【doc】PMSG对兔超数排卵的影响及卵巢组织学观察

【doc】PMSG对兔超数排卵的影响及卵巢组织学观察 PMSG对兔超数排卵的影响及卵巢组织学 观察 一 实验与研究一中国养兔杂志6/2004l7 PMSG对兔超数排卵的影响及卵巢组织学观察 毛冠平张金友刘云波郎洪艳田亚光张贵学 (东北农业大学动物科技学院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要分别用50IU和100IU两种剂量的PMSG对两组各13只成年哈白母兔进行超排处理,48 小时后配种,同时耳静脉一次性注射人hCG50IU,52小时后手术冲卵.50IU和100IU两种剂量处 理后的母兔卵巢平均排卵点数分别为10.83个和13.80个(P>0.05),平均获卵数分别为7,05个 和7,96个(P>0.05),平均充血卵泡数分别为7,30个和15.36个(P<O.01);50IU 处理情况下,卵 巢单位面积各级卵泡数量(个/1000~m),原始卵泡43?4,初级卵泡10?1,次级卵泡3?1,充血 卵泡2?1;100IU处理情况下,原始卵泡52?5,初级卵泡14?4,次级卵泡6?1,充血卵泡4?1.卵 泡膜在卵泡细胞达2层时出现,透明带在卵泡细胞达3层时出现,卵泡腔在初级卵泡末期,卵泡颗 . 粒细胞层达7层时出现 关键词兔超数排卵;卵泡;PMSG;hCG 目前,超数排卵仍是胚胎移植应用与研究的关 键,能否获得大量,可用的胚胎和卵母细胞,是胚胎 移植业中取得效益和科研取得成功的关键环节.兔 超数排卵从理论和实践方面均是一种重要和实用的 研究和手段,故本实验观察两种剂量PMSG对 其卵巢反应的影响,观察不同剂量激素下卵巢的光 镜组织学变化和卵泡发育过程,以期探讨不同剂量 反应的可能原因,从而为生产实践提供理论和实践 的依据. 1材料与方法 1.1实验兔由哈尔滨制药总厂实验动物中心提 供,身体健康,母兔体重在2.5kg左右,公兔体重在 3.0kg左右,按常规方法饲养管理,单笼饲养.将26 只母兔随机分为A,B两组,分别肌肉注射PMSG 50IU(A组)和100IU(B组),48sJ,U~后,耳静脉一次 性注射hCG50IU,同时配种,52小时后手术冲卵,记 录排卯点,充血卵泡数和冲出卵泡数.同时迅速取 卵巢在4%甲醛的PBS缓冲液中固定,脱水,透明, 浸蜡,包埋,切片,染色,在OLYMPUS光学显微镜下 对切片进行组织学观察,切片观察间隔200txm. 1.2孕马血清促性腺激素PMSG宁波市激素制 品有限公司生产,批号为030515.人绒毛膜促性腺 激素HCG,宁波第二激素厂生产,批号为010602. 1.3卵泡评定原始卵泡,卵泡细胞微一层 单层扁平上皮;次级卵泡,卵泡细胞为多层,细胞间 出现call—exnerbody;初级卵泡,原始卵泡和次级卵 泡之间阶段的卵泡. 由于固定,卵巢形状有所变化,切片后截面呈长 方形,正方形,三角形,面积按各自形状计算. 1.4统计学分析用方差分析方法对所得数据进 行统计学分析. 2试验结果 2.1两组处理卵巢反应(见1) 2.2两组处理卵巢单位面积各级卵泡数(见表2) 表l两组处理卵巢反应统计分析 注:卵巢充血卵泡直径在1mm以上的计数. 18ChineseJournalofRabbitFarming6/2004一实验与研究, ?初级卵泡和次级卵泡中无卵子的不计数. 2.3两组处理卵巢上卵泡发育情况(见表3,表4) 表3卵巢卵泡发育情况统计分析 表4出现各结构时颗粒细胞层数 3讨论与分析 3.1排卵点数与充血卵泡数 从表1的结果可以看出,两组处理卵巢上的排 卵点数差异不显着(P>0.05). 哺乳动物出生时,卵巢内有大量的原始卵泡,大 约有10万以上,但在雌性动物一生中仅约400 500个卵泡发育成熟,经自然排卵所排出的卵母细 胞是相当少的【2】.其余的卵泡发育到一定程度自行 退化,这个退化过程叫做卵泡闭锁.每一次卵泡周期 总会有几个卵泡发育而成为优势卵泡,其中通常有 一 个优势卵泡继续生长发育,最后破裂排卵,这是对 单胎动物而言的.像兔这样的多胎动物,一次可有多 个卵泡同时成熟,破裂,排出多个卵子.卵巢中同, 卵泡周期之所以存在有些卵泡闭锁的现象,是与雌 性动物体内激素水平相关的:体内激素水平不足以 使同一批生长的卵泡都达到成熟阶段,所以一些卵 泡在发育的不同阶段闭锁,由此看出卵泡间的生长 并非完全独立.PMSG+hCG之所以有超数排卵的作 用,就是因为PMSG有FSH样的作用,而hCG有LH 样的作用,通过注射PMSG+hCG,能补充体内激素 水平的不足,使更多的卵泡得到发育,成熟,这就是 超数排卵的理论依据.一个卵泡周期中一部分发育 较早的卵泡形成优势卵泡,在接受大量外源PMSG 的刺激下,迅速发育成熟,同时也将对其他一部分卵 泡的发育产生不利的影响. 另外,在实验中观察卵巢时还发现,B组卵巢上 的成熟卵泡明显多于A组卵巢上的,但A组卵巢上 的成熟卵泡几乎都排卵,而B组卵巢上的成熟卵泡 则有的排卵,有的形成充血卵泡,说明B组兔卵巢 上成熟卵泡排卵不充分.所以,总的看来A,B两组 处理排卵点差异不显着b】. 由表1可见,两组处理兔卵巢上充血卵泡数差 异极显着(P<0.01). 充血卵泡是在排卵初期形成的.排卵初期,颗粒 层逐渐变薄n(见表3).有的地方甚至完全脱落,使 一 实验与研究一中国养兔杂志6/20o419 卵泡内膜毛细血管和卵泡腔间只隔一层薄薄的基 膜,在LH排卵峰(或注射hCG)后,卵巢的血液迅速 增加,卵泡向黄体发育,这时内膜毛细血管就有突破 基膜进人颗粒层的趋势,进而有可能使卵泡血管破 裂,形成充血卵泡【5】. PMSG有FSH和LH的双重作用,一方面促进 卵泡生长,发育,另一方面可使卵巢中血液供应量大 幅增加】.当在一定的剂量范围内,大量的外源 PMSG注人动物体内后,卵巢上就会有大量卵泡生 长发育,然而卵巢所能承受的成熟卵泡数是有一定 限度的,这样就必然导致卵巢超负荷运转.同时 PMSG的LH作用导致了卵巢卵泡血管扩张,内压升 高,进而导致内膜,颗粒膜的破裂,血细胞流人管腔, 形成大量充血卵泡.所以注射PMSG的剂量不同,卵 巢上充血卵泡的数量就出现很大差异. 3.2获卵数结果的分析 表1的统计分析表明,两组处理获卵数差异不 显着(P>0.05).获卵数差异不显着进一步说明了两 组处理排卵点差异不显着.但表1B组中获卵数较 排卵点数差异较大,可能是由于IOOIUPMSG对兔 卵巢过于刺激.有报道称,超排剂量过低时,不足以 引起较多卵泡成熟,剂量过高时,又引起"过刺激"而 减少卵子回收率.Kennelly等认为,由于过刺激,一 方面因内源雌激素分泌而影响了卵子的运行速度, 另一方面有部分卵子残留在卵泡中,还有可能是 由于激素水平过高使卵子发育不正常产生过大的卵 子,这样的卵子不能正常地进人输卵管伞部,或卵巢 表面大量充血卵泡使输卵管伞部承接卵子的能力下 降,所以卵子滑落到腹腔内部.还有研究证明,有些 卵泡即使有排卵点存在,卵子也没有排出来,这种 情况在超排中更是常见. 33卵巢单位面积各级卵泡数的分析 单纯观察每种剂量下卵巢单位面积各级卵泡数 及总数并无意义,但本实验是比较两组之间的差异, 它可以反映卵巢之间的变化,进而反映不同剂量激 素处理后的效果. 表2两组处理卵巢单位面积各级卵泡数统计分 析结果表明,卵巢单位面积原始卵泡,初级卵泡数和 各级卵泡总数差异不显着(P>0.05);次级卵泡,充 血卵泡数差异显着(P<O.05). PMSG的生物学功能表现在能促进卵泡的生长 发育,成熟排卵,但有报道称其对有腔卵泡之前各级 卵泡的生长不起作用,即原始卵泡发育到初级卵泡 的早期,不受垂体促性腺激素的控制,其发育取决于 卵泡本身的内在因素.有报道称,切除下丘脑的雌性 动物卵巢内原始卵泡和初级卵泡仍能发育[21.到初 级卵泡发育晚期,颗粒细胞上出现了FSH受体,内 膜细胞上出现了LH受体.到次级卵泡期,颗粒细胞 上出现FSH受体数量进一步增加,FSH在雌激素的 协同作用下,诱导颗粒细胞出现LH受体,并随着卵 泡发育成熟,颗粒细胞与内膜细胞上的LH受体不 断增加.从次级卵泡发育阶段开始,卵泡受垂体促性 腺激素的控制,促使其发育成熟. PMSG作用于卵巢,使卵巢上大量卵泡生长发 育,卵巢上血管增生,基质增加,这样会使卵巢体积 有增大的趋势,不同剂量的PMSG的影响效果也不 同:剂量大的,使卵巢体积增大的趋势就大.同时, Pincus指出:PMSG有引起囊肿卵泡和充血卵泡的 趋势"】. 各级卵泡中,原始卵泡,初级卵泡的个数是大量 的,而次级,充血卵泡的个数是少量的,所以卵巢单 位面积各级卵泡总数差异不显着. 以上分析能较好的解释表2统计分析所产生的 结果,卵巢单位面积原始卵泡,初级卵泡和总数差异 不显着,而次级卵泡,充血卵泡数差异显着. 3.4兔卵巢及卵泡发育情况 卵巢表面覆盖一层生殖上皮,上皮细胞的形态 可区分为扁平状,立方状或矮柱状,其中矮柱状上皮 细胞分布范围最广.上皮之下为致密的结缔组织的 白膜,白膜深面为卵巢实质.卵巢实质可区分为外周 的皮质部和中央的髓质部.皮质较厚,占卵巢实质的 大部分,内有许多大小不等,处于不同发育时期的卵 泡和退化的卵泡(图1),除原始卵泡外,在其他各级 卵泡周围是密集的致密结缔组织纤维,其间富有很 多界线不清的梭形细胞(类似幼稚的成纤维细胞)和 网状纤维,胶原纤维较少n.髓质位于中央,由疏松 结缔组织构成,富有血管. 兔卵泡发育的模式,过程与其他哺乳动物卵泡 发育过程有共同特点,随着卵泡的发育,各层厚度增 加,各层细胞直径增加. 卵泡由卵母细胞(oocyte)和卵泡细胞(follicular cel1)组成.卵泡发育是个连续的生长过程,其结构发 生一系列变化,一般可分为原始卵泡,初级卵泡,次 级卵泡和成熟卵泡四个阶段.初级卵泡和次级卵泡 20ChineseJournalofRabbitFarming6/2004一实验与研究一 图1卵巢切片:(a)生殖上皮;(b)初级卵泡;(C)原始卵泡 又合称为生长卵泡. 原始卵泡(primordialfollicle)位于皮质浅部,体 积小,数量多(图1),呈圆形或卵圆形.卵泡中央有 一 个初级卵母细胞(primaryoocyte),周围为单层扁 平的卵泡细胞(又称颗粒细胞),细胞直径3.90? 0.601xm.初级卵母细胞圆形,较大,核大而圆,位于 细胞中央,染色质细疏,着色浅.卵泡细胞外面有薄 层基膜. 初级卵泡(primaryfollicle)(图2)由原始卵泡发 育形成.此时期的初级卵母细胞体积增大,卵泡细 胞由单层扁平变为一层或多层立方形或柱状,细胞 直径6.60?0.801xm,层数达3.25?0.79层,层厚在 23.O0?6.301xm.初级卵泡早期,当卵泡细胞达到 2.17?0.41层时,卵泡周围的结缔组织梭形细胞逐 渐密集形成卵泡膜,它与卵泡细胞之间隔以基膜. 随着生长,卵母细胞和卵泡细胞之间出现一层含糖 图2初级卵泡:(a)卵母细胞;(b)卵泡膜 蛋白的嗜酸性膜,称为透明带(zonapellucida),它是 卵泡细胞和初级卵母细胞共同分泌形成的.透明带 一 般在卵泡发育的早期出现,但在不同动物和人出 现的时期先后各有不同,大熊猫在卵母细胞外包一 层矮柱状卵泡细胞时出现透明带1131,人,山羊在卵 母细胞周围有2—3层卵泡细胞时形成完整的透明 带【j引.实验表明,家兔则是当卵泡细胞达3.25? 0.50层时出现透明带,随卵母细胞的增长和卵泡细 胞的增多,渐成为完整的膜,并缓慢增厚,当卵泡发 育达次级卵泡时,透明带最厚.初级卵泡逐渐移至皮 质深层,颗粒细胞排列渐疏松,当颗粒细胞增殖达 7.O0?1.41层时,在颗粒细胞之间逐渐出现一些大 小不等的腔隙,即考尔一爱克斯诺小体(call—exner body),其数量随卵泡的生长而增多(图3).小体为 圆形囊泡,腔面是一层基膜,腔内充满由颗粒细胞分 泌和从血管渗透出来的卵泡液,共同参与卵泡液的 形成.此时,卵泡成纤维细胞层数4.10?1.O2层,细 胞层厚l1.2O?3.401xm. 图3次级卵泡:(a)卵母细胞;(b)call—exnerbody 初级卵继续生长至出现考尔一爱克斯诺小体时 成为次级卵泡(secondaryfollicle),卵泡体积更大,卵 母细胞迅速增大,卵泡颗粒层细胞增殖成9.35? 1.35层,颗粒细胞直径7.10?1.O01xm,颗粒层厚 83.O0?9.401xm,透明带逐渐增厚,达4.90? 1.O01xm.随着卵泡的生长发育和卵泡液的增多,考 尔一爱_兑斯诺小体逐渐融合成一个较大半月形的 腔,称为卵泡腔(follicularantrum)(图4).卵泡液除 含有一般营养成分外,还有卵泡分泌的类固醇激素 和多种生物活性物质,对卵泡的发育成熟有重要影 响.随卵泡的生长发育和卵泡液的增多,卵母细胞与 一 实验与研究一中国养兔杂志6/2oo42l 图4有腔卵泡:(a)卵泡腔;(b)卵母细胞 周围的一些卵泡细胞逐渐被挤至卵泡一侧,形成卵 丘,其余颗粒细胞构成卵泡壁(即颗粒层).在卵泡 生长过程中,卵泡膜分化为内,外两层.内膜层 (thecaintema1)含有较多的多边形或梭形的膜细胞 (thecacel1)和丰富的毛细血管,膜细胞具有分泌类 固醇激素的结构特征.外膜层(thecaexterna1)主要 由结缔组织构成,胶原纤维较多,并含有平滑肌纤 维.具有卵泡腔的次级卵泡和成熟卵泡又称为囊状 卵泡.由于卵泡液增多和卵泡腔的扩大,次级卵泡 直径急剧增大.次级卵泡继续生长,逐渐成为接近 成熟的卵泡,分布在皮质深层至卵巢表面. 处于排卵前期的成熟卵泡数量极少,在卵巢切 片中尚未见到此期的成熟卵泡. 血液浸人卵泡腔成为充血卵泡,充血卵泡除颗 细胞层层数较次级卵泡有所减少以外,各层厚度都 明显增加.光镜视野中可见卵泡壁凹陷,大小不等, 大量血细胞,部分卵泡细胞游离于卵泡腔中,颗粒细 胞排列散乱,细胞层厚度149.60?22.801.zm,层数 8.80?2.07层,细胞直径14.70?1.801.zm,是次级 卵泡的两倍还多(见表3),失去原来较为规整的排 列秩序(图5). 4结论 4.1两种剂量(50IU和100IU)PMSG处理后的母 兔卵巢平均排卵点数分别为10.83个和13.80个, 差异不显着(P>O.05);平均获卵数分别为7.05个和 7.96个,差异不显着(P>O.05);平均充血卵泡数分 别为7.30个和15.36个,差异极显着(P<0.01). 4.2单位面积各级卵泡数量显示,两种剂量(50IU 和1OOIU)PMSG处理后,兔卵巢上原始卵泡(43?4, 图5充血卵泡 52?5),初级卵泡(10?1,14?4)及总数(59?4, 75?10)无影响;次级卵泡(3?1,6?1),充血卵泡 (2?1,4?1)有影响,差异显着. 4.3充血卵泡除颗粒细胞层层数较次级卵泡有所 减少以外,各层厚度都明显增加,卵泡壁凹陷,大小 不等,大量血细胞,部分卵泡细胞游离于卵泡腔中, 颗粒细胞排列散乱. 4.4卵泡膜在卵泡细胞达2层时出现,透明带在 卵泡细胞达3层时出现,卵泡腔在初级卵泡末期,卵 泡颗粒细胞层达7层时出现(表4). 5参考文献 1GregoryPW,Thepotentialandactualfecundityofsome breedsofrabbits.J.EXP.,2001,1932,62:271—285 2谭景和.秦鹏春.超数排卵及其存在的问题.黑龙江畜 牧兽医.1987.5:33,37 3王海霞等,两种剂量的PMSG对兔超数排卵效果的影响. 黑龙江动物繁殖,1997,vol5,3:8—9 4张贵学,秦鹏春等,超排兔卵巢卵泡腔充血的研究,黑 龙江畜牧兽医,1995,11:1—2 5佐久问勇次等(日)静脉注射PMSG诱发家兔超排反应. 畜牧学文摘,1984,1:15 6Wurtam.Aneffectofluteanizlnghormoneonthefractional perfusionoftheratovary,Endocrinology,1964.75:972, 982. 7KennellyJJ,FooteRH'Superovulatoryresponseofpreand postpubertalrabbitstocommerciallyavailablego? nadotrophins,J.ReprodFert,1965,9:177—188 8范必勤,熊慧卿,邵春荣,家免超数排卵的研究.中国养 兔杂志.1987.1:25—30 9PincusG.Supemvulationinrabbits.AnatomicalRecord, 1940.77(1):1,8 22ChineseJournalofRabbitFarming6/2004一实验与研究一 10PintadoB,Ghtierrez—AdanA,PerezLlanoB.Super- ovulatoryresponseofmurciangoatstotreatmenmbasedon PIVNG/anti—PIVNGorcombinedFSH/PIVNGadmin. istration.Theriogenology,1998,50(3):357—364 ll王海龙,田志国,张贵学.PMSG对母免卵巢机能的影响. 中国养兔杂志,2001,3:18,20 12FassiFihrilA,HajjiKHandLakhdissiH.Histological explorationoffollicularpopulationoftheMoroccanbovine (Oulmes—Zaers)breed,AfricanJournalof Biotechnology,May2004,Vo1.3(5):294—298 13冯文和,肖蕾,赵涛等.大熊猫卵泡及卵母细胞发育的 研究.兽类,1996,16(3):161,165 14成令忠.组织学与胚胎学.北京:人民卫生出版社, 1996,224,237 15俞诗佩.人体组织解剖学.兰州:兰州大学出版社. 1998,138—150 16谭景和,孙青原,杨增明等.山羊卵母细胞发育的超微 结构研究.解剖,1992,23(1):160 TheEffectsofPMSGonSuperovulationand HistologicalStudyofRabbitOvaries MaoGuanpingZhangJinyouLiuYunboeta1. (CollegeofAnimalScience,NortheastAgriculturalUniversity,HaerbinHeilongjiang150030) ABSTRACTThe26Haerbinrabbitsweredividedintotwoequalgroupsandsuperovulatedwith50IUand100IU PMSGindividually.50IUhCGwasinjectedthroughearviena48hrslaterandsurgicalova— flashingwasdone 50hrslater.Ovulatedfolliclesoneachovarywere10.83andl3.80(P>0.05)fortwogroups.Averageovawere 7.05and7.96(P>0,05).,I'heaveragefollicleswithbloodwere7.30andl5.36(P<0.01).Thefollicularnumbers ofperlO00~mwere43?4,10?l,3?1and2? 1forprimordial,pimary,secondaryfolliclesandthefollicles withbloodintheircavitiesrespectively.Follicularmembraneoccurredwhenfollicularcellsdevelopedintotwo layersandzonapellucidappearedatthreelayersoffollicularcells.Thefollicularcavitybegantodevelopattheend ofprimaryfolliculardevelopmentwith7layerofgranulasa. KEYWORDSRabbitovary,Superovulation,Follicle,PMSC,hCG口(收稿日期:2004— 09—06) (上接第30页) 3.1兔颈动脉采血用3%戊巴比妥钠(1mL/kg 体重,耳静脉注射)将兔麻醉后,仰卧位固定.以颈 正中线为中心广泛剃毛,并用酒精消毒,从距头颈交 界处5,6cm的部位用直剪刀剪开皮肤,将颈部肌 肉用无钩镊子推向两侧,显露气管,即可看到平行于 气管的白色迷走神经和白桃色的颈动脉.分离颈动 脉,但注意不要损伤迷走神经和营养气管的小血 管.然后,先结扎动脉的远心端并在近心端放一缝 合线,在缝线处用动脉夹夹紧动脉,在结扎线和近心 端缝线之间用眼科剪刀呈"T"或"V"形部分剪开血 管,并将尖端呈斜形的塑料导管经切口处向心脏方 向插入1,2cm.然后结扎近心端的缝线,将塑料管 的另一端放人采血的容器中.缓慢松开动脉夹,血 液便会流出. 3.2腹主动脉采血麻醉动物,将动物仰卧固 定.打开腹腔,开腹时,要尽可能减少出血.打开腹腔 后,将肠管向左或向右推向一侧,然后用手指轻轻分 开脊柱前的脂肪,暴露出腹主动脉.在腹主动脉远心 端打一结,再用动脉夹夹在腹主动脉另一端,用注射 器平行刺人,松开动脉夹,立即采血.也可在远心端 不打结,只在近心端阻断,然后在髂总动脉分又处向 血管平行刺人,刺后立即抽血. 4小结 以上兔的采血方法是科研实践中不断尝试而积 累的常用方法.科研人员可在实验过程中根据自身 实验的要求,确定合适的取血方法,以便取碍满意的 实验结果.口(收稿日期:2004—09—27)