重组人胰激肽原酶发酵及复性的研究（可编辑）

重组人胰激肽原酶发酵及复性的研究（可编辑） 重组人胰激肽原酶发酵及复性的研究 北京化工大学学位原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名: 日期: 趁f兰!色:苎 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属 北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论 文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 保密论文注释:本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用 本授权。非保密论文注释:本学位论文不属于保密范围，适 用本 授权书。 作者签名:禾圣坐I 日期: 醴f2:笸，兰 导师签名:乏幽一 日期:塑擘151 r ;爨露 I禽馥蠡赫畿 燮 囊l 蘸瓣 鹱魏翠 慧鬻 黼 疆搏 鋈麟 麓一 瓣 孽 鬻 蒸 i;懿_:!藤葛窳《?琏 蕤 鬻 麓 蘩器霆 豢睡 鬻 麟霾 霹鬻 l 黎 黼 躲 羹麓燃 鍪 黼 簇 懑鬻 强 霾 鬻 熬羹 Y2139360 学位论文数据集 5 350(25 中图分类号 Q81 学科分类号 论文编号 1XXXXXXXXXX05 密 级 学位授予单位代码 1OOlO 学位授予单位 名称 北京化工大学 作者姓名 郭平川 学 号 2009001305 获学位专业名称 微生物与生化药学 获学 位专业代码 100705 课来源 其他项目 研究方向 生物制药 论文题目 重组人胰激肽原酶发酵及复性研究 关键词 重组人胰激肽原酶，包涵体，凝胶过滤复性，尿素梯度 论文答辩日期 2012(06(04 。论文类型 基础研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名 职称 工作单位 学科专长 指导教师 陈劲春 教授 北京化工大学 生物制药 评阅人l 王台 研究员 中科院植物所 分子生物学 评阅人2 马润宇 教授 北京化工大学 生物化工 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席 徐家立 研究员 中科院微生物所 微生物发酵 答辩委员1 杨建国 研究员 中科院动物所 动物学 答辩委员2 刑建民 研究员 中科院过程所 分子生物学 答辩委员3 刘春朝 研究员 中科院过程所 基因工程 答辩委员4 张铁锐 研究员 中科院理化所 基因工程 答辩委员5 注:一(论文类型:1(基础研究 2(应用研究3(开发研究4(其它 二(中图分类号在《中国图书资料分类法》查询。 1374 三(学科分类号在中华人民共和国国家标准 GB,T 5―9 学科分类与代码》中 查询。 四(论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 摘要 重组人胰激肽原酶发酵及复性研究 摘要 KKS系统的重要组成成分，能够起到抑制血小板凝聚，改善血液循 环和降低血压效果，广泛用于治疗糖尿病，心脑血管，高血压等疾病。 本实验重点放在重组人胰激肽原酶的初步发酵优化以及KLK包涵体 的变复性工艺。 采用单因素的实验，研究了影响重组人KLK表达的条件， 结果表明:诱导剂IPTG的最适浓度为O(6mm01??L-1;最佳的诱导时 间为4h;最佳的Amp的浓度选择为60g‘L-1;最佳的培养温度为37?; 0 8 最佳的酵母抽提物含量为1g??L-1;最佳的胰蛋白胨含量为1g??L-1。 在此条件下，最终可以得到4(629??L-l的包涵体。 对重组KLK工程菌进行IPTG诱导表达，目的蛋白以包涵体形 式存在;超声破碎工程菌释放包涵体，经3次洗涤后纯度达到71(93,; 包涵体溶于含8MUrea的变性溶液中，浓度可达173 1 “g??mL_1。 进行包涵体稀释复性实验，三个不同的终浓度，181(51?g??mL-。; 11(24U??m旷1。在50pg(mL’1的浓度范围中，酶活最高。 一步透析法和多步透析法实验，KLK的终浓度分别达到 84(52扯g(mL一1，75(42嵋(mL_1，酶活达到O(63U(m旷1，3(13U(mg,。 T 摘要 胶过滤复性，柱子堵塞，洗脱不稳定，无法完成复性;采用Urea梯 20,，30,梯度长度下，蛋白回收率分别达到64(27,，75(68,，71(26,， 酶活达到23(21U(m旷1，48(61U(m旷1，38(27 U??m旷1。最优的梯度长度 是20,，此条件下得到的酶活高于稀释复性和透析复性的酶活;采用 离子交换色谱对KLK复性，酶活较低，但是纯度高，蛋白回收率达 到56(23,，可以作为纯化的手段。 采用传统复性法和柱复性法，包涵体KLK均可以达到一定的酶 间短和酶活高等优点，为重组人胰激肽原酶复性提供一种有效的手 段。 关键词:重组人胰激肽原酶，包涵体，凝胶过滤复性，尿素梯度 ABSTRACT 一―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――一 AND oF FERMENTATIoN THE KALLIKREIN ABSTRACT humanisan ina11 of importantpart paIrts Kallihein KLK existing usedtocontr01 of blood ofKKS plaque， improVe system a9910meration cancure mellitus blood dizlbetes， andreduce circle， pressure， Fementation andetc( fOcusonthe hyl enensionMyexperiment renaturation ofrecombinant and Condition(denaturation techniques humankallikrein optimization( resultsoffermentation thatinnuencethe yield thefactors Optimize the fermentation ofKLKfrom Finallyget optimum 1aboratory( my of induction，4hour; condition:inducersconcentration，0(6mm01-L，_1;time of cultiVation，37。C( theconcentration temperature ofAmp，60mg??L哪!;the KLK therecombinant Af ter induce engineered optimization， inthe of withIPT the existedstyle microorganismG，andtargetedprotein with inclusion Release inclusionbodV( body reach with the concentratlon threetimesofwashingbuff(er， protein with8M the includion the Urea， andprotein 71(93,:dissolve body state( reaches1 73 insaturation concentrationl?g。mrl final 12hours the ofdilution 1ater， Inthemethod ranaturation， 39(14肛g(mL_1， reach 64(23?g(mL_‘， concentration181(51?g??mL-1， reach 7(68U’m旷1， and actiVity 0(85U‘m旷1， enzyme respectively， is withinthe higher actiVity respectively( Enzyme 11(24U??m旷1 ―――――――――――――――j竺竺竺 concentration of 50肚g(mL_1( Inthe methodsof ranaturation sin91e―st印dialysisand multiple―step the dlalysls nnal renaturation， concentrationof protein KLKreach and 84(52卜Lg‘mL，-1 and 75(42“g‘mL，_1 reach respectivelyenzymeactivitv O(63U-m旷1，3(1 3U(m旷1 respectively C01umn waschoosedas themethodof chromatography renaturation( Withthe methodof cannot SEC Sephadex―G75 ，the on procedurego becauseof and of blocking ilution(、Mththe instability methodofUrea of gradient the of urea SEC，optimize1ength 1O,to gradient抒 om20,to 30,(Protein reached recoVe哆rate64(27,，75(68,， 71(26,(Specmc reached actiVity 23(21U‘m旷1，48(61U‘m旷1，38(27U??m旷 1respectivel y( Withthe of optimum gradient ofKLK 1ength20,，theactivity reach than 48(61U’m旷1 dilutionmethod higher and dialvsisranaturation themethod method;With of IEC，protein recove叫rategets56(23,， while IECcan’tmake renatIJred( includionbody Withthemethodoftraditional renaturation andc01umn inclusionof chromatography，theKLKcan body renaturedto get some extent(Becauseof betteref’fectand shorter urea couldbechoosed gradient asan efkctivemethodfbr renaturationof KT，K KEY WORDS:RecombinantHuman Kallil rein，Inclusion body;Gel nltration chromatography;Urea gradient 圜录 第一章绪 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((1 1(1胰激肽原酶概 述„„„„„„„„(j„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1(1(1化学组成与性 质„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((1 1(1(2激肽原酶的编码表 达„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一2 1(13胰激肽原酶的功 能„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((3 1(1(4胰激肽原酶在临床中的应 用„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一4 1(2激肽原酶的提取方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(5 1(2(1以猪颌下腺作为原材 料„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一5 1(2(2以猪胰腺作为原 材„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一6 1(2(3其它动物或者组织的来 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1(5课题研究意 义„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„17 第二章KLK工程菌发酵培养的优 化„„„„„„„„„„„„(19 2(1引言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„19 2(2仪器和材 料„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„20 2(2(1试剂和培养 基„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(20 2(2(2实验菌种„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„20 2(2(3仪器设备„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 2_3实验方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 2(3(1工程菌活 化„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 2(3(2工程菌培 养„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„22 2(3(2(1种子液培 养„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一22 2’3(2(2摇瓶发酵培 养„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(22 2-3(2(3菌种保 藏„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(22 2(4发酵中各因素对重组人KLK表达影响„„„„„„„„„„„„„„„„(22 2(4(1诱导时 间„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„22 2(4(2培养基中mnp浓度„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一23 2(4(3诱导剂PTG浓度„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(23 2(4(4培养基成 分„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 II 目录 2(4(4(1酵母抽提 物„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(23 2(4(4(2胰蛋白 胨„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(24 2(4(5诱导温度„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„24 2(5分析方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„24 2(5(1SDS―PAGE分析目的蛋白表达„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(24 2(5(2菌体浓度测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 2(6结果与讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 2(6(1重组人?LK工程菌的生长„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一25 2(6(2诱导时间对于KLK表达的影响„„„„„„„„„„„„„„„„„„一26 2(6(3氨苄浓度对KU 表达的影响„„((j„„„„„„„„„„„„„„„„„27 2(6(4 PTG浓度对于目的蛋白表达影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 2(6(5培养基组分对KLK表达影响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((30 2(6(5(1酵母抽提物对目的蛋白表达影响„„„„„„„„„„„„„„„„„(30 2(6(5(2胰蛋白胨对目的蛋白表达影响„„„„„„„„„„„„„„„„„„(32 2(6(6温度对目的蛋白表达影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„:„33 2(7小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„35 第三章重组KLK包涵体获得以及传统的复性„„„„„„„„36 3(1引言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„36 3(2实验材料和仪 器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„37 3(2(1实验仪器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„37 3(2(1实验材料„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 38 3(3实验方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„38 3(3(1KLK发酵与培养„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„38 3(3(2 KLK菌体收集与破 碎„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„38 3(3(3 KLK包涵体的洗涤和精 致„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39 3(3(4KLK精制包涵体的变 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39 3(3(5KLK的稀释复 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39 III 目录 3(3(6KLK的透析复 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„40 33(6(1一步透析 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(40 33(6(2多步透析 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一40 3(4KU 分析方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„41 3(4(1Brandford法测定蛋白含 量„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„41 3(4(2人胰激肽原酶活性检 测„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(42 3(4(2(1配制试剂„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(43 3(4(2(2测定标品的OD值酶活关系„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((43 3(4(2(3测定样品的OD值变化„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(43 3(4(2(4标准蛋白酶活与0D值关系„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一44 3(4(3SDS-PAGE电泳„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(44 3(5结果与讨 沦„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„44 3(5(1重组KU 工程菌的表达形式„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((44 3(5(2包涵体洗涤次数的选 择„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„46 3(5(3包涵体的发酵含 量„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„46 3(5(4包涵体的变性以后溶液的蛋白浓 度„„„„„„„„„„„„„„„„„(47 3(5(5稀释复性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(47 3(5(6透析复性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(49 3(5(6(1一步透析法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(49 3(5(6(2多步透析法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(49 3(5(6_3一步透析和多步透析的比 较„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(50 3(6小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„50 第四章人胰激肽原酶的柱复性„„„„„„„„„„„„„„52 4(1引言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„52 4(2实验材料和仪 器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„53 4(2(1试 剂„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(53 4(2(2实验仪器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„53 IV 目录 4(3实验方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„53 413(1发酵，包涵体的制备与变 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„53 4(3(2凝胶过滤复 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„53 4(3(3尿素梯度凝胶过滤复 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„55 4(3(4离子交换复 性„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„56 4(4分析方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„57 4(4(1 KLK酶活的测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„57 4(4(2 SDS(PAGE电泳„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(57 4(4(3蛋白浓度测 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„57 4(5结果与分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„57 4(5(1KLK采用凝胶过滤复性结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„57 4(5(2KLK采用尿素梯度凝胶过滤复性结果„„„„„„„„„„„„„„„„58 4(5(2(1砌LK不同尿素梯度长度SEC复性结果„„„„„„„„„„„„„„„58 4(5(2(2KLK最优尿素梯度长度SEc复性结果„„„„„„„„„„„„„„„59 4(5_3 KLK采用离子交换复性结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„60 4(6小 结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„61 第五章结论与建议„„„„„„„„„„„„„„„„„„„63 结 沦„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(63 问题与建议„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一65 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((67 附 录„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7l 附录1: 实验仪器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(71 附录2: 实验试 剂„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(72 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„73 攻读学位期间发表的学术论文目 录„„„„„„„„„„„„((75 作者和导师简 介„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„77 V 毽缝蕊 孓,龇?墨 麟嚣黼 隧鋈黼糕黼魏蘸漉黼 薹 黧 灌 繇囊? 麓羹 囊 !缀 瓣嚣 豢 落鬻 遂 i专蠹? 黧 囊邋 ;o!再 纂囊 黼j美鬻要 羹鞫墨 鬻 》 蒸熏藕 习 ，:邃蠹 第一章绪论 第一章绪论 1(1胰激肽原酶概述 胰激肽原酶，俗名又称为胰激肽释放酶，遍布于人体当中，由4种糖和18 种氨基酸构成，是含有唾液酸的蛋白水解酶„。 胰激肽原酶是人体KKs系统的重要组成成分，起着重要的生理作用。在人 体内，广泛分布于、唾液、颌下腺和胰脏，其中胰脏是最主要的分布场所【2J。KKS 系统又称为血管舒缓素激肽系统，通过与激肽原酶相互作用，激肽原释放出来激 肽。 胰激肽原酶在临床上面已经得到了广泛的应用，医用商品名又为怡不，广泛 的用于治疗糖尿病慢性微血管并发症、动脉硬化、高血压、血栓闭塞性脉管炎和 脑循环障碍【3】。可以降低血液中的粘度，抑制血栓的形成，并且可以使微血管基 底膜的增厚受到抑制。市面上销售的胰激肽原酶多由常州生化千红制药有限公司 生产。 激肽有三方面的作用:一方面扩张血管，改善循环，松弛血管平滑肌，降低 血压;另一方面改善血管内部血液的流动速度，扩张微血管，增加组织器官内部 的血流，改善代谢;作为一利t活化因子，在其作用下，纤溶酶原激活为纤溶酶， 使得不溶性的纤维蛋白原降解为可溶性小肽，抑制血小板的聚集，从而起到抗栓 溶栓的作用【3J。 1(1(1化学组成与性质 猪胰激肽释放酶，是一种糖蛋白，以酶原的形式存在于腺体之中，同时含有 唾液酸。根据唾液酸中含量的不同，可以得到一到五个组分，在除去唾液酸以后， 酶的活性并不受到影?I匈【4】。A和B是两种常见的形式，相对分子质量分别为26800 和28600，以丙氨酸和异亮氨酸作为N一木端，以脯氨酸和丝氨酸作为C一术端， 且均含有两条肽链。两者的含糖量不同，但是均含有229个氨基酸残基，所含的 氨基酸组成相同， 其中A的含糖量为5(5,，B的含糖量为11(5,。等电点为 北京化I:人学硕+学位论文 3(9―4(37【3J。在猪胰激肽释放酶中，活性中心是组氨酸以及丝氨酸。猪颌下腺与胰 下腺的激肽释放酶相对分子质量相同，为32000[5】o 一般来说，激肽释放酶的稳定性和纯度成反比，纯度高意味着稳定性差。据 对猪颌下腺激肽释放酶的样品进行实验发现，20。50 U(mg_1样品，37?条件下， 干燥的粉末在一20。冰箱中，数月保存，未见活力有变，在水溶液当中不稳定， 可是在PH8的缓冲液或者水，冷冻状念下，可以保存相当时间活力不改变[51。 汞离子、二价铜离子、二价锰离子以及镍离子等重金属离子对于激肽释放酶， 在不同程度上发生抑制作用;螯合剂如EDTA，以及巯基化合物等可以使金属离 子对于激肽释放酶的作用得到抑制。而如二异丙基氟磷酸，抑肽酶等某些胰蛋白 酶抑制剂等均对激肽释放酶起抑制作用。钙离子，镁离子对酶的活性影响基本为 零，但是高浓度的钙，如1m01??L_1可以使酶的活性增加15,到20,。 为4或者低于4的时候，活性损失很大。猪胰激肽释放酶在58?以后不始失活， 当温度达到900的时候失活50,，当温度达到90?的时候失活70,，在40?到 50?范围之间比较稳定。在尿素中，48h活力丧失一半;8M盐酸胍中活性全部 丧失;用硼氢化钠降解，主要是降解其中的二硫键，活性未见有严重的降低;容 易受到强酸，强碱以及氧化剂的破坏;胰蛋白酶与之作用，未发现失活[5]。 1(1(2激肽原酶的编码表达 图1(1载体 Vector Fig(1―1 第一章绪论 表达的载体pET-22b-hpk的构建如图所示，载体携带着抗性基因氨苄青霉素， I以及Hind 酶切位点以及标签等，选取的两个限制性内切酶的位点分别为:EcoR III，目的基因插入其中[51。 GA ACCGCTCAAWCGTeCA:Il 图1(2KLK基冈的全序列: Full ofKLK Fig(1-2genesequence 1(1(3胰激肽原酶的功能 胰激肽原酶，同时又称为胰激肽释放酶，作为一种糖蛋白，发挥着重要的生 理生化作用，本身是一种蛋白水解酶，含有唾液酸的成分，以胰脏中的含量最高 [6] o 胰激肽原酶 KLK 广泛的存在二于二人体内，其中包括胰脏、颌下腺以及唾液 中，组成成分包括四种糖以及十八种氨基酸。对于一般的蛋白质不发生作用，作 用范围仅限于天然的纤维蛋白溶酶原以及天然的激肽原，作用于激肽原以后，激 肽原会发生裂解作用从而发挥生理学效应，特异性较强，并且几乎没有毒副作用。 发生反应以后激肽原生成一类活性的多肽，其中发生作用的主要成分是胰激 肽和进一步裂解产物缓激肽，这些物质的分布范围主要在以下领域:第一是l肾皮 3 北京化:J:_人学硕士学位论文 质;第二是髓质集合小管的上皮细胞;第三是血管的内皮与膜细胞，促使纤溶酶 原降解，形成纤溶酶以及血管抑素。在与内皮超极化因子以及内皮舒张因子发生 活化作用以后，这些因子释放出一氧化氮和PGl2前列腺素衍生物，从而在局部 的范围之内发挥作用[7】。 一方面通过改善血液循环，松弛血管的平滑肌，扩张血管，发挥一定的降低 血压的作用;在另一个方面，这些激肽可以扩张微血管，达到加快微血管内部血 液流通速度，增加器官组织内部的血液灌注量，达到改善代谢的效果。与此同时， 胰激肽原酶可以使纤溶酶得到激活，使纤溶系统的活性得到提高，促使细胞释放 组织纤溶酶原激活物，使血小板的聚集受到抑制，降低血额粘度，抑制血栓的形 成，使微血管基底膜增厚得以预防，总体改善微循环的作用[3]。 截至目前，激肽释放酶(激肽系统的研究取得了巨大的进展，这一研究对我 们疾病的治疗与预防，生活质量的改善和提高，做出了巨大的贡献。其中在心血 管疾病、高血压、糖尿病肾病以及前列腺肿瘤等方面做的研究取得了一定阶段的 进展，但是关于以下方面的研究尚处于探索的阶段:有关组织激肽释放酶的激素 调节机制，激活机制，失活机制和各种代谢途径以及底物[81。 1(1(4胰激肽原酶在临床中的应用 在临床治疗领域，数年前，胰激肽原酶已经得到了广泛的引用。由于其生理 药理作用，对于治疗糖尿病慢性微血管并发症 糖尿病神经病变、糖尿病视网膜 病变、以及糖尿病肾病 ，取得了良好的临床疗效，并且在以下疾病的治疗过程 也取得了可喜的效果【91。 第一，成年人失明的一个很重要的原因归属于糖尿病视网膜病变 DR 【m】， 随着糖尿病患病率的不断提高，糖尿病视网膜病变也成为发达国家的四大致盲眼 病之一，治疗DR成为新世纪的紧迫课题。 第二，在我国，l肾小球I肾炎是尿毒症发病的一个重要原 因。通过纤溶、凝血、 以及激肽系统等几个方面，胰激肽原酶通过与肝素的相互作用，改善肾脏的功能， 降低尿蛋白，从而延缓肾脏疾病的进展，达到良好的治疗老年慢性肾小球肾炎的 效果[1?。 第三，目前糖尿病肾病已经成为糖尿病致死的重要原因[12】，在临床治疗上面， 缺乏高效的治疗药物。糖尿病肾病早期，口服3个月的胰激肽原酶，可以显著降 低尿白蛋白。在治疗二型糖尿病早期肾病患者中起到了安全以及高效的作用„。 第四，脑梗死源于供血障碍，从而引起缺血缺氧，以至于血液粘度高凝。与 4 第一章绪论 通窍活血汤联合使用，胰激肽原酶既改善微循环的动力性障碍 即血液的粘稠浓 缩 从而推动血液中的血液动力学达到消瘀通络【1引。 表1(1KLK治疗相关疾病以及作， 【_|』 Tablel(1Treatmentandef(fectofrelateddiseases 疾病名称 作用 糖尿病视网膜病变‘7】 提高纤溶酶活， 提高血液循环，减弱粘稠度 急性脑梗死[13] 修复血(管组织， 改善血液粘稠，提高供血( 血栓闭塞性脉管炎 改善供血 动脉硬化 提高纤溶酶活 糖尿病肾病[12] 减少尿白蛋白 高血压 降低血(甘油三酯，和全血粘度 老年慢性肾小球炎‘11] 提高纤溶，改善肾脏，降低尿蛋白 脑循环障甜【13】 改善血液循环，提高供氧 二型糖尿病四 提高纤溶酶活 1(2激肽原酶的提取方法 激肽释放酶存在的范围广泛，在人以及哺乳动物中都普遍的存在着，其中包 括腺体组织及其分泌物和排泄物。故此，人们通常会选取颌下腺，新鲜的胰脏， J。 以及男性尿液等作为原料来制备【5 当前阶段，激太释放酶的获取主要是通过化学提取的方式获得的，主要原料 是猪胰脏和猪颌下腺。另外，选用哺乳动物进行提取的方法也在进行当中，如蝮 蛇的蛇毒作为原料的提取。 1(2(1以猪颌下腺作为原材料 工艺过程包括:提取，吸附，洗脱，沉淀干燥和精制五个阶段。 :I匕京化I:人学硕十学位论文 ;謦i觏爱豫 ，lj纠i《澈 哎?哆5: 水((HAc， (璇扼《 ??’鼠7r“酗、:二一叛;投 ?; ??《NH4》2Hp04。 („拣 哪“7t? ，k。 Nacl，pH8，4， 2h I ‖翻菱液 I|瞄扎， i ‖Ijf奠 7+j ??，’警j:o蠢;;乏卜’r襞j ?? j哆?艺、(jj疑基l ??滔”域;六I，?;东; pH6(7 NH3Ac(,。(o?。 15n1In PH5(S一6(7 I 曩‘l?臻鼍 0i;延j? ??,。萋囊00:乏 ??蛳，?i 。嫌 图1(3猪颌I、腺提取KLK ExtractionofKLKf’r01n in Fig(1―3 saliVary91andpig 1(2(2以猪胰腺作为原材 j援后一瓢耢 澎:; Z 汪趣‘:露 ??HAc;参g致， ??p汹j，，7，祷: 江: ??NacI。:氡求，‖、i 10 +王2b 汉j4 1 t|!。 pH8 纠藩四: 暾陵:? 澎翁(液 , ??，(t“蛰夏涟;液， , ?，7(，。:+?‘乏 ?液， ??凌鳓、豫|( 1h AmberliteCG―SO，NacI。PHS。 ，h I 图1(4猪胰卜(腺提取KLK ExtmctionofKLK矗omPorcine adenocarcinoma Fig(1-4 pancreatic 6 第一章绪论 工艺过程包括:提取、沉淀、分级沉淀、吸附、洗脱、透析、冻干三个阶段 1(2(3其它动物或者组织的来源 国外报道自肺，腮腺或者胰提取激肽释放酶精制方法:在50mL的激肽释放 酶溶液中，加入10m1 过1mol,L盐酸水解后，加丙酮沉淀，所得沉淀物的活性为95,。 在蝮蛇蛇毒中，日本佐藤分离纯化了激肽释放酶。1969年0shima等研究精 氨酸酯酶和激肽释放酶在蝮亚科，日艮镜蛇科的32种毒蛇中的分布。研究发现， 在蝮亚科中酶的活力最高，继后也从沙蝰，加蓬丝蝰毒蛇中得到了激肽酶【5J。 我国安徽蝮蛇蛇毒中，激肽释放酶经过聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的相对分子 与同本的哺乳动物中的组织激肽释放酶相同【3J。 1(2(4基因工程手段 在工业化大规模制备激肽原酶的过程中，选择生物提取的方法，存在着以下 的缺点:对环境造成严重的污染以及生产原料的来源受到限制;在临床应用的过 程当中，胰激肽原酶 动物来源 会呈现出免疫反应，选择的注射方式，只能选 用肌肉或者下皮，注射范围l包受到限制;而人源的激肽原酶却不存在这些缺点， 可以直接进行静脉的注射，与此同时治疗的效果也更加喜人【5J。鉴于以上的优点， 大量的专家和学者投入到了重组人胰激肽原酶的研究工作当中，大量的基因工程 的方法得到应用，以期能够达到工业化进行生产的目的。 在选择宿主菌的时候，原核和真核生物各自均有自己的优点，因此均被作为 实验的对象。 表1(2真核作为表达载体的研究 onthe Vector T(abIel-2Researchenkaryotic 北京化一:大学硕士学位论文 表1(3原核为表达载体的研究 Tablel-3Researchonthe vector pronucleus 目前，由猪胰提取所获得的激肽释放酶生化药物已经在市场上得到了应用， 并且取得了肯定的效果14J。但是在基因工程领域的范围内，无论是选择真核表达 又或者原核的表达范围内，在活性以及产量等方面均不理想，这与传统的提取方 法相比差距依旧偎大。人源的激肽原酶与猪源的相比，虽然在治疗效果，免疫反 应，生物活性，蛋白结构等方面都要好上很多，但是由于没有理想的让蛋白活性 改善的方法，因此进行工业化规模的生产人胰激肽释放酶还有很 远的路要走，今 后的过程中，如何能大幅的提高表达蛋白酶活，仍将是一个研究的重点和难点【刀。 1(3包涵体 1(3(1包涵体形成 科研的目的是为了促进生产效率的提高，增加产量。无论是从宿主的构建的 角度，还是从发酵培养的角度，人们总会采取各种的方法使外源基因的表达产量 和速度得到优化。然而，在细胞中，不管是重组的蛋白，还是细胞本身内部的蛋 白质，过量的表达均会形成蛋白质聚集体，其具有两个特点，一是不溶，二是无 活性【17】。 包涵体具有折光性，平均直径为0(38，光学显微镜下可以看到多孔的圆柱状 或者是卵形的结构，广泛的存在于细胞质当中，偶尔在细胞周质中也可以看到[18】。 包涵体的形成与以下几方面有关，一疏水性，二分子量，三表达系统，四折 叠途径，这种规律仅适用于不含二硫键的蛋白。对于含有二硫键的目的蛋白，取 决于在折叠过程中二硫键的正确形成以及表达速率这两方面的因素【19]。 重组大肠杆菌中，包涵体的成分包括膜蛋白、一些磷脂和核酸、协同沉淀的 一些非特异的蛋白质，还有就是过量表达所产生的的外源目的蛋白，通常会占到 百分之五十以上。包涵体具有抗酶降解的能力，因为在折叠过程中，暴露在外面 第一章绪论 的肽链的疏水基团容易受到蛋白酶的识别攻击，然而在包涵体的表面，疏水性明 显减弱，也就减弱了蛋白酶的攻击‘2‘n。 1(3(2减少包涵体形成的策略 改变重组工程菌的生长温度，在低温条件下生长，工程菌生长缓慢，无活性 的聚集体的形成速率得以降低，随之降低的还有疏水相互作用和溶氧水平，从而 降低包涵体的形成，温度是一种常用的减少包涵体形成的因素【2Il。 在培养过程中，为重组工程菌供给丰富的培养基，改善工程 菌的培养条件， 通过提供足够的供氧，以及适宜工程菌生长的PH环境，从而减少包涵体的形成。 在诱导的时候，添加低浓度的诱导剂，通过减少重组蛋白的表达量，使得更 多的蛋白以正确的结构形成，得到减少包涵体的形成的效果【221。 1(3(3菌体的裂解以及包涵体的预处理 包含体中，主体成分是目的蛋白，除此之外还含有一些菌体合成的核酸，脂 类，杂蛋白，脂多糖等影响后续包涵体复性的成分【231，为了减少后续对于复性的 影响，先洗涤包涵体，制成精制包涵体，以减少杂质[241。 细胞破碎的方法很多，每种方法都有每种方法的优点和特 性。常用方法有: 反复冻融法，通常反复冻融法和别的破碲方法配合使用会得到更好的破碎效果， 在进行机械破碎之前，在(20。C条件下的冰箱中，反复冻融菌体若干次;超声波 匀浆破碎法，细胞裂解可以通过查看溶液的粘度，来判断裂解是否完全。 1(4蛋白质复性的方法 就工业化而言，要求蛋白质体外复性过程高效，快速，成本低 24】。目前尚没 有出现一种对所有的蛋白质均通用的的方法，仍旧是一个比较复杂的问题。理想 的折叠通常具备一下的几个特点[25]: 1 复性过程时间较短，效率高; 2 活性蛋白的回收率比较高; 3 复性的方法能够放大从而工业化; 4 复性完成的产物能够比较容易的与折叠错误的蛋白质分离; 5 复性完成以后，得到的蛋白浓度比较高。 9 北京化l:火学硕士学位论文 复性的选择方法比较多，但是针对具体的蛋白，通过实验优化出最佳的条件 和方法[261，常用的复性方法如表1。4所示。 表1，4复性方法 7I'ablel―4Renaturationmethod 传统复性方法 柱复性方法 稀释复性法 凝胶过滤色谱复性 透析复性法 离子交换色谱复性 亲和色谱复性 疏水相互作用复性 1(4。1稀释复性法 目前，稀释复性作为一种最简单，也最常用的复性方法，得到普遍的应用， 直接采用复性缓冲液稀释变性的蛋白【2刀。稀释复性的优点在 于，操作简单，容易 上手，也便于进行检测;而缺点表现在，复性的过程中，蛋白溶液的体积得到了 显著的提高，如果用之进行工业化的生产，那么所需要的容器就会增大，添加的 缓冲液也会增多，一方面增加了成本的投入，另一方给后期的浓缩以及分离纯化 造成了困难【281。 根据步骤的不同划分为:一步稀释法、分步稀释法[29]。一步稀释法即直接在 复性缓冲液中添加变性液，溶液环境中的变性剂浓度经过剧烈的变化;分步稀释 复性法，采用一到两步把变性剂的浓度降低，直到变性剂浓度满足实验的要求， 这个过程中，变性剂浓度的改变经历的是一个连续的过程[301。 根据混合方式 变性蛋白和复性液 的不同划分为『F向稀释、反向稀释。所 谓正向，也就是将变性的蛋白加入到复性缓冲液中，通常，复性缓冲液量比较大; 所谓反向稀释，也即变性蛋白不动，将复性缓冲液加入之中【3l】。 1(4(2透析复性 透析复性通常适用于折叠速度比较快，并且折叠中l、白J体不易发生聚集的蛋白 质，与稀释复性的要求一致。在透析复性中，变性剂分子由于比较小，从而通过 半透膜实现与蛋白质的分离，蛋白质溶液在发生复性前后体积变化不大，复性效 10 第一章绪论 率正比于透析袋两侧的渗透压，整体上来说消耗时间较长。在这个过程中，对于 21。 折叠比较慢的蛋白质，由于长时间暴漏在中浓度的变性剂中，可能会增加聚沉[3 1(4(2(1一步透析法 随着透析袋内部变性剂不断的透析到外部，变性的蛋白不始发生折叠形成 天然的空问结构或者是中|、白J体，在此过程中发生错误折叠或者聚集的现象也在不 断的发生，尤其当复性的速率进行的比较慢的时候，发生聚集的现象会更高的出 现，这是因为在中低浓度的变性剂环境中，错误折叠的蛋白或者折叠中间体很难 发生溶解。透析复性的过程中，折叠中间体会长时问的面对中浓度的变性环境， 对于一些中间体表现出可溶性效果的蛋白质，具有良好的效果。在此过程中，虽 然变性剂的浓度在不断的发生变化，但是蛋白的浓度基本上处于不变的情况，也 3l。 就是说透析复性也与变性剂当中的其实蛋白浓度有着重要的关系【3 1(4(2(2多步透析法 与一步透析法所不同的是，在每一个阶段，变性剂的浓度均 与外界环境中的 蛋白浓度建立了一个平衡。如果复性的速率比错误折叠或者聚集的速度慢，此种 方法将不适合于包涵体的复性。此方法的优点是，在中等浓度变性剂中，『F确折 叠途径会发生返回的现象，尤其是含有二硫键的情况下。每个不同的变性剂浓度， 变性的蛋白均可能会形成聚集或者错误的折叠，但是变性剂处于中等浓度的时 候，蛋白质可以调整其结构以形成『F确的结构，并且使『F确的二硫键得以形成lj引。 另外对于含有几个蛋白分子结构的域的情况，并且这几种结构域的稳定性或 者折叠均可以是不同的，此种多部透析方法比较适用，即使是在高浓度的变性剂 条件下，平衡也会向着达到稳定结构的方向进行折叠，并且与低 浓度相比，更有 利于这