005 淋球菌检验

005 淋球菌检验 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第6页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 1 目的 淋球菌检查。 2 授权操作人 经并通过考核的性病实验室工作人员。 3 标本的采集和运送 3.1 男性病人前尿道取材作培养时，应用拭子深人尿道2cm-4cm，取出分泌物应略带粘膜。 3.2 女性病人的宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器(不要用液体石蜡等润滑油)。应将棉拭子宫颈口1.5cm处，稍转动并停留10秒—30秒，让棉拭充分吸附分泌物。 3.3 从直肠取材时，应将棉拭子插入肛门2.5cm以上，如果棉拭子碰到粪便，应换一个棉拭子重取。 3.4 检查淋菌性咽炎时从扁桃体或扁桃体窝或咽后壁取材。淋球菌对外环境因素如干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养成功，应尽量缩短标本离体时间。 3.5 在取材作涂片时，取材后轻轻涂布于载玻片上。待自然干燥后作染色。 3.6 在取材作培养时，在门诊部，从病人取材后，应立即接种到培养基上进行培养;如取材本处离实验室较远时，可将标本置于无营养性的Stuart或Amies运送培养基或选择性生长培养墓如Trmlsgrow中运送到实验室。标本在无营养运送培养中(在室温25?条件下)，12小时对分离率无影响，在24小时内分离大于90,。如需时再长，应使用生长运送培养基，但即便如此，也不应超过2天。 4 淋病分泌物的涂片检查 4.1 原理 急性淋菌性尿道炎病人常有大量黄色脓性分泌物。在有些脓细胞内可有许多淋球菌。淋球菌革兰染色呈阴性反应，具有特殊的菌体形态。因此，取病人尿道 分泌物制成涂片后作革兰染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作初步 诊断的依据。 4.2 操作步骤 先用灭菌等渗盐水的拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，蘸取脓液后轻轻涂布于载玻片上。待自然干燥后加热固定，染色，镜检。 革兰染色:结晶紫染色1分钟。 碘媒染液染色1分钟。 乙醇丙酮脱色1分钟左右。 石碳酸复红复染1分钟。 晾干后油镜镜检。 4.3 结果 在急性病人的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞。在有些细胞中吞噬有淋球菌。淋球菌为革兰阴性，呈卵圆形或圆形常成对排列，接触面扁平或稍凹。菌体长约0.7um，宽约0.5um。但两菌大小可有差异。多数多形核细胞中并不含淋菌，但不少脓细胞中常含有1至数对， 6 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第7页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 甚至20对—30对淋球菌，淋球菌常存在于细胞浆内。 在病期较长的淋病病人的涂片中淋球菌比较少，有时呈单个、四联和八叠状，且常位于细胞外。对有些菌有时难以下结论，需进行培养和鉴定。 4.4 报告方式。 4.4.1未见到可疑菌时报:“未发现淋球菌”。 4.4.2见到可疑菌时报:“见到革兰氏阴性双球菌(在细胞内/外)” 4.5 注意事项 4.5.1涂片时不要用力涂擦，而应将棉拭子在玻片上轻轻滚动。因急性病人诊断为见到“细胞内革兰阴性双球菌”。涂擦过劲，细胞破裂或变形，菌从细胞内逸出，会造成诊断上的混淆。 4.5.2涂片厚薄要合适，一般以白细胞单个排列为标准。涂片过厚，加之染色过程中脱色时间不足，革兰阴性菌也会呈现紫色。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。在大量染片时，最好用一已知的革兰阳性菌(如葡萄球菌)和阴性菌(如大肠杆菌)作对照。 4.5.3固定涂片，只要将涂片迅速通过火焰二三次，避免加热过度使细胞变形扭曲。当把加热的涂片放到手背上时应不感到太烫。 4.5.4不推荐用涂片检查来诊断淋菌性直肠和咽部的感染，也不推荐用来作判愈。 4.6 临床意义 涂片检查方法简便、有效、价格低廉且有一定的敏感性和特异性。但其特异性随着取材部位的不同而有所不同。例如，从男性尿道取材特异性高，而从女性宫颈取材特异性低，因女性宫颈分泌物中杂菌很多，有的在形态上很像淋球菌。因此，世界卫生组织不推荐用涂片法来检查女性病人。 淋球菌的分离培养 5 5.1原理 如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长成的菌落形态各不相同。根据菌落的大小、表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。 5.2操作步骤 5.2.1培养基 :分离培养基:淋球菌分离使用的商品巧克力或淋球菌专用培养基。 5.2.2接种:将棉拭子涂抹于平皿一端，再用无菌接种环划线再采用分区划线法。 5.2.3培养条件 淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后应立即接种，标本离体时间越短越好。取材处离实验室距离较远时，应将标本接种于Stuart或Amies运送培养基，并注意在运送过程中保温。接种的培养基应先放在37?温箱中预温。 培养最适温度为35?-36?，超过38.5?或低于30?便生长不良。因此，孵育的温度要恒定。 淋球菌为需氧菌，但最初从人体分离时，为促进其生长，需用5-10,二氧化碳环境培养。为保持一定的湿度，可在培养缸中放些浸水棉球。 5.3结果 淋球菌在血平皿上经24小时—48小时的培养后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，直径为0.5mm-1.0mm，用接种环接触之有粘性。涂片革兰染色可见典型的革 7 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第8页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 兰阴性双球菌。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。若从菌落上取材作涂片， ,的菌为典型的双球菌，其他75,为单可见到菌的大小及染色的深度有差异，排列也不一致，约有25 球菌、四联形或八叠形。淋球菌在液体培养基中生长于液体表面，或稍有轻度混浊和颗粒沉淀。 5.4注意事项 5.4.1培养要获得成功，取材是关键之一。取材的深度一定要够，因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。男性尿道前端包括舟状窝都为复层鳞状上皮细胞覆盖，所以要深入到尿道内2cm-4cm处，并蘸取少量粘膜，阳性率才高。女性病人取材时，要求将棉拭插入宫颈管，转动并停留10秒—30秒也是这个道理。有些人只在阴道口取少量分泌物作分离培养，阳性率当然会降低，因为有生活力的菌从宫颈随分泌物由阴道流出需一定时间，阴道内pH值低，又因各种杂菌的作用，到阴道口时淋菌的生活力较低，再加上培养过程中各种因素的影响，培养成功的机会就会减少。 5.4.2对症状不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后二三小时后。另外，采样者应熟练掌握前列腺按摩术，必要时作前列腺按摩取材。 5.4.3对女性淋病的检查主张用淋球菌培养。国内目前使用血液琼脂加入多粘菌素作抑菌剂效果尚可。但蛋白胨最好用进口的，并用肉浸液加酵母浸膏等为好。 5.4.4国内目前使用的血液琼脂或巧克力琼脂中加人多粘菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌。但由于部分淋球菌(某些地区可高 达5,)对万古霉素也敏感，因此，最好不用万古霉素。 5.4.5淋球菌在血平板上培养23小时，虽能见到菌落，但个儿很小，难以辨认其特点。23小时—36小时，菌落迅速长大。所以观看菌落特征最好在36小时左右。超过36小时，菌落特征也会有较大的改变。 5.5临床意义 淋球菌培养用作诊断和某些特殊目的。培养法对男性及女性标本都是适用的，是世界卫生组织推荐的筛查淋病病人的唯一方法，也是诊断淋病的金标准方法。 初步鉴定试验 6 6.1革兰染色 6.1.1[原理] 淋球菌有特定形态。用接种环挑取可疑菌落在玻片上制成盐水涂片，经革兰染色，若见到具淋菌特征形态的双球菌，可作出初步诊断。 6.1.2[操作步骤] 在载玻片上加盐水一滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革兰染色。 6.1.3[结果] 可见革兰阴性球菌。菌体为0.7um X 0.5um大小，呈肾形或卵圆形。约1,4为双球菌，多数为单球菌，个别呈四联或八叠状。与分泌物涂片所见不同，此涂片中无白细胞。 6.1.4[注意事项] 6.1.4.1涂片厚薄要均匀，革兰氏染色正确，必要时做阴性和阳性对照。 6.1.4.2陈旧的培养物，涂片颜色结果不典型，应取新鲜培养物。 6.1.4[临床意义] 典型革兰氏阴性双球菌表明可能为淋球菌，但必须进一步做试验鉴定。 6.2氧化酶试验 6.2.1[原理] 淋球菌在生长过程中产生氧化酶。往培养基上生长了24小时—48小时的菌落上加氧化酶纸片(0.5,—1,新配制的盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液)，淋球菌菌落的颜色可变成紫红乃至 8 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第9页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 黑色。 6.2.2[操作步骤] ?在混有杂菌的淋球菌分离平皿上用氧化酶纸片沾取菌落，如纸片变成紫红色的菌落为氧化酶试验阳性。 ?也可先挑取可疑菌落涂于氧化酶纸片上，涂菌处变成红色者为阳性。 6.2.3 [结果] 淋球菌氧化酶试验阳性。但氧化酶试验阳性者并不一定是淋球菌。 6.2.4[注意事项] ?为了保证有良好的反应，所用氧化酶试剂不应过分陈旧。正常的氧化酶纸片(盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺)应为白色色。如果纸片买来时已成灰色或黑色，说明已失效而不应使用。 ?氧化酶试剂遇铁也会出现红色而造成假阳性，所以操作用的接种环应避免用旧铁丝或电炉丝等制成，并在每次试验前先检查是否未挑菌的接种环接触试剂就有红色出现。 ?盐酸四甲基对苯二胺比盐酸二甲基对苯二胺敏感，将一滴盐酸四甲基对苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快变为深紫色并保留半分钟以上则为阳性。所以，在测定杜克雷菌等氧化酶试验弱阳性的菌株时，最好用前者。 ?如需保留菌种，在菌落未完全变黑时可挑少许转种。菌落一旦变黑，多数菌即告死亡。 6.2.5[临床意义] 氧化酶试验操作简便，是淋球菌重要的初步诊断试验之—。 标本涂片菌体形态符合淋菌特征，培养长出淋菌菌落，加上氧化酶试验阳性，即可作出初步诊断，开始治疗。如某些性状不符，则应进一步作确诊试验。 7 确证试验: 7.1糖发酵试验 [原理] 用糖发酵试验的培养基中除供给淋球菌生长所需的营养物质之外，还加有各种糖类和指示剂。淋球菌有分解葡萄糖的酶类。当它分解葡萄糖时产生酸，使培养基的PH值降低，因而培养基中的指示剂颜色改变，如酚红由红变黄，溴甲酚紫由紫变黄。 [方法] WHO推荐的快速非生长的糖以酵微量法操作如下: (1).用无选择性的巧克力或哥伦比亚琼脂平皿(含5,马血或羊血)转种受检菌株，以获得纯菌。挑取培养18—23 小时的纯菌2满环(直径3mm)混悬于无菌生理盐水中，制成浓浊菌悬液。每升BBS中含磷酸氢二钾0.4g，氯化钾8G，酚红0.6g，PH为7.1—7.2 。过滤灭菌后储存于4摄氏度冰箱备用。 (2).用5支70mm*10mm小试管，在1—4 管中分别加入20,经过滤灭菌的葡萄糖，麦芽糖，蔗糖和乳糖溶液各0.05mL。第五管不加糖(对照管)。 (3).每管加0.1mLBBS。 (4).每管加0.05mL悬液，充分混匀。在37摄氏度水浴箱中孵育4小时，观察结果; 我室主要是用商品试剂盒糖管:直接用接种针挑取单一菌落接种于每支糖管，于规定时间内观察结果(紫色变成黄色为阳性)。 [结果] 淋球菌发酵葡萄糖，不发酵其它糖。因此，只有葡萄糖管的PH下降，颜色由紫色变黄。其它糖管颜色 9 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第10页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 不变。几种奈瑟菌的糖发酵反应情况见下表。 葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 乳糖 淋球菌 + - - - 脑膜炎球菌 + + - - 干燥球菌 + + + - I型黄色球菌 + + + - II型黄色球菌 + + - - III型黄色球菌 + + - - 黏液球菌 + + + + 卡他球菌 - - - - [注意事项] (1).用于糖发酵试验的糖纯度要高(尤其是麦芽糖中含葡萄糖必须<0.25,)。最好用分析纯试剂。麦芽糖中若混入葡萄糖，可产生使人误解的结果。 (2).用作试验的菌要纯。如混有杂菌，会使结果杂乱无章。 (3).应该使节用18—23小时的淋球菌培养物。如超过23 小时的培养物，可能产生假阴性结果。 (4).现已有一些满意的商品化糖发酵试验，如Minitek(BBL分司出品)。操作时，将浸有高浓度糖的纸片放到一塑料凹孔中，加入浓厚菌悬液，孵箱中培养。多数反应发生在4小时之内，个别菌株培养过夜后读结果。 (5).缓冲液PH不合适或放在二氧化碳孵箱中培养，会使所有糖管均变黄。 [临床意义] 糖发酵试验是淋球菌的的确证鉴定试验。确证和区别其他奈瑟氏菌。 7.2仪器鉴定及药敏鉴定(详情参考微生物淋球菌sop操作文件) 8 产青霉素酶淋球菌菌株(PPNG)测定(纸片法)。 8.1 原理 某些淋球菌菌株获得耐药质粒后产生β-内酰胺酶。该酶能分解头孢硝噻吩分子结构中的β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。 8.2 材料 β-内酰胺酶测定商品试剂盒 8.3 操作步骤 a.将待测菌株培养过夜。 b.将头孢硝噻吩纸片置于无菌平皿中无菌生理盐水湿润并设阴性对照。 c.挑取待测菌直接涂布于已湿润的头孢硝噻吩纸片上。 d.盖盖后于37?孵箱培养10分钟，观察结果。 8.4 结果 产酶菌株分解头孢硝噻吩分子结构中的β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色。 8.5 临床意义 用于检测淋球菌是否为产β—内酰胺酶菌株。 10 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第11页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 9. 淋球菌的药敏感性测定方法(手工法) 当前，由于不规则用细菌变异的结果，我国已出现了淋球菌的而药株。检测淋球菌对抗生素等药物的敏感性，可以用来检查是否产生了耐药株及比率，为修订淋病治疗和制订防治对策提供重要的流行病学依据。 测定淋球菌对药物的敏感性的方法很多。我室主要用:纸片扩散法和仪器MIC. [原理] 将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上，药物即扩散到琼脂中，如果淋球菌对此药敏感，则生长被抑制，在纸片周围形成一个透明的抑菌圈。琼脂中药物浓度与纸片距离成反比，距纸片越远药物浓度越小。因此，可根据抑菌圈的大小判定细菌对该药物的敏感程度。 1.1. 方法 (1).用无选择性培养基(如巧克力培养基)再次分离淋球菌，挑取符合标准 的淋球菌菌落转种，置36摄氏度烛缸培养18—23 小时，以得到纯菌。 (2).刮取菌苔洗于M—H 肉汤中，振荡，获取均匀的菌液。用Mc Farland 比浊管比浊成0.5麦氏浓度浓度。 (3).用灭菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于培养基表面待干。为使菌液干得较快，可先将培养基平皿在试验前置于37摄氏度孵箱中半开盖烤20—30分钟，以除去表面水汽。 (4).用无菌镊子将各种药物纸片紧贴于培养基表面。要求每张纸片中心间的距离不少于23mm。每个90mm的平皿可均匀贴7张纸片。然后放烛缸于此35摄氏度孵育或潮湿的含5—10,二氧化碳孵箱培养。 (5).培养16—18小时(也可24小时)观看结果。检查平皿并测量抑菌圈完全的抑菌圈直径。参照标准报告结果。 [结果] 按下表数值判定结果: 淋球菌耐药测定(纸片法)判定标准(NCCLS,2000) 药物 纸片中药抑菌圈直径(mm) 物的含量 耐药 中间值 中间敏感 敏感 青霉素 P 10IU =<26 -- 27—46 >=47 头孢曲松 CRO 30ug -- -- -- >=35 大观霉素 SH 100ug =<14 15—17 -- >=18 四环素 TE 30ug =<30 31—37 >=38 环丙沙星 CIP 5ug =<27 28—40 >=41 氟哌酸 NOR 5ug =<23 -- 25—30 >=31 [注意事项] (1).目前用于治疗淋病药物可分为7大类，每一类药中只选一种为代表测试，其敏感程度即可代表其它同类的药的敏感性。a.青霉素类，包括青霉素G、氨苄青霉素。羟氨苄青霉素，其代表药物是青霉素G;b.四环素类，包括盐酸四环素、多西环素和米诺环素，代表药物是盐酸四环素;c.大观霉素类;d.第二、三代头孢菌素，包括头孢甲氧噻吩、头孢呋肟和头孢曲松，可任选一种作敏感性试验;e.氯霉素类，包括氯霉素和甲砜霉素可任选一种作代表;f.氨基糖甙类抗生素，主要是卡那霉素;g.喹诺酮类药，包括氟哌酸、氧沙星和环丙沙星，代表性药物是氟哌酸。 11 文件编号:东莞市大岭山医院检验科 XBSYS-SOP-005 淋球菌实验室检验 页码:第12页，共7页 作业指导书 操作规程 版本:A/0 生效日期:2013-12-15 (2).虽然M—H 琼脂用于敏感试验一般来说是可靠的，但偶尔在某些批号间有显着差异，如果一种批号的培养基不能适合待试菌的生长，扩散试验中所得抑菌圈直径通常变大，可能超出质控范围，而且可以产生错误的结果。 (3).应使用培养18—24 小时的菌落制成悬液并立即将悬液调节1,10E8/mL的浓度。为比浊准确起见，应将试管对着白底黑纸卡以便于比较。有些试验装置可使接种物直接标准化而不需调整。 (4).在将菌株悬液浓度调整后的15分钟内，用棉拭子蘸菌液在经过烘烤的GC培养基整个表面密集涂布。每次将平皿旋转60度，以保证接种物均匀分布。如培养皿涂布满意且接种物正确，菌在平皿中为融合生长，则抑菌圈为一致的圈形，如为孤立的菌落生长，说明接种物过少。接种后盖上平皿盖放置3—5 分钟，使多余的水份被吸干，然后再贴药敏纸片。避免接种物过低，不能用未经稀释的培养过的肉汤培养基接种平皿。所用肉汤的PH值应为7.2—7.4。 (5).将适宜的药物纸片放于接种菌液琼脂平皿上。用镊子或针尖将每个纸片轻轻压在琼脂表面以确保完全贴紧。由于某些药物的扩散极快，纸片一旦巾到处平皿上就不要再移动。 (6).培养16—18 小时后，检查平皿并测量抑菌完全的抑菌圈直径(也包括纸片直径)。测量最小达毫米水平，用游标卡尺、普通尺或特殊的来读取结果。在抑菌圈边缘，肉眼勉强可见不明显的抑菌圈内有大菌落生长时应对它传代培养，重新鉴定。抑菌圈通常轮廓清楚，而朦胧的微弱生长可忽略不计。 (7).用于敏感性试验的含药纸片，一般需分开装瓶，包装中须确保防潮。为了长期保存需:a.根据药物的性质需冷藏(8摄氏度以下)或在—14摄氏度以下冰冻保存。 b.为了保持纸片的药效，B—内酰胺族的含药纸片需冻存，少 量因工作需要的或在冷藏条件下保存一周。c.试验前将冷藏箱或冷柜中未开封的纸片容器取出，放置1—2 小时使它们与室温平衡，然后再打开容。这样可减少热空气与冷的纸片容器发生水汽冷凝现象。d.当使用一种特殊的纸片分配器时，必须将其盖紧，并附有指示剂变色时应及时更换以免过潮。e.在不使用的情况下，应将装有纸片的分配器冷藏。f.纸片应在有效期内使用，已到处失效期的纸片应扔掉。 [临床意义] 纸片扩散法是检测淋球菌对抗生素等药物敏感性最常用的方法。此法操作简便，一次试验可得出菌株对几种抗生素的结果。如果一个地区对某种特定抗生素的耐药率很低，那幺用纸片扩散法比将全部菌株用琼脂稀释法测定MIC更为实用，尤其是这种抗击生素在所在地尚未广泛使用时。但纸片法受多种因素影响，结果常不够稳定，不少学者认为，本试验的目的主要是用以指导治疗。“敏感”提示用所试药物以标准剂量进行治疗时失败的可能性<5,;“耐药”提示临床治疗时力的失败率>15,;“中等”结果提示患者用标准剂量的被试抗生素治疗，预期失败率为5,--15,，因而大部分中度敏感的患者，用较高剂量或延长疗程则治愈率仍可>95,。若对本地区菌株进行系统耐药监测，则应使用琼脂稀释法测每年菌株的MIC。 国外有些实验室只作青霉素和大观霉素二种纸片，以便初步推测分离的淋球菌是否为PPNG菌株和对大观霉素是否敏感。四环素敏感性范围很大，存在质粒介导及染色体介导两种耐机制，在纸片上常难以解释。常规筛查对四环素的耐药性，在于发现质粒介导的高度耐药，因这类菌株也易获得对其它药物耐药的因子。 编 写: 冯文聪 审 核:李志榕 批 准:刘发全 日 期: 2013 年 12 月15 日 12