O l0 O 培养基培养的B2细胞,SP2/0细胞上清和有血清培养 的B2细胞上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,并与纯化 的B2单抗比较,观察2种培养体系中单抗的纯度. 1.6杂交瘤细胞在CD培养基中的连续培养细胞 的第1次传代和培养基的更换按1.3操作,当细胞 生长达到旺盛状态时,完全用CD培养基对杂交瘤 细胞进行传代培养,传代时收集每一代培养上清液, 用间接ELISA法测定抗体效价_l,观察杂交瘤细胞 在CD培养基中的适应性和稳定分泌抗体的能力. 2结果 2.1CD培养中杂交瘤细胞的生长与单抗分 泌3株杂交瘤的活细胞记数结果及培养上清抗体 效价变化分别见图1和图2.从图1可见3株杂交 瘤细胞在2种培养基中活细胞数变化趋势基本相 同,都是在第3天达到最高峰,但有血清培养时,杂 交瘤细胞分裂增殖较快,因生长旺盛,细胞的老化与 死亡也就随之加快;而在CD培养中杂交瘤细胞的 分裂增殖较慢,细胞生长时间延长,老化和死亡明显 滞后,说明CD培养基更有利于杂交瘤细胞的生长 与维持.从图2可见,3株杂交瘤细胞在5d中的抗 体效价变化趋势也基本相同,前3天缓慢上升,第 4天达到高峰,第5天抗体滴度开始下降.A11细胞 在CD培养基中的抗体效价略有增加,而B2,E3细 胞在CD培养中的抗体效价大大高于有血清培养的 效价,同一时期收集的细胞上清液,CD培养基中抗 体效价约是有血清培养的2,4倍. l2345 t/d E3口CD ? r厂.l2345 ,/【| 图l3株杂交瘤细胞在2种培养基中的活细胞数变化 FiglCellcountsof3hybridomacelllinesinCDand15%NCSRPMI1640media A11B2E3 l2345l2345 t/dt/d 1 音 呈0.5 量- O l2345 t/d 图23株杂交瘤细胞在CD和有血清培养基中的体效价 Fig2McAbfitersinsupematantsof3hybridomasgrowinginCDand15%NCSRPMI1640m edia 第5期马刚,等.无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆抗体分泌.391? 2.2CD培养中单克隆抗体的产率根据上述结 果,取分泌10=单抗的B2细胞第4天的cD和有血 清培养上清液各10mL,5000r/rain离心5min,各取 100测总蛋白含量,其余均用蛋白A柱进行纯化, 在洗脱柱上吸附的IsG时,共洗脱3次,可最大量 (>95%)回收纯化IsG_9j.最终从10mL起始培养 液中获得1.5mL纯化单克隆抗体,纯化单克隆抗体 蛋白含量见表1.结果表明,CD和有血清培养液纯 化产物中B2单克隆抗体IsG含量分别为85mL 和21tc~mL,由此推算纯化前CD培养液中IsG浓度 为13.8mL,占培养液中总蛋白的10.8%,而有血 清培养液中IsG浓度只有3.15t~g/mL,仅占培养液中 总蛋白的0.042%,可见在无蛋白培养中,单克隆抗 体的含量和纯度明显高于有血清培养. 表1B2杂交瘤细胞在2种培养基中抗体分泌浓度的比 较(tcgmL) Tab1ComparisonofMcAbB2concentrationsintwolllG~a (tc/mL) 啪 兰兰鲫IgGCD8513.8l1810.8 15%NCSRPMI164o213.1575000.042 注:IsG百分率指培养上清液中IsG的含量占总蛋白的百分率 Note:IgCl:)ereenlagen坦nstheproportionofJgCintotalproteinofn王l— turesupematant. 2.3SDS-PAGE电泳鉴定培养上清液中抗体蛋白的 纯度为了鉴定CD培养基中单抗分泌的纯净度,本 实验进行了SDS—PAGE分析.由图3可以看出,与蛋 白分子质量标准物相比,纯化B2单克隆抗体出 现的2条带是IgG的轻,重2链(泳道1,轻链为 251300u左右,重链为521300U左右),起始CD培养基 未见蛋白带(泳道5),CD培养液中B2杂交瘤分泌的 单克隆抗体IsG轻,重链条带清晰可见,杂蛋白带较 少(泳道2),与泳道3的SP2/0细胞的CD培养物电泳 图对比发现,B2杂交瘤细胞中的杂蛋白带是杂交瘤 细胞正常生长时产生的.而有血清培养的B2细胞上 清中存在大量杂蛋白,尤其以白蛋白居多,杂蛋白条 带完全掩盖了单克隆抗体IsG条带.电泳分析表明 CD培养液中特异性抗体有较高纯度. 2.4杂交瘤细胞在CD培养基中的连续传代培养试 验为了观察CD培养基是否完全支持杂交瘤细胞 的生长,传代并保持单抗分泌的稳定性,本实验研究 了B2杂交瘤细胞在CD培养基中的生长性能.结 果表明,当有血清培养基一次性完全被CD培养基 替换后,细胞的生长并未受到影响,但用CD培养基 进行细胞传代时,观察到原培养瓶中细胞能够贴壁 长成单层,约3,4d后,细胞生长最为旺盛,而新瓶 1McAbB2purifiedfromCDculture;2B2supematantin CD(6o);3SP2/OsupernatantinCD(60);4B2 supematantin15%NCSRPMII640(20"L);5CDmedium (50"L);MProteinmolecularweightstandard(middlerange) 图32种细胞培养上清液中B2单抗的SDSPAGE 分析结果 Fig3SDS-PAGEanalysisofMcAbB2producedres— pectivelyintwoculturemedia 中的细胞不能贴壁生长,细胞悬浮并在2d后死亡, 多次传代过程中均出现这一现象.但是在有血清培 养条件下,B2细胞传代后,原瓶和新瓶中细胞均能 旺盛生长和增殖.抗体效价测定表明,在CD培养 基中连续传代培养并不影响B2单克隆抗体的稳定 分泌.本实验中,B2细胞在CD培养条件下连续传 了4代,间接ELISA测定的抗体效价,OD值均维持 在1.0左右. 3讨论 为了探讨应用无蛋白培养基制备较纯净的高活 性单抗试剂,本研究观察了3株杂交瘤细胞在CD培 养基中的生长状态和稳定性,检测了单克隆抗体的 产量和纯净度.从实验结果可以看出,3株杂交瘤 细胞均能在CD无蛋白培养中良好生长,细胞的生 长周期不仅明显延长,而且最重要的是单克隆抗体 的效价在3株细胞都得到了提高,其中B2和E3单 抗效价提高2,4倍.从图1和图2可以看出杂交瘤 细胞的生长与单克隆抗体分泌的关系.A11杂交瘤 细胞无论在有血清培养还是CD培养中,前3d的细 胞数几乎成倍增长,但其抗体效价的增长幅度较小, 仅10%左右.在相同培养条件下,B2单克隆抗体效 价的增长幅度与B2细胞数的增加幅度比较一致. 而对于E3细胞,在CD培养中单克隆抗体效价的显 着提高与其细胞数量显着增加基本一致,但在有血 清培养中,细胞数量的显着增加并未导致抗体效价 的明显升高.可见就抗体效价与杂交瘤细胞数量的 关系而言,不同杂交瘤细胞有不同的特点,虽然单克 隆抗体效价随着细胞的分裂增殖,即细胞数增加而 ?392?第18卷免疫学杂志2002年9月 提高,但是这种单克隆抗体效价提高与细胞数增加 似乎不是简单的倍比关系.因此,对不同的杂交瘤 细胞株,有必要摸清其抗体效价与细胞数量在特定 培养条件和特定时间下的关系.这一点对如何高效 生产单克隆抗体具有指导意义.此外,从图1和图2 还可看出,3株杂交瘤细胞无论在CD中还是在有血 清培养中,其细胞数均于第3天达到高峰,而2种培 养系统中的抗体效价均滞后1d,即第4天达到高 峰.细胞从第4天开始迅速老化和死亡,单克隆抗 体效价却从第5天开始下降.这可能反映出杂交瘤 细胞体外培养特征的一个共性.从图2还可看出, 单克隆抗体效价达到最高峰后迅速下降,其下降速 度明显快于升高的速度,说明细胞死亡后的裂解产 物,特别是细胞破碎后释放的蛋白酶可能对抗体蛋 白具有降解作用. 除了促进细胞生长和单克隆抗体分泌以外,无 蛋白培养的最大优势在于单克隆抗体产物的纯净度 明显高于有血清培养物中单克隆抗体的纯净度.通 过2种培养系统生产单克隆抗体的电泳比较可以看 出(见图3),CD培养中单克隆抗体条带清晰可见, 杂蛋白种类很少,含量也较低.而有血清培养生产 的单克隆抗体条带已被血清中的大量杂蛋白,特别 是白蛋白和球蛋白完全掩盖.电泳结果还表明,骨 髓瘤SP2/0细胞并不分泌产生分子质量与抗体蛋白 近似的杂蛋白(泳道3).所以CD培养中单克隆抗 体的纯化和含量测定比较准确和容易,而有血清培 养的单克隆抗体,其纯化和含量测定均难以消除血 清固有的非特异性IgG的干扰.通过纯化来测定单 克隆抗体含量的结果表明(见表1),CD培养中B2 单克隆抗体的浓度为l3.8tag/mL,而有血清培养物 中B2单克隆抗体的浓度只有3.15ug/mL(这一浓度 还应包括小牛血清IgG的影响),两者相差约4倍, 这与抗体效价测定的相差2,4倍的结果一致,说明 效价增加的基础是单克隆抗体浓度增加.就总蛋白 含量来说,在CD和有血清培养中B2单克隆抗体的 分泌量分别占培养物总蛋白的10.8%和0.042%. 所以,无论从细胞生长状态,单克隆抗体分泌量,单 克隆抗体纯度和产物纯化方面,无蛋白CD培养基 明显优于常规的有血清培养基. Gorfien(1999年)应用与本研究相同的CD培养 基对3株杂交瘤细胞进行了培养Il.试验结果表 明,细胞在CD培养基中生长比在有血清培养基中 缓慢,而抗体表达量则是有血清培养的2,5倍.作 者认为,正是因为细胞在CD培养基中分裂繁殖缓 慢,所以细胞将更多的生理活动转移到特异性抗体 表达上来.这一研究结果与本研究基本一致. Argue11es(1999)应用亲硫吸附层析方法纯化无蛋 白培养上清中的单克隆抗体.结果表明,尽管这种 纯化方法对免疫球蛋白没有特异性,但在无蛋白培 养上清中,只需一步纯化,即可使最终特异性抗体蛋 白纯度高达97%以上.本研究利用蛋白A柱层析 法纯化有血清培养上清中的单克隆抗体时,不能排 除小牛血清中非特异性IgG的影响,而CD培养基则 不存在这一问题.无蛋白培养基的开发只有数年时 间,虽然适合于多种细胞的培养,但其本身还在不断 完善之中.有研究表明,在商品cD培养基的基 础上再添加一些成分,如葡萄糖,谷氨酰胺及一些氨 基酸等,可显着改善细胞活力和提高抗体产量.此 外,细胞培养方式的改变,细胞接种密度及微载体的 应用都对细胞的活力和抗体产率产生影响,Voigt (1999)的研究表明,在无蛋白培养基中加入2mL 微载体进行转瓶培养时,抗体分泌动力学曲线处于 最佳,抗体产率是有血清培养的2.5倍.这些研究 表明,每一株杂交瘤细胞在用无蛋白培养基进行单 克隆抗体生产时,必须建立各自的培养条件和参数, 才能得到最理想的单克隆抗体产率. 由于B2分泌IgG型单克隆抗体,本实验以此为 对象,初步研究了用CD培养基生产单抗的基本模 式,证明B2细胞可在CD培养基传代培养,且在传 代过程中单克隆抗体的分泌量比较稳定.但是传代 时只有留在原瓶中的细胞能很好地贴壁生长,而分 人新玻璃瓶中的细胞却不能贴壁生长,表明CD培 养基中缺乏某些细胞粘附因子(如纤粘蛋白,胶原蛋 白等),而血清为细胞贴壁生长提供了促细胞分裂, 细胞粘附和铺展的因子等.我们用CD培养基对细 胞进行传代时,细胞在原培养瓶中可以完全保持良 好的贴壁生长,说明细胞的粘附生长并非血清依赖 性,可能存在着自我粘附生长调节系统.至于新瓶 中细胞不贴壁的现象,可能是由于CD培养基培养 的细胞比较娇嫩,适应性较差的缘故,因为将新瓶中 未贴壁生长的细胞倒掉后,重新加入CD培养基传 代细胞则能够在上面贴壁生长,这提示新瓶已条件 化,即瓶壁上已存在有促进细胞粘附生长的物质. 结合大规模的细胞培养技术,CD培养基是替换 有血清培养基,用于高纯度和高含量单克隆抗体生 产的最佳培养基.Gorfien(1999)在l5L发酵罐中利 用CD培养基成功地大规模培养了单克隆抗体杂交 瘤细胞?,表明这种培养基具有进行大规模细胞培 养的应用潜力.在细胞体外培养技术中,还有微载 (下转第396页) ? 396?第18卷免疫学杂志2002年9月 (上接第392页) 体反应器,中空纤维反应器及气升式反应器等,将这 些技术与无蛋白培养基相结合,必将有效改善杂交 瘤细胞培养和生物活性产物的生产,对此,已有相关 报道_8,J,且都取得了较为理想的结果.因此我们 认为,在实验室研究甚至大规模生产中,通过CD培 养基培养杂交瘤细胞不失为一种理想的单克隆抗体 生产技术. 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