酶联免疫吸附法检测丙型肝炎病毒抗体出现假阳性的原因分析和解决方法

    ［摘要］ 目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）抗体检测酶联免疫吸附法出现假阳性的原因分析和解决方法。方法 对酶联免疫吸附法测定HCV抗体弱阳性的16份标本用核酸扩增荧光基因分析法检测HVC-RNA进行确证试验，确定其假阳性率，寻找引起假阳性的原因及其解决方法。结果 酶联免疫吸附法测HCV抗体阳性的标本再用核酸扩增荧光基因分析法检测HCV-RNA，有75％的阳性率，其中假阳性的有25％。结论 酶联免疫吸附试验检测HCV抗体由于有许多影响因素可导致结果假阳性，对怀疑假阳性的标本应检测丙型肝炎病毒RNA来确诊。  ［关键词］ 酶联免疫吸附法；核酸扩增荧光基因分析法；丙型肝炎病毒抗体；假阳性   目前临床上广泛应用的丙型肝炎病毒（HCV）感染诊断方法主要是检测患者血清HCV抗体，酶联免疫吸附法是临床进行HCV诊断的主要方法之一［1］，因其灵敏度高、特异性强，在临床上得到了广泛的应用，但试验中有许多因素如不注意可能导致假阳性的结果。现对我院2004年5月～2006年4月检测的抗HCV抗体结果中16份弱阳性标本进行如下分析。  1 材料与方法  1.1 标本来源 2004年5月～2006年4月我院门诊和住院患者检测HCV抗体的标本。  1.2 仪器与试剂 仪器：DA-7600核酸扩增实时荧光基因分析仪为达安基因股份有限公司产品；BIONAD MODEL1575自动洗板机；普朗DNM-9602酶标仪。试剂： HCV-RNA测定试剂为达安基因股份有限公司产品；HCV抗体酶联免疫试剂盒。  1.3 方法 对酶联免疫吸附法检测HCV抗体弱阳性的标本中3>S/CO>1的16份标本，再用核酸扩增荧光基因分析法检测HCV-RNA。  2 结果  两种检测方法结果见表1。  表1 两种检测方法结果比较　略   由表1可知，酶联免疫吸附法HCV抗体阳性的标本再用核酸扩增荧光基因分析法检测HCV-RNA，有75％的阳性率，其中假阳性的有25％。导致酶联免疫吸附法假阳性的原因可能有如下几点。  2.1 标本的处理 标本分离不好即进行加样，血清与纤维蛋白原分离不完全，使纤维蛋白原吸附于孔壁，难以清洗彻底；标本重度溶血；相邻的标本出现阳性污染。  2.2 加样 加样时间过长造成加样后放入恒温箱前等待时间过长；标本加完后加酶试剂时溅出孔外；加样后孔壁上贴有微小血块。  2.3 温育 温育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发吸附于孔壁，难以彻底清洗；温育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。  2.4 洗板 （1）手工洗板时，孔与孔之间液体交叉。（2）自动洗板机洗板时，洗板针堵塞，抽吸不完全；洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板次数少。  2.5 洗液 混合使用不同厂家出品的洗液。  2.6 读板 读板时板底不清洁。  2.7 显色 使用同一厂家生产的不同产品的显色剂；加显色剂时溅出孔外造成液体回流。16份阳性标本中有4份是15岁以下的男性儿童，且不具备明显危险因素，可能是血清中存在某种干扰因素，有待于今后找出原因。[!--empirenews.page--]  3 解决方法  （1）标本若为凝固血，最好将标本先自然存放1 h，再用3000 r/min离心15 min；标本若为抗凝血，采血后必须立即颠倒采血管5次以上，放置一段时间后，3000 r/min离心15 min。（2）加样后加贴封片及时放入恒温箱。（3）加酶试剂时不要滴出孔外，如有用吸水纸轻拭吸干。（4）严格按说明步骤控制操作时间。但适当延长反应时间，可提高阳性标本特别是弱阳性的检出率，对阴性标本无明显影响［2］。（5）保证洗板针畅通，洗液注满各孔，洗完后在吸水纸上轻拍吸干。（6）显色剂不要混用；不要用过期的显色剂；加显色剂时不外流。（7）不同批号的试剂不要混用，试剂在用前应在室温中放置30 min。（8）每天应做质控、阳性对照、阴性对照。  4 讨论  酶联免疫吸附方法其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。影响酶联免疫实验的因素较多，诸如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控制、显色反应时间的控制、洗涤反应板的方式等发生的一系列问均有可能对试验结果产生很大的影响，只有避免了这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。在工作中应严格按照操作步骤进行操作，认真对待每一份标本，对可疑的标本要进行复查，不能确诊的要做HCV-RNA测定，以确保检验质量，杜绝假阳性结果。